고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

Biology

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Summary

마이크로 RNA는 중요한 조절 역할을하고 다양한 인간 질병에 대한 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다. miRNAs의 고밀도 지단백질에 수행되는 것을 도시하고있다. 우리는 빠른 속도로 인간 혈장에서 miRNA의 분석에 적합한 정제 HDