Assay חינם-נייד באמצעות

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שאלת יסוד בביולוגיה של התא הוא כיצד גדלים התא אברון מוסדרים. זה כבר זמן רב מוכר שגודל הגרעין מאזניים בדרך כלל עם הגודל של התא, בעיקר במהלך embryogenesis כאשר ירידות דרמטיות בשני התאים וגדלים גרעיניים להתרחש. מנגנוני ויסות גודל גרעין הם ידועים ברובם עשויים להיות רלוונטיים לסרטן שבו גודל גרעין שינה הוא פרמטר דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים מפתח. בשנת vivo גישות לזיהוי רגולטורי גודל גרעין מסובכות על ידי המהות והמורכבת של פונקציה גרעינית. הגישה חוץ הגופייה המתוארת כאן כדי ללמוד שליטת גודל גרעין מנצלת את הירידות הרגילות בגודל גרעיני המתרחשות במהלך התפתחות laevis Xenopus. ראשית, גרעינים הם התאספו X. laevis לחלץ ביצה. לאחר מכן, גרעינים אלה מבודדים resuspended בציטופלסמה מעובר בשלב מאוחר. אחרי 30 - תקופת דגירה 90 דקות, שטח פנים גרעינייםפוחת ב -20 - 60%, מתן assay שימושי לזהות רכיבים ציטופלסמית נוכחיים בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל גרעין התפתחותית. יתרון עיקרי של גישה זו הוא המתקן היחסי שבה תמציות ביצת עובר ניתן להשפיע מבחינה ביוכימית, המאפשרות זיהוי של חלבונים ופעילויות רומן מווסתים גודל גרעין. כמו בכל בגישה חוץ גופית, אימות של תוצאות מערכת in vivo זה דבר חשוב, microinjection של X. עוברת laevis מתאים במיוחד ללימודים אלה.

Introduction

הגדלים של אברונים הסלולר בדרך כלל בקנה מידה עם הגודל של התא, ואת זה כבר אולי מתועד ביותר עבור קנה המידה של גודל גרעין עם תא בגודל 1-10. זה נכון במיוחד במהלך embryogenesis ו התמיינות תאים, כאשר ירידות דרמטיות בשני תא וגודל גרעיני לעתים קרובות הם נצפו 11,12. יתר על כן, גודל גרעין שינה הוא פרמטר מרכזי באבחון הסרטן ופרוגנוזה 13-17. מנגנונים שתורמים רגולצית גודל גרעין אינם ידועים בעיקר, בין שאר בשל מורכבות מהותה של מבנה גרעין ותפקוד. השיטה המתוארת כאן פותחה בתור assay במבחנה עבור קנה מידת גודל גרעיני אך למניפולציה ביוכימיות מבהירה מנגנוני ויסות גודל גרעין.

תמצית laevis ביצה Xenopus היא מערכת מבוססת היטב לשחזר וללמוד תהליכים תאיים מורכבים במבחנה 18-22. אחד מיתרונות המפתח למערכת לחלץ הוא X. תמציות ביצה laevis מייצגים הציטופלסמה חי כמעט שהרכבו ניתן לשנות בקלות, למשל באמצעות תוספת של חלבונים רקומביננטיים או immunodepletion. יתר על כן, אחד הוא מסוגל לתפעל תהליכים חיוניים ידי העסקת טיפולים שעלולים להיות קטלניים בהקשר vivo. שינוי של התהליכים לחלץ ביצה לאפשר בידוד של תמציות מן X. עוברים laevis ולא ביצים, ותמציות העובר אלה ניתנים באופן שווה על מניפולציה ביוכימית 23. במהלך X. laevis פיתוח, העובר המופרה התא הבודד (~ 1 מ"מ קוטר) עובר סדרה של שנתי עשר חלוקות תא מהירות (שלבים 1 - 8) כדי לייצר כמה אלף 50 μמ 'קוטר ותאים קטנים, להגיע לשלב ההתפתחותי כינה המעבר midblastula (MBT) או שלב 8 24-26. MBT מאופיין תחילת שעתוק zygotic, נדידת תאים, חלוקות תא אסינכרוני, רכישת שלבי פער, והקמה בגדלים יציבים גרעיניים ולא הרחבה גרעינית מתמשכת כמו לעובר שטרם MBT. משלב 4 עד gastrulation (טיולי 10.5 - 12), היקף גרעינים בודדים פוחת ביותר מ פי 10 11.

כאן, המטרה היא לזהות מנגנונים אחראים ההפחתות אלה בגודל גרעיני במהלך התקדמות התפתחותית. הגישה היא להרכיב גרעינים ראשונים X. laevis הביצה ואת תמצית לבודד אותם גרעינים מן הציטופלסמה ביצה / תמצית. גרעינים אלו מכן resuspended בציטופלסמה מעוברים בשלב gastrula מאוחר. לאחר תקופת דגירה, הגרעינים מתמצית ביצה נעשים קטנים יותר בתמצית העובר בשלב מאוחר. סברנו כי woul זהד להיות assay שימושי לזיהוי רכיבים ציטופלסמית הנוכחי בעוברים מאוחר שתורמים לכיול גודל הגרעין התפתחותית. שימוש assay זה, בשילוב עם אימות in vivo, הראינו כי חלבון קינאז C (PKC) תורמת להפחתה התפתחותית בגודל גרעיני X. laevis 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים Xenopus ומחקרים שנערכו מילוי הדרישות של המדריך NRC עבור לטיפול ושימוש מהדורה 8 בחיות מעבדה. הפרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים ויומינג ועדת שימוש (# אבטחת A-3216-01).

1. הכנת X. חלץ ביצה laevis (מותאם מ 27,28)

  1. X. נקבה הממשלה laevis צפרדעים מינימום של שלושה ימים לכל היותר שבועיים לפני אוסף ביצה עם הזרקת 100 IU אחת של גונדוטרופין בסרום סוסה הרה (PMSG).
  2. יום אחד לפני הניסוי, להזריק צפרדעים דרוכות עם 800 IU של גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) ומניח על 16 מעלות צלזיוס ב 1 ליטר לכל צפרדע 1 / 3x האצבעות השונות של מארק (MMR). ראה טבלה מס '1 עבור כל יצירות חיץ.
    הערה: יש צפרדעים לא להטיל ביצים או יטילו את הביצים באיכות ירודה. בדרך כלל 2 - 3 צפרדעים מוזרקות כדי להבטיח לפחות צפרדע אחת תטיל sufficienמספרי t של ביצים באיכות טובות. הצפרדע הממוצעת תטיל מספיק ביצים כדי לייצר לפחות 1 מיליליטר של תמצית ביצה.
  3. הכן 1 L 1 / 3x MMR עם מים ללא יונים מזוקקים קרים (DDH 2 O), 500 מ"ל חיץ B, 1 C חיץ L, 500 מ"ל חיץ D, ו -100 מ"ל חיץ E.
  4. העברה הטילה ביצים לצלחת המתגבשת זכוכית (150 x 75 מ"מ). שימוש pipet פלסטיק פסטר עם הקצה מנותק, לעבד את ביצים לבנות נפוח מופעל או ביצי lysed. רק לשמור על ביצים עם מוטות חיה כהה ברורות ושווות ותרנים צמחיים לבנים.
  5. הכן 13 x 51 מ"מ צינורות צנטריפוגות עם 1 מ"ל של הצפת E בתוספת 355 מיקרומטר cytochalasin D הוסיף רק לפני השימוש בשלב 1.7.
  6. Dejelly ולשטוף את הביצים.
    1. לשטוף ביצים בקצרה עם 1 / 3x MMR הקר בתוך כוס בגודל מתאים, שינוי החיץ 3 - 4 פעמים.
    2. הסר את המעילים ג'לי מן הביצים על ידי הדגירה עם הצפת B. זה יהיה לקחת בין 3 - 10 דקות. כמו מעילים ג'לי מעונן משתחררים מן הביצהים, לשנות את החיץ.
      הערה: Dejellying יושלם כאשר הביצים מופיעות צפופה בפינה של המנה כאשר מוטה ותרן צמחי מכוונים כלפי מטה. ביצים הן הרבה יותר שברירים לאחר dejellying, ועל כן אין דגירת ביצים עם ההצפה B למשך זמן ארוך יותר מאשר שוטף דרושים ולאחר צריכות להתבצע בזהירות רבה.
    3. בקצרה ביצים לשטוף עם 3 - 4 שינויים של הצפת ג
    4. בקצרה ביצים לשטוף עם 2 שינויים של הצפת ד
    5. בקצרה ביצים לשטוף עם 2 שינויים של הצפת E.
  7. מלאו צינורות צנטריפוגה עם ביצים באמצעות פיפטה מזכוכית הנישאת רחבה או טפטף פלסטיק. לשאוב את עודפי חיץ. כדי לארוז את הביצים ולהסיר חיץ ככל האפשר, צנטריפוגות ב הרוטור דלי מתנדנד ב 212 XG במשך 60 שניות ולאחר מכן ב 478 XG במשך 30 שניות. לשאוב את עודפי חיץ.
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר עודפי חיץ ככל האפשר בשלב זה על מנת להבטיח את מיצוי הביצה הוא מדולל מינימאלי.
  8. בעוד מתנדנד הרוטור דלי, ultracentrifuge תחת ואקום במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו -4 ° C לרסק ביצים פתוח להפריד לתוך שכבות שונות, עם הציטופלסמה להיות השכבה בצבע הענבר באמצע. הסר צינורות צנטריפוגות ומניחים מיד על הקרח.
  9. אסוף את התמצית.
    1. באמצעות מחט 18 מד מזרק, לנקב את צינור צנטריפוגות בדיוק מעל שכבת פיגמנט כהה בחלק התחתון של הצינור ולהסיר את שכבת cytoplasmic בצבע הענבר באמצע. אל תאסוף של שכבת השומנים העליונה. אסוף את הציטופלסמה בצינור בגודל מתאים.
      הערה: באופן כללי, 1 הצפרדע מייצרת לפחות 1 מ"ל של תמצית.
    2. הציטופלסמה מוסף עם 1 / 1,000 היקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, 1 / 1,000 מהיקף המניות LPC, ו 1/50 היקף תמהיל האנרגיה 50x. בעדינות להפוך את הצינור לערבב. אל pipet תמצית מוגזם.
    3. שמור את התמצית על קרח ולהשתמש בו בתוך 3 שעות של הכנה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
_title "> 2. הכנת זרע Demembranated X. laevis (מותאם מ 29)

הערה: כרכי ההליך המוצגים כאן הם עד 8 אשכים.

  1. הסר 0.05% benzocaine (מלאי benzocaine 10% ערוכים אתנול מדולל ל 0.05% במים טנק צפרדע) מ 4 ° C וחם לטמפרטורת החדר. להרדים ולהקריב זכר X. laevis צפרדעים בתמיסה benzocaine בטמפרטורת החדר למשך 20 - 30 דקות. ודא למוות על ידי היעדר דופק על ידי בחינה ולהרגיש את אזור החזה, על ידי חוסר התגובה לגירוי מכאני, ו / או על ידי עריפת ראש.
  2. לעשות חתך בצורת U לאורך הבטן. הסר את מסת tubulated של גופי שומן צהובים. בחלק העליון של הכליות, לאתר את האשכים, אשר צבעם סגלגלים המונים ורודים חיוורים על 1 סנטימטר אורך 29. ובלו האשכים ולגלגל אותם על נייר סופג כדי להסיר דם ורקמות אחרות.
  3. לשטוף אשכי הצפת ט השתמש עלי מצויד חזק כדי לרכך אשכים עם 1 מיליליטר של הצפהT צינור 1.5 מ"ל עד הומוגנית (10 משיכות או יותר). צנטריפוגה 5 - 10 שניות בצנטריפוגה מיני לאסוף את supernatant, הסרת חתיכות גדולות של רקמה. חזור על צנטריפוגה שוב לאסוף את supernatant.
  4. מעבירים את הפתרון המכילים זרע אל צינור פלסטיק 15 מ"ל. הגבר את עוצמת הקול כדי סך של 2 מ"ל עם הצפת ט צנטריפוגה ב 1,411 XG במשך 10 דקות ב 16 ° C עד גלולה הזרע.
  5. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של הצפת ט צנטריפוגה ב 1,411 XG במשך 10 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו פעם או פעמים לפי צורך כדי לנקות את הגלולה של תאי דם סומטיים ואדומים.
  6. Resuspend גלולה ב 100 μl הצפת T ו -300 μl הצפת ס דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    הערה: הצפת S מכיל lysolecithin, האחראית על demembranation.
  7. הוספת שלושה כרכים של הצפת R (מוכן טרי לפני השימוש). היפוך צינור פעם אחת בדיוק. צנטריפוגות ב 1,411 XG במשך 15 דקות ב 16 &# 176; ג.
  8. Resuspend גלולה ב 400 μl הצפת R ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל נוספים של צנטריפוגה הצפת ר ב 1,411 XG במשך 15 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
  9. Resuspend גלולה ב 50 μl הצפת ט
  10. לדלל גרעיני זרע 1 demembranated μl עם 9 μl הצפה ט החל דילול זה hemocytometer. ספירת גרעיני זרע בצורת אות S דקים רשת אחת גדולה 4 x 4, ו להכפיל את המספר הזה על ידי 100 כדי להשיג את הריכוז של המנייה ב גרעיני זרע לכל μl.
  11. לדלל את המניות 100,000 גרעיני זרע לכל μl עם ההצפה T, וכתוצאה מכך מלאה 200x. כן 3 - 5 aliquots μl. פלאש להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

