表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Immunology and Infection

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Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

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Abstract

転写因子としてのFoxp3を発現する調節性T(T REG)細胞、CD4 + T細胞のサブセットです。 T reg細胞は、免疫応答を調節することによって免疫寛容と恒常性の維持に重要な役割を果たしています。 T reg細胞の主な役割は、エフェクターT(T effの)細胞の増殖ならびにIFN-γ、TNF-α、およびIL-2などのサイトカインの産生を抑制することです。 T effは 、細胞の機能を阻害するT reg細胞の能力は、永続的な病原体感染および癌の発生の間に増強されることが実証されています。休止または炎症条件下でT reg細胞の機能を明確にするために、マウスまたはヒトT reg細胞を使用て、種々のインビトロ抑制アッセイが考案されています。本研究の主な目的は、休止および活性化T regの間の表現型および抑制機能の違いを比較するための方法を開発することです細胞。活性化T reg細胞を単離するために、マウスを、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)クローン13(CL13)、LCMVの慢性株に感染させました。 LCMV CL13感染マウスの脾臓から単離されたT reg細胞は、ナイーブマウスから単離されたT reg細胞を休止期と比較して活性化された表現型および強化された抑制活性の両方を示しました。ここでは、T reg細胞を休止期から活性化したT reg細胞を区別するためのex vivoでの表現型分析のための基本的なプロトコルを記述します。さらに、我々は、完全に活性化したT reg細胞の抑制活性の測定のためのプロトコルを説明します。

Introduction

調節性T(TのREG)細胞は、それらの発生と機能1用の転写因子としてフォークヘッドボックスP3(Foxp3の)を発現します。加えて、T reg細胞は、CD25 2、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)3、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体4、および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)5などの様々な他の分子を発現しますそれらの表面または細胞内領域に。このような強化された抑制機能を表示するウイルス6,7、細菌8,9、および寄生虫10-12、または癌発生13,14の過程で、T reg細胞が活性化された細胞に分化になる、などの病原体の様々な種類の慢性感染の間エフェクターCD4 +及びCD8 + T細胞を標的とします。論文の数は拡大し、活性化したT reg細胞が損なわCD8 + T細胞RESPONSに寄与することが示唆されています友人レトロウイルス(FV)感染15-17の間に電子。 FV誘発性T reg細胞は、IFN-γまたはグランザイムBの発現およびCD8 + T細胞の細胞傷害反応性15-17を阻害します 。また、単純ヘルペスウイルス感染モデルでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞および免疫病原性CD4 + T細胞の18-20の浸潤によって深刻な組織損傷の拡大が生じたCD4 + CD25 + T reg細胞の枯渇が報告されました。

リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV CL13)のクローン13株を用いて慢性的に感染したマウス21〜24は、広く、慢性ウイルス感染の間にエフェクターT細胞(T effの)およびT reg細胞の表現型および機能を特徴づけるために使用されています。永続LCMV感染の間に、ウイルス特異的T effの細胞が次第に彼らのエフェクター機能を失い、疲れT(TのEXH)細胞になります。一方、Treg細胞は、ウイルス特異的T細胞応答25を抑制する能力を強化します。 T effは細胞の機能容量の低下は、T effは細胞上の阻害性受容体のアップレギュレーションは、抗原提示細胞の変化した機能、免疫調節性サイトカインの産生、および頻度の増加、またはT REGの強化機能など、いくつかの要因によって説明することができます細胞26。 T細胞の抑制に関与する因子の中でも、プログラムされた細胞死は、タンパク質1(PD-1)発現のT EXH細胞およびT reg細胞が広く、抗原の持続性および抑制性環境の特徴として考えられてきました。最近では、T reg細胞のPD-1経路及びアブレーションの遮断が強化されたT細胞の機能をもたらし、LCMV慢性感染27の間のウイルス負荷を減少させたことが報告されました。また、T reg細胞は、LCMV 23,25によるマウスの慢性感染の間に活性化されています25強化されます。 PD-1は、高T reg細胞ならびにT EXH細胞上に発現し、T reg細胞によって発現されるPD-1のレベルは、T細胞増殖25を阻害するそれら抑制機能の強さと相関します。

ここでは、LCMV CL13とナイーブマウスから単離された休止T reg細胞に感染したマウスから単離した活性化T reg細胞の特性を比較する方法を記載しています。さらに、我々は活性化T reg細胞を分離し、それらのex vivoでの表現型を調べるだけでなく、in vitroでのそれらの抑制活性を測定するための一連の処理を説明します。

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Protocol

本研究では、マウスは、延世大学の延世大学実験動物研究センターの特定病原体フリーの施設で維持しました。全ての動物実験は、延世大学で延世大学実験動物研究センターの国際動物実験委員会によって承認されたプロトコルを使用して、韓国の食品医薬品局(FDA)のガイドラインに従って行いました。

ソリューションの調製

  1. 2%RPMI培地は、RPMIで1%まで2%ペニシリン - ストレプトマイシンをウシ胎児血清(FBS)を希釈することにより調製します
  2. 完全RPMI培地を準備します。 RPMIへのメディアは、FBSの10%、ペニシリン - ストレプトマイシン1%、L-グルタミン1%、及び50μMの2-メルカプトエタノールを追加します。
  3. 蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを準備します。 FBSの2%そうするために、補助リン酸緩衝生理食塩水(PBS)。
  4. T細胞の分離バッファを準備します。これを行うには、FBSの2%および2mMのethylenediaminetetraaでPBSを補いますクジラの酸。

脾臓リンパ球の2の単離

  1. 前述したように19ナイーブまたはLCMV CL13-感染マウスから脾臓を取り出して、2%RPMI培地の10ミリリットルを含む60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿の中に置いて。
    注:本研究の実験では、5〜6週齢のC57B1L / 6J雌マウスの尾静脈から静脈注射を介してLCMV CL13の2×10 6プラーク形成単位(PFU)を受けました。感染後(16 Dのパイ)25日16時マウスを生け贄に捧げます。同じ日にあったGE-マッチしたナイーブマウスを分析します。
  2. 50ミリリットルチューブにセルストレーナーを配置し、2%RPMI培地2mlでそれをすすいでください。 70μmのセルストレーナーに脾臓を置き、シリンジのプランジャーを使用して挽きます。 2%RPMI培地2mlで細胞ストレーナーを洗浄し、50 mlチューブから取り外します。
  3. 4℃で5分間、300×gで2%RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を捨て、再懸濁ACK溶解緩衝液1ml中の細胞ペレット。 5分間室温(RT)でサンプルをインキュベートします。
    注:上記に示したACK溶解緩衝液の容量は、1脾臓のためです。プールされた脾臓サンプルに対して相応のボリュームをスケールアップ。
  4. 4℃で10分間300×gで2%RPMI培地と遠心分離機でチューブを埋めます。上清を廃棄し、完全RPMI培地中1×10 7細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁します。
    注:トリパンブルーで生細胞計数、染色細胞の場合と血球計数器を用いて染色していないだけで生きた細胞を数えます。

脾臓従来のT(TのCONV)細胞およびT reg細胞の3表現型

注:T reg細胞の単離の前に、様々な抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、ナイーブまたは感染マウスから単離した脾臓リンパ球の表現型を調べます。

  1. 50μlの細胞を移します新しいU底96ウェルプレートの各ウェルへの全脾臓リンパ球のうち、(5×10 5細胞)とは、ウェル当たりのFACS緩衝液150μlを添加します。 4°Cで2分間300×gで遠心分離します。
  2. 上清を捨てます。細胞ペレットを攪拌し、ウェルあたりFACS緩衝液200μlを追加します。 4°C(2回)で2分間300×gで遠心分離します。
  3. 以下の抗体および試薬でウェルあたりFACS緩衝液50μlに染色細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを準備します。抗CD4バイオレット染料、抗CD25緑色色素、抗PD-1紫色色素、抗CD8 PerCPを-のCy5.5色素及び細胞生存能力検出試薬、近赤外(IR)、蛍光反応性染料。
    注:さらに、活性化T reg細胞の表現型を分析するために、抗CD103 23,25は、細胞表面マーカーの染色のために添加することができます。
  4. ウェル当たり抗体カクテル50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。で細胞を2回洗浄4°Cで2分間300×gで遠心分離することによってFACSバッファー。
  5. 最後の洗浄工程の後、上清をデカントし、製造業者のプロトコルに従って調製した固定用緩衝液100μlを用いて4℃で暗所で20分間、細胞を固定。
  6. 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって(製造業者のプロトコルに従って調製した)透過性の洗浄緩衝液で細胞を2回洗浄します。
  7. 細胞内のFoxp3染色用抗体溶液を準備し、そして抗Foxp3の抗体溶液50μlで細胞ペレットを再懸濁します。
    注:さらに、TのCONVとT reg細胞の表現型を分析するために、抗CTLAは、この段階で添加することができます。
  8. 4℃の暗所で20分間インキュベートし、ステップ3.6を繰り返します。最後の洗浄工程の後、FACS緩衝液200μl中に細胞ペレットを再懸濁し、25フローサイトメーターによる細胞の表現型を調べます。
  9. ゲート生細胞populaる。 CD4 +またはCD8 + T細胞のう ​​ち、PD-1 +細胞- LCMV CL13感染中のT CONV細胞の表現型を分析するために、Foxp3の頻度を調べます。
    注:実験の結果に基づいて、のFoxp3の割合は- PD-1 + CD4 +およびLCMV CL13 16次元πにおけるCD8 + T細胞集団の両方で50%以上です。
    1. T reg細胞の頻度と表現型を分析するために、CD4 + T細胞の中でのFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の頻度を調べます。
      注:実験の結果に基づいて、のFoxp3 +またはのFoxp3 + PD-1 +細胞の割合は、それぞれ、CD4 + T細胞集団における20%以上です。

CD4 + CD25 + T reg細胞の単離4

注:すべての試薬の体積は、以下に示すためのものです1×10 7総脾臓細胞の細胞数を開始します。

  1. ナイーブおよびLCMV慢性的に感染したマウスを用いて、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離緩衝液10mlを加えることによって細胞を洗浄します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。
  2. 磁気細胞分離システムを使用して、CD4 + T細胞濃縮のために、ビオチン-抗体カクテルを10μl加え、よく混ぜます。 4℃で10分間インキュベートします。
  3. 緩衝液30μl、非CD4 + T細胞の標識化のための抗ビオチンマイクロビーズを20μlおよびCD25 +細胞の蛍光標識のためのCD25-PE抗体の10μlのを追加します。よく混ぜ、暗所で15分間インキュベートします。
  4. バッファの2ミリリットルを追加し、細胞破片を除去し、新しい50ミリリットルチューブに40μmのセルストレーナーを介して細胞を渡します。 4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1.25×10 8細胞の密度で500μlの緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。
  5. カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離緩衝液を2mlを加えることにより、カラムを洗浄します。完全に上清を捨て、バッファー90μlの中で孤立したCD4 + T細胞を再懸濁します。
  6. CD25 +細胞の磁気標識のために、抗PEマイクロビーズの10μlを添加、よく混ぜ、4℃の暗所で15分間インキュベートします。
  7. 緩衝液2 mlを加え、4℃で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞を洗浄します。完全に上清を捨て、最大で1×10 8個の細胞の密度で緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。
  8. CD4 + CD25 + T reg細胞を豊かにするために、正の選択のためのカラム上に細胞を適用し、コラムを洗います緩衝液を2mlを添加することにより、N。洗浄を3回繰り返します。
  9. 列が最後の洗浄工程の後に空になると、カラムに緩衝液1mlを追加し、磁気標識CD4 + CD25 +プランジャーを用いて細胞洗い流します。
  10. 反復は、単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞の純度を高めるために、4.8から4.9までステップ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄します。上清を廃棄し、完全RPMI培地中2×10 6細胞/ mlの濃度で単離されたCD4 + CD25 + T reg細胞を再懸濁します。
  11. 孤立CD4 + CD25 + T reg細胞の純度を確認するには、合計孤立CD4 + CD25 + T reg細胞からの2×10 5細胞を使用しています。抗CD4 FITC試薬近赤外線蛍光反応性染料を検出する細胞の生存を含有するFACS緩衝液50μlで細胞を染色します。
    注:CD25はすでに単離の間にPEで標識しました。
  12. 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μlに細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって純度を確認してください。
  13. ゲート生細胞集団。 T reg細胞の純度を分析するために、CD4 + CD25 +細胞の割合を確認します。
    注:実験の結果に基づいて、精製された細胞間のCD4 + CD25 +細胞の割合は、約80%以上です。

CD8 + T細胞およびCD8 + T細胞の標識の5単離

注:以下に示す全ての試薬 ​​の体積は、1×10 7総脾臓細胞の出発細胞数のためのものです。

  1. ナイーブマウスを使用して、セクション2に記載されているように細胞を準備します。 T細胞単離バフを10mlを添加することによって細胞を洗浄えー。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、バッファの40μlの細胞ペレットを再懸濁します。
  2. 磁気細胞分離システムを用いてCD8 + T細胞の単離のために、非CD8 + T細胞の標識のためのビオチン抗体カクテルを10μl添加し、よく混合します。 4℃で5分間インキュベートします。
  3. 緩衝液30μlと抗ビオチンマイクロビーズの20μlを添加します。よく混合し、4℃で10分間インキュベートします。
  4. カラム上に細胞を適用し、カラムを通過する非標識細胞を収集します。バッファの3回を2ミリリットルを追加することにより、カラムを洗浄。
  5. 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を捨て、2mlの緩衝液で単離したCD8 + T細胞を再懸濁します。
  6. 単離された細胞の純度を確認するには、FACS緩衝液中の抗体溶液50μlを準備します。単離したCD8 + Tセルのうち、2×10 5細胞を再懸濁し抗体溶液の50μl中のls。
    注:抗CD8 FITC追加し、抗体溶液を調製し、細胞生存率の検出試薬(近IR蛍光反応性染料)FACS緩衝液にします。
  7. 4℃の暗所で20分間インキュベートします。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによってFACS緩衝液で細胞を洗浄。洗浄後、FACS緩衝液100μl中で細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによって細胞の純度を確認してください。
  8. ゲート生細胞集団。 CD8 + T細胞の純度を確認するために、CD8 + T細胞の割合を確認します。
    注:実験の結果に基づいて、精製された細胞のう ​​ちCD8 +細胞のパーセンテージは、約90%以上です。
  9. 単離したCD8 + T細胞にPBSを追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。上清を捨てます。 PBS中の1×10 7細胞/ mlの濃度で単離されたCD8 + T細胞を再懸濁します。
  10. CD8 + TのCEを標識するためにインビトロ抑制アッセイのためのLLSは、室温で5μMの濃度を得るために、PBSで細胞増殖追跡バイオレット染料を希釈します。
    注:この研究において使用される細胞増殖追跡バイオレット染料のおおよその励起および発光ピークは、それぞれ、405および450nmです。
  11. 15mlチューブに細胞増殖追跡バイオレット染料(5μM)と細胞懸濁液(CD8 + T細胞1×10 7細胞/ ml)をウェル等量混合し、37℃で20分間インキュベートします。チューブを10分ごとにボルテックス。
  12. 冷たい完全RPMI培地でチューブを埋めるし、RTで10分間チューブを残します。 RTで10分間、300×gで遠心分離します。完全に上清を廃棄し、予め温めた完全RPMI培地で2×10 6細胞/ mlの濃度で細胞を再懸濁します。 RTで15分間細胞をインキュベートします。

6. CD4 + CD25 + Tを用いたin vitroの抑制アッセイを設定します<サブ> REGおよびCD8 + T細胞

  1. 抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズを製造するために、チューブの15ミリリットル(2.5マイクロリットル/ 1×10 5細胞)に磁気ビーズの適切な量を転送します。等量のPBSを加え、混合します。 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって洗浄し、上清を捨てます。 (50μL/ウェル)完全培地中の磁気ビーズを希釈します。
  2. CD4 + CD25 + T reg細胞のアリコート50μlを、U底96ウェルプレートのウェルあたり(1×10 5細胞/ウェル)。レスポンダーT(TのRESP)などのCD8 + T細胞細胞ウェルあたり(1×10 5細胞/ウェル)を50μLを加えます。ウェルあたりに希釈した抗CD3 / CD28被覆ビーズの50μlを添加。
    注:このステップは、ラベルには、次のようにコントロールウェルを設定する:「未刺激のCD8 + T細胞のみ「ノー抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで。 「CD8 + T細胞のみ「抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズで、「。」のみT reg細胞、抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズでT reg細胞は、Tの異なる比でのT RESP細胞を完全培地と共培養することによって希釈することができますRESP細胞 :T reg細胞(1:0.25〜1:1)。
  3. 総量200μlに、すべてのウェルに50μlのか、メディアの適切な量を追加します。ホイルでプレートをカバーし、72時間、37℃のCO 2インキュベーターでインキュベートします。

CD8 + T細胞増殖およびサイトカイン産生の7分析CD8 + T細胞から

  1. サイトカイン産生の分析のために、培養の3日後、ウェル別のプレートに各上清を分離し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行います。
    注:上清は-70℃でアリコートに分けて保存することができます。この実験では、抗マウスIFN-γ抗体でコーティングされたプレートは、IFN-γ産生協定を検出しました製造業者のプロトコールにる。単一細胞レベルでのCD8 + T細胞増殖のIFN-γ産生を決定するために、細胞内サイトカイン染色を行うことができます。
  2. 各ウェルから上清を分離した後、4°C(3回)で2分間、300×gでFACS緩衝液および遠心分離で細胞を含むプレートを洗浄します。
  3. 洗浄した後、上清を捨てます。増殖したCD8 + T細胞の染色のための抗体カクテルの50μlの細胞ペレットを再懸濁します。 4℃の暗所で20分間インキュベートします。
    注:FACS緩衝液中に、抗CD4 FITC、抗CD8 PerCPを-のCy5.5、及び細胞生存能力検出試薬(近IR蛍光反応性染料)を追加し、抗体カクテルを調製しました。
    注:そのようなCD44又はCD69のような種々のマーカーに対する抗体は、CD8 + T細胞の活性化を確認するために、他の抗体と組み合わせることができます。 CD8 + T細胞は、すでに細胞増殖トラッキングVで標識されていることを思い出してくださいステップ5.10でiolet染料。
  4. 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。最後の洗浄工程の後、上清を捨て、そして固定緩衝液100μlで4℃で暗所で20分間、細胞を固定。
  5. 4℃で2分間、300×gで遠心分離することによって二回洗浄します。 FACSバッファー200μlで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによる細胞増殖追跡バイオレット色素で標識されたCD8 + T細胞の増殖を測定します。
    1. ゲート生細胞のう ​​ちCD8 + T細胞集団。以下の式に従って細胞増殖追跡バイオレット染料及びCD8 + T細胞の希釈の希釈に応じて分割し、分割されていない細胞の割合を測定します。阻害%= [(T reg細胞の非存在下で増殖したCD8 + T細胞の% - T reg細胞の存在下で増殖したCD8 + T細胞の%)/(%で増殖したCD8 + T細胞のT reg細胞の非存在下)]をX 100はまた、ソフトウェア25フローサイトメトリーを使用してデータを分析します。

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Representative Results

私たちは、静脈内にLCMV CL13の2×10 6 PFUでそれらを注入することにより、持続的なウイルス感染マウスを作製しました。 T reg細胞および慢性ウイルス感染の間にT CONV細胞における表現型の変化を調べるために、ナイーブ、感染マウスから得られた脾臓リンパ球を、種々の抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析しました。 CD4 + Tのコンバージョン図1A、上段パネル)とのFoxp3 - - CD8 + Tのコンバージョン図1B、上パネル)セル16 DのPIでは、PD-1は、Foxp3の両方でアップレギュレートされました。 Foxp3 + CD4 + T reg細胞の頻度は、未処理マウス( 図1A)よりもLCMV CL13感染マウスに2倍高かったです。具体的には、のFoxp3 + CD4 + T reg細胞の大部分は、高レベルの発現、活性化表現型を示しPD-1この時点( 図1A)において。

インビトロ抑制アッセイのために、CD8 + TのCONV細胞およびCD4 + CD25 + T reg細胞のかなりの数が必要でした。 1×10 7細胞増殖の追跡バイオレット色素で標識されたCD8 + T細胞を得るために、ナイーブマウスの2つの脾臓から脾細胞をプールしました。それぞれCD4 + CD25 + T reg細胞、ナイーブおよびLCMV CL13感染マウスから少なくとも3脾臓、2×10 6または3×10 6を得るために、プールしました。 TのRESP細胞のよう CD8 + T細胞は、他の免疫細胞( 図2A)との有意な汚染なしに正常に分離しました。 T reg細胞はまた、80%以上の純度( 図2B)を有するCD25 + CD4 + T細胞の支配的な集団と、単離することができました。

ナイーブおよび慢性T reg細胞の抑制機能を比較するために、孤立のTregおよびT RESP細胞を、37℃で3日間、抗CD3 / CD28でコーティングしたビーズによる刺激下で一緒にインキュベートしました。 CD8 + T RESP細胞増殖の%阻害は、T reg細胞DESE依存的( 図3A)に増加しました。 CD8 + TのRESP細胞が1の割合で慢性T reg細胞と共培養したときに1、CD8 + TのRESP細胞の増殖( 図3B)を有意に阻害しました。 CD8 + TのRESP細胞が慢性的に感染したマウス由来の活性化T reg細胞ではなくT regの中に未処理マウスからのT reg細胞、休止と共培養したとき CD8 + T RESP細胞によるIFN-γ産生も有意に抑制しました図3C)。

図1
1:16 Dπ(A)、PD-1またはFoxp3の上のCD25の発現でナイーブマウスまたはLCMV CL13感染マウスの脾臓における CD4 + およびCD8 + T細胞 の表現型 - CD4 + TのコンバージョンとのFoxp3 + CD4 + T reg細胞。 (B)のFoxp3のPD-1またはCD25の発現- CD8 + TのCONV細胞 。脾臓リンパ球は、CD4、CD8、CD25、PD-1とのFoxp3に対する抗体で染色しました。データは、3つの独立した実験の代表です。パネルAは、基準として25から変更されている。 クリックしてください。ここで、この図の拡大版を表示します。

図2
図2: ナイーブまたはLCMV CL13感染マウスから単離した ナイーブマウスおよびT reg 細胞 から離された T RESP 細胞 と純度単離後のCD8 + T細胞の(A)の割合分離後のCD25を発現するCD4 + T reg細胞の(B)の割合。 (B)の各象限は、CD4及びCD25の発現レベルによって測定しました。データは、3つの独立した実験の代表例である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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3:CD8 + T細胞応答 活性化したT reg 細胞 の効果 T reg細胞の用量依存的な様式でT reg細胞と共培養したCD8 + T細胞の(A)%阻害 (B)1におけるT reg細胞と共培養したCD8 + T細胞の増殖:1の比。 T reg細胞の用量依存的な様式でT reg細胞と共培養したCD8 + T細胞(C)IFN-γ産生。 CD8 + T細胞の増殖は、増殖したCD8 + T細胞およびIFN-γの分泌細胞増殖追跡バイオレット染料の希釈により測定されたELISAにより評価しました。細胞増殖追跡バイオレット色素で標識されたCD8 + T細胞は、Tの存在下または非存在下で3日間、抗CD3 / CD28被覆ビーズで刺激しました。 reg細胞なしで共培養したCD8 + T細胞の増殖率を示しています。ヒストグラム充填灰色のピークは、T reg細胞なしで共培養したCD8 + T細胞の増殖を示します。各グループは三重に設計されました。バーは+ SEMを意味表します。この図は、リファレンスとして25から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

T reg細胞の少数が、マウスおよびヒトに存在するが、免疫応答を調節し、免疫寛容の維持において重要な役割を果たしているように、それらの機能を理解することが重要です。 T reg細胞の数と抑制機能は、慢性ウイルス感染15-20だけでなく、癌の進行13,14の間に増加します。これはおそらく、継続的な抗原刺激によるものです。抗原の永続性と病気の開発中のT reg細胞の機能を評価するために、それらの抑制活性を測定する必要があります。

ここでは、T reg細胞のex vivoでの表現型を分析し、CD8 + T細胞およびT reg細胞のin vitroでの共培養系を用いて、それらの抑制活性を測定するためのプロトコルを説明します。現在のプロトコルでの重要なステップは、T reg細胞の分析および分離されています。ライブと新たに単離したT インビトロで明確な抑制活性を示します。我々はまた、慢性ウイルス感染時にTのCONVとT reg細胞の表現型を調べました。 TのCONV細胞は、 すなわち 、のFoxp3 - CD4 +およびCD8 + T細胞は、慢性ウイルス感染( 図1)後の細胞活性の減少を示しました。 PD-1発現は、両方のT CONV細胞集団においてアップレギュレートされました。 T reg細胞数およびアップレギュレーションPD-1発現の増加は、慢性ウイルス感染中の免疫応答の特徴です。さらに、TIM-3およびCTLA-4のような他の抑制性受容体のための抗体は合唱のウイルス感染後にFACSによりT細胞の表現型を調べるために、PD-1と組み合わせて使用​​することができます。

抑制活性を調査するために、TのRESP細胞およびT reg細胞は、T REG 1.共培養1の比で共培養しましたナイーブマウスからのT reg細胞と比較した場合に慢性的に感染したマウスからの細胞は、有意にCD8 + T細胞増殖およびIFN-γの分泌を低下させました。これは、T reg細胞と共培養したCD8 + T細胞の増殖およびサイトカイン産生は、逆T reg細胞の抑制機能に関連していることを意味します。このプロトコルは、T reg細胞の単離のための磁気細胞分離システムを使用することを推奨していますが、非T reg細胞の混入を排除することはできません。 28-30のFoxp3-GFPレポーターマウスから得られたT reg細胞は、CD25は、多くの場合、活性化CD4 + T コンバージョンだけでなく、T reg細胞に過剰発現されるように正確に、磁気細胞分離システムよりもT reg細胞の機能を調べるためのより良い候補です。

T reg細胞の抑制機能は、種々のインビトロ評価されました抑制アッセイ16,28,31-34。 インビトロ抑制アッセイの利点は、TのRESP細胞、T reg細胞と共培養されるので、それは、CD8 + T細胞応答の阻害のT reg細胞の直接的な効果を評価することです。 CD8 + T細胞に加え、CD25 - CD4 + T細胞ではなくTのRESPセル 25を使用することができます。このような樹状細胞またはナチュラルキラー細胞などの免疫細胞上のTの影響REGまたはT CONV細胞実験条件を変えることによって評価することができます。

例えばCD103 35、LAG-336のような分子は、37主要な繰返し糖タンパク質、CD43 38は 、のCD11a 38、またはキラー細胞レクチン様受容体サブファミリーGメンバー1 38は、特定の疾患における活性化T reg細胞のマーカーとして使用されてきました。このプロトコルでは、ANとしてPD-1を使用し慢性ウイルス感染の間に活性化T reg細胞を同定するためのインジケーター。このプロトコルは、特定の条件下でT reg細胞の多面的分析(表現型および機能)のために使用することができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

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