3. אסיפה גרעינית

  1. מוסף 100 μl של תמצית ביצה עם 1.5 μl 35.5 מ"מ cycloheximide (ריכוז סופי ~ 0.5 מ"מ), 6 μl 20x פתרון המניות סידן (ריכוז סופי ~ 0.6 מ"מ), ו -0.7 μl 200x זרע (ריכוז סופי ~ 700זרע גרעינים / μl). קנה מידה של למעלה תגובת נפח או למטה לפי הצורך. היפוך או לטפוח בעדינות לערבב.
    הערה: חלץ אופניו מן metaphase לתוך שלבים מספקת פלטפורמה יותר חזקה ואמינה להרכבה גרעינית.
  2. דגירה באמבט מים ב 16 - C ° 20 במשך 90 דקות. מערבב על ידי קשה כל 15 דקות בעדינות כדי להבטיח גרעינים להישאר תלוי לחלץ.
  3. לעקוב אחר התקדמות של הרכבה גרעינית ב 45 דקות על ידי הכנת סקווש כדלקמן.
    1. Pipet 2 μl של תמצית לשקופית כוס ומוסיפים 2 לתקן גרעין μl.
    2. Overlay עם coverslip 22 מ"מ 2. תמונה על מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות מים, שמן, או אוויר 20 - מטרות 100X ומסנן DAPI.
      הערה: הגרעינים ניתן דמיינו ידי הדמיה בהיר שדה, אבל הם הרבה יותר קלים לדמיין ידי קרינה.
    3. השתמש גרעינים מיד או aliquots להקפיא פלאש בחנקן נוזלי חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: גליצרול 4% וכאילו כדי להוסיף על יחסי ציבור גרעיניםIOR הקפאה יכול לעזור כדי לשמור על שלמות שלהם. גרעינים קפואים הם בדרך כלל עדיין קיימים וניתנים יבוא גרעיני, אולם תהליך ההקפאה יכול להוביל גרעינים שברירי שבשו או יותר מבחינה מבנית. גרעינים עד שנה לאחר ההקפאה יכולים לשמש.

4. הכנת X. חלץ עובר laevis

  1. להשרות X. נקבה laevis צפרדעים להטיל ביצים כמתוארות 1.1 ו -1.2.
  2. לבודד אשכים מ X. זכר laevis צפרדעים כמתואר 2.2. לצלול האשכים במדיה L15 בתוספת 50 IU / ml של פניצילין סטרפטומיצין בכוס 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
  3. איסוף להפרות ביציות.
    1. אסוף טרי הטילו ביצים על ידי החזקת צפרדעים מעל צלחת לשימוש חוזרת זכוכית הפטר ולקדם הטלה על ידי הפעלת לחץ עדין על הגב תחתון ליד הביב. לסחוט את הצפרדע חזקה מדי עלול לגרום לפגיעה, שמוביל בטן req נפוחהuiring המתת חסד 29.
    2. אבזר המנה בזווית משוערת 45 °, לאפשר ביצים כדי לאסוף את דופן הקערה, להסיר את כל עודפי החיץ, ומוסיפות מספיק 1 / 3x MMR כדי בקושי לכסות את הביצים. להפרות ביציות בתוך 15 דקות של איסוף.
    3. השתמש עלי מצויד היטב מרוכך ו homogenize 1/4 של testis צינור 1.5 מיליליטר עם 500 μl של מלח גבוה השתנה המלוח של בארת (MBS המלח הגבוה). להוסיף האשכים macerated את הביצים ולאפשר הפריה להתרחש בטמפרטורת החדר במשך 15 - 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף ביצים עם MMR 1 / 3x.
      הערה: יעילות של אשכים פוחתת עם זמן אחסון, ולכן רקמת אשכים יותר עשויה להידרש הפריה מוצלחת בעת שימוש אשכים שאוחסנו במשך יותר משבוע.
    4. אשר הפריה על ידי בדיקת התכווצות של מוט החיה פיגמנט כהה על ידי סיבוב של העוברים עם מוטות החיה שלהם פונה כלפי מעלה, בדרך כלל כ -20 - 30 דקות לאחר תוספת של טסט כתושים. צפו מחשוף התא הראשון להתרחש בתוך 90 דקות.
    5. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה בחריצות להסיר (לבן נפוח או חלוקה לא שווה של חלמון פיגמנט) מת, lysed, או ביצים מופרות (כלומר, לא בקעו), כפי שהם יניעו במהירות למוות עוברי שכנה.
    6. בכל מקום בין 1 - 2.5 ה.ר. לאחר הפריה, dejelly עובר 2 - 3% ציסטאין מומסת 1/3 x MMR והותאם 7.9 pH עם 10 N KOH. בצע שני שינויים חיץ כי הם כל 3 - 4 דקות. ביסודיות לשטוף את העוברים עם 6 - 10 שינויים קצרים של 1 / 3x MMR כדי להסיר כל העקבות של ציסטאין.
      הערה: עובר Dejellied יש קרום vitelline ואינם שבירים כמו ביצי dejellied.
  4. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה, להעביר מופרת בריאה (כלומר, בקע) העוברים בצלחת פטרי המכילה MMR הטרי 1 / 3x ולאפשר להם להתפתח לשלב הרצוי ב RT או, אם להתפתחות איטית עדיפה, 16 ° C. המשך להסיר מת או lyעובר SED שמציין חוסר בליגה הראשונה או מראה לבן ותפוח.
  5. בדוק את שלב את העוברים על ידי בדיקה לסגירתם מוחלטת כמעט של blastopore ובאמצעות השוואת ציורים של מבוים עובר זמין חומר עזר 24.
    הערה: עוברים בתרבית בשעה 16 ° C יגיע שלב 11.5 - 12 כ 12 שעות.
  6. דגירה בשלב 11.5 - 12 עוברים MMR הטרי 1 / 3x השלים עם cycloheximide 0.5 מ"מ עבור שעה 1 ב RT, לעצור עוברת שלבים מאוחר.
  7. עבר עם זכוכית נישאת רחבה או טפטף פלסטיק מינימום של 15 (רצוי 30 או יותר) עובר נעצרו שלבים לצינור microcentrifuge.
    הערה: 15 עוברים מספיקים כדי לייצר כ 20 μl של תמצית. בהיקף של עד לפי הצורך.
  8. הוסף 1 מ"ל חיץ תמוגה ביצה (ELB) בתוספת 1 μl של המניה LPC. בעדינות להפוך לשטוף עוברים, לאפשר עוברים ליפול לתחתית הצינור, להסיר את החיץ. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים נוספות. </ Li>
  9. עוברים Resuspend ב 500 μl של ELB בתוספת 0.5 μl של המניה LPC, 5 μl של 19.7 מ"מ cycloheximide, ו -5 μl של 35.5 מ"מ cytochalasin D (לעכב פילמור אקטין). צנטריפוגה ב XG 200 דקות 1 ב microcentrifuge השולחן.
  10. הסר החוצץ עודף ולהשתמש עלי למחוץ את העוברים ביסודיות. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 10 דקות ב XG 10,000 ו -16 מעלות צלזיוס.
  11. לנקב את שכבת השומנים מלמעלה עם טיפ pipet 200 μl. עם טיפ 200 μl pipet נקי, להסיר את השכבה בצבע ענבר ציטופלסמית באמצע כדי צינור בגודל מתאים.
  12. מוסף לחלץ העובר עם 1/50 נפח 50x תמהיל האנרגיה (לספק מערכת התחדשות ATP), 1/100 היקף cyclohexamide 35.5 מ"מ, 1/500 בהיקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, ו- 1 / 1,000 מהיקף מניית LPC.
  13. הכן סקווש כמתואר 3.3 לדמיין גרעינים עובריים האנדוגניים לחלץ.
    הערה: תמצית עוברית אפשר להקפיא עם הגרעינים אנדוגני בנקודה זו. Aliquot להפחית להקפיא / מחזורי הפשרה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  14. כדי להסיר גרעינים מהתמצית העובר, לדלל את תמצית עם נפח שווה של ELB המכיל 1/50 היקף 50x תמהיל האנרגיה, 1/100 בהיקף 35.5 מ"מ cyclohexamide, 1/500 בהיקף 19.7 מ"מ cytochalasin D, ו 1 / 1,000 מהיקף המניות LPC. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד על 17,000 XG במשך 15 דקות ב 16 מעלות צלזיוס.
  15. אסוף את supernatant להיות זהיר, כדי למנוע כל שומנים ויככבו. נא לא להפריע את הגרעינים pelleted בתחתית הצינור. הכן סקווש כמתואר 3.3 על מנת להבטיח כי ברוב הגרעינים הוסרו. השתמש לחלץ טריים או aliquot ולאחסן ב -80 ° C.
  16. כדי לחמם להשבית לחלץ העובר על ניסויים שליטים, חום 30 - 100 aliquots μl של תמצית ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות Cycler תרמית. אפשר לחלץ חום מומת לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
_title "> 5. גרעינית כיווץ Assay ו Immunofluorescence

  1. לבודד גרעינים התכנסו לחלץ ביצה על ידי דילול 25 - 150 μl של גרעינים מראש התאספו ב 1 מ"ל ELB צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 1,600 XG 3 דקות ב 4 ° C ב microcentrifuge השולחן. הסר חוצץ, נזהר שלא להפריע הגלולה שברירים של גרעינים בתחתית של התחתית.
  2. Resuspend גרעינים בנפח של תמצית העובר שווה לנפח המקורי של תמצית ביצה בשימוש 5.1. השתמש ELB או תמצית חום מומת לתגובות שליטה, לפי העניין.
  3. לטפוח בעדינות את הצינור כדי לשבור את הגלולה ו resuspend הגרעינים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות, הקשה על הצינור בעדינות לתערובת כל 15 - 30 דקות. הערה: רוב ההתכווצות הגרעינית מתרחש בתוך 30 הדקות הראשונות.
  4. לעקוב אחר התקדמות של התכווצות גרעינית על ידי הכנת סקווש.
    1. Pipet 2 μl של תמצית לשקופית כוס ומוסיפים 2 לתקן גרעין μl.
    2. שכבה עם 22 מ"מ 2
  5. הקש את הצינור כדי resuspend הגרעינים רק לפני הוספת 500 μl של מקבע המורכב ELB, 15% גליצרול, ו -2.6% paraformaldehyde. הפוך מיד, ובמקום הצינור על הכתף במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הכין ספין למטה צינורות על ידי outfitting עגול 15 מיליליטר צינורות זכוכית תחתונים עם מוסיף פלסטיק תחתי עגול (עיצוב שרטוטים זמינים לפי בקשה). הוסף 5 מ"ל של חיץ כרית גרעיני. זרוק coverslip עגול 12 מ"מ לתוך הצינור, להיות בטוח שהוא מניח שטוח על גבי סוגר הפלסטיק.
  7. בעדינות שכבת הפתרון המכיל גרעינים קבועים על גבי הכרית הגרעינית באמצעות קצה pipet רחב נשא. צנטריפוגה ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 15 דקות XG ב 1000 ו -16 מעלות צלזיוס.
  8. השתמש aspirator כדי להסיר את כל המאגר ולמשוך את סוגר הפלסטיק לחלק העליון של הצינור. הסר את coverslip עם זוג מלקחיים בסדר, נזהר לציין את צד הכיסוילהחליק על אשר הגרעינים היו סובבים. פוסט לתקן מתנול קר (מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות ב RT.
  9. מעבירים את הצד coverslip גרעין לעלות על סדין של סרט פרפין פלסטיק ביטון בצלחת פטרי פלסטיק גדולה. מניח מגבונים חד פעמים רטובות לאורך הצד של המנה, כדי למנוע התייבשות.
  10. רעננותם גרעינים על coverslip עם 500 μl של PBS-NP40 (PBS 1x בתוספת 0.1% NP40) ואת לשאוב אחרי 5 - 10 שניות.
  11. בזהירות שכבת 75 μl של% PBS-3 שור סרום אלבומין (BSA) על coverslip. אפשר לחסום 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. סור פתרון חסימה, דגירה עם נוגדן ראשוני (למשל, mAb414 נגד המורכב הנקבובי הגרעין, 1: 1,000) המדולל BSA PBS-3% במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף עם חמישה שינויים מיידיים של PBS-NP40.
  13. דגירה עם נוגדנים משני מדולל BSA PBS-3% במשך שעה 1 ב RT. לשטוף עם חמישה שינויים מיידיים של PBS-NP40.
  14. לִדגוֹרעם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​Hoechst מדולל BSA PBS-3% במשך 5 דקות ב RT. לשטוף חמש פעמים עם PBS-NP40. הסר את כל עודפי החיץ.
  15. הר coverslip לשקופית עם 5 בינוני הרכבה μl antifade. חותם עם לק ברור. תמונה מיד באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם 20 - 100x מטרות או בחנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הדמיה מאוחר יותר.
    הערה: בצע כימות כפי שתואר לעיל 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העצרת של גרעינים ב Egg חלץ

הצעדים הראשונים של פרוטוקול זה יערכו את X. laevis לחלץ ביצה (פרוטוקול 1) גרעיני זרע demembranated (פרוטוקול 2). ריאגנטים אלה משמשים לאחר מכן כדי להרכיב גרעיני דה נובו (פרוטוקול 3). איור 1 מציג כמה נתונים נציג. תוספת של סידן שמניע את תמצית ביצה נעצר meiotically לתוך שלבי הביניים, ואת cycloheximide שומר על תמצית נעצר הביניים. על ידי 30 - 45 דקות לאחר תחילת התגובה, בצורת אות S הדק בתחילה גרעיני הזרע צריכים להתחיל לעבות לגושים הכרומטין בצורת שבלול. היווצרות מוצלחת של מעטפת גרעין שלמה יכולה להיות מוערכת על ידי תבואו על ושמירה על מטעני יבוא שכותרתו fluorescently, כגון GST-GFP-NLS (מידע לא מוצג), או על ידי מכתים שפה למתחם נקבובי הגרעין באמצעות mAb414 שמכיר FG-repeat containucleoporins נינג (איור 1 א). לאחר הרכבה גרעינית מתרחשת, צורת גרעין צריכה להיות יותר מעוגלת הנפח הגרעיני צריך לגדול ככל מעטפת הגרעין מתרחבת וחלבונים גרעיניים מיובאים (איור 1 ב- C). אי-הקפדה על היווצרות של מעטפת גרעין ללא פגע או צמיחה גרעינית מצביע על תמצית ביצה באיכות ירודה. במקרה זה, עדיף להתחיל שוב עם קבוצה חדשה של ביצים.

הסרת אנדוגני גרעינים מתמצית עוברית
השלב הבא הוא להכין תמצית העובר בשלב מאוחר (פרוטוקול 4). לאחר הכנה ראשונית של לחלץ לפני הסרת גרעינים, עדיף להכין סקווש מוכתם Hoechst של aliquot קטן של תמצית. ויזואליזציה של גרעינים עובריים קטנים רבים היא אינדיקציה טובה של הצלחה בהכנת התמצית (איור 2 א). כמו גרעינים עובריים אנדוגני יכול להפריע לניתוח במורד הזרםים, זה גם חשוב לבדוק aliquot של תמצית לאחר הסרת גרעינים ידי דילול צנטריפוגה. בהשוואת הסקווש הראשון, מעט מאוד גרעינים יש להשאיר את התמצית (איור 2 ב). אם יש עדיין הרבה גרעינים נוכחיים, סיבוב שני של צנטריפוגה נדרש.

Assay גרעיני כיווץ
איור 3 מציג תוצאות נציג עבור assay מתכווץ הגרעיני (פרוטוקול 5). גרעינים לחלץ ביצה resuspended בתמצית העובר בשלב מאוחר נעשים קטנים יותר לאורך זמן (איור 3). כביקורת שלילית טובה עבור assay היא דגירת גרעינים עם תמצית העובר כי כבר חום מומת (איור 3 א). כמו גרעינים להיכשל להצטמק תמצית חום מומת, זה מספק קצת ביטחון לזה שנצפה גרעיני מתכווץ עם תמצית עובר מטופל אינו תוצאה של שפעות האוסמוטי. היקף גודל גרעיןהפחתות שנצפו משתנות בהתאם תצווה המסוימת של גרעינים לחלץ ביצה, כמו גם את איכות לחלץ העובר. מניסיוננו, התכווצות גרעינית תמיד הוא ציין (למשל, בלמעלה מ -40 תמציות עובר שונות), אך למרות זאת חשוב לחזור על הניסויים הללו מספר פעמים עם גרעינים שונים והתמציות להתייחס השוני הפנימי של assay. איור 4 מראה סכמטית של הפרוטוקול כולו.

איור 1
באיור 1. אסיפה הגרעינית קורס שעת X. חלץ ביצה laevis. גרעינים הורכבו דה נובו ב X. laevis לחלץ ביצה כמתואר בפרוטוקול 3. Aliquots מאותו התגובה קובעו דמיינו ידי immunofluorescence באמצעות נוגדן נגד במתחם נקבוביות הגרעין (NPC) (mAb414) בכתובת: > א) 30 דקות, ב) 60 דקות, ו- C) 90 דקות לאחר תחילת הרכבה גרעינית. פרוטוקול immunofluorescence מתואר בפרוטוקול 5. סרגל קנה המידה הוא 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
הסרת איור 2. של גרעינים מ X. laevis חלץ העובר. X. תמצית העובר laevis הוכן משלב 11.5 - 12 עוברים כמתואר בפרוטוקול 4. aliquot קטן של תמצית היה קבוע מוכתם Hoechst: א) לפני הסרת גרעינים, ו- B) לאחר הסרת גרעינים על ידי צנטריפוגה. סרגל הסולם הוא 25 מיקרומטר.om / קבצים / ftp_upload / 54,173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. נציגי נתונים מתוך Assay הכיווץ הגרעיני. גרעינים הורכבו דה נובו ב X. laevis לחלץ ביצה בתוספת GFP-LB3 רקומביננטי (כדי להמחיש את למינה גרעינית). כמתואר בפרוטוקול 5, גרעינים לחלץ ביצה בודדו resuspended בשלב 11.5 - 12 תמצית העובר שממנו גרעינים עובריים אנדוגני הוסרו. זמן לשגות הדמיה חיה בוצעה ב 30 מרווחי שניות למשך 90 דקות. לוחות איור להראות תמונות שנרכשו ב 6 מרווחי דקות עבור גרעינים וטופחו: א) תמצית העובר בשלב מאוחר (LEE), ו- B) חום מומת (HI) לחלץ העובר. תמונות מן הקורסים זמן להמשיךמשמאל לימין. סרגל הסולם הוא 25 מיקרומטר. ג) נתונים מתכווצים גרעיניים מ -46 תמציות ביצת עובר שונות. ברים להראות את האמצעים> 240 גרעינים. ברי שגיאה הם סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. סכמטי של הגרעין כיווץ Assay. כל תיבה בצבע מייצג פרוטוקול אחד. אדום עולה הכנת X. laevis לחלץ ביצה (פרוטוקול 1). כחול עולה הכנת X. demembranated זרע laevis (פרוטוקול 2). פינק מציין דה נובו הרכבה גרעיני לחלץ ביצה (פרוטוקול 3). ירוק מציין הכנת X. תמצית עובר laevis (פרוטוקול 4). סגול מציין את s הגרעיניפרוטוקול immunofluorescence assay hrinking (פרוטוקול 5). חלקים של דמות זו כבר לעשות בה שימוש חוזר מ -23. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שם מאגר רכב חוצץ
האצבעות השונות של מארק (MMR), 1 / 3x 33 מ"מ NaCl, KCl 0.7 מ"מ, 0.3 מ"מ 4 MgSO, 0.7 מ"מ 2 CaCl, 1.7 מ"מ HEPES, pH 7.4
חלץ חיץ (XB), 10x 1 M KCl, 1 מ"מ 2 CaCl, 10 מ"מ MgCl 2, 500 סוכרוז מ"מ, 100 מ"מ HEPES, pH 7.8 (pH מותאם עם 10 N KOH, לאחסן 4 ° C)
הצפת B 4% ציסטאין מומס XB 0.8x (שהוכן עם DDH קר 2 O, pHdjusted ל -7.8 עם 10 N NaOH)
מאגר C מערבבים 100 מ 'של 10x XB עם 900 מ"ל של קר DDH 2 O
מאגר D מאגר C בתוספת 5 מ"מ EGTA ו -800 מיקרומטר MgCl 2
מניית LPC, 1,000x 10 מ"ג / מ"ל ​​כל אחד leupeptin, pepstatin, ו chymostatin מומס DMSO (מאוחסן aliquots ב -20 ° C)
הצפת E 100 מיליליטר הצפת D בתוספת 100 מניות LPC μl
תמהיל אנרגיה, 50x 190 מ"מ Disodium קריאטין פוספט, 25 מלח disodium מ"מ ATP, 25 מ"מ מגנזיום כלוריד
מאגר T 15 צינורות מ"מ, 15 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 7 מ"מ MgCl 2, 80 mM KCl, 0.2 M סוכרוז, pH 7.4 (מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C)
מאגר S 20 מ"מ מלטוז ו 0.05% lysolecithin ערוכים הצפת T
מאגר R מאגר T בתוספת 3 שור% אלבומין
סידן פתרון מניות, 20x 10 מ"מ CaCl 2, 0.1 KCl M, 1 מ"מ MgCl 2 (מאוחסן ב -20 ° C)
תיקון גרעין 125 μl 2 M סוכרוז, 12.5 μl 1 M HEPES pH 7.9, 250 μl 37% פורמלדהיד, 112 μl DDH 2 O, 0.5 μl 10 מ"ג / מ"ל Hoechst (מאוחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שבועיים)
השתניתי המלוח של בארת (MBS), 10x 880 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 50 HEPES מ"מ, 25 מ"מ NaHCO 3, pH 7.8
MBS גבוהה מלח 1x MBS פלוס 0.7 מ"מ CaCl 2 ו 20 מ"מ NaCl
חיץ תמוגה ביצה, ELB 250 סוכרוז מ"מ, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.8
חיץ כרית גרעיני 1x XB, 0.2 M סוכרוז, 25% גליצרול (מסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C)

ther.within-page = "1"> בטבלה 1. חוצצים. יצירות של חוצצי כל המוזכרים בפרוטוקול זה מתוארים בטבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143, (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6, (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113, (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122, (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23, (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25, (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24, (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4, (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12, (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18, (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38, (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2, (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124, (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8, (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206, (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30, (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1, (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98, (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14, (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121, (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189, (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18, (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147, (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10, (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169, (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13, (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22, (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126, (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11, (12), 937-957 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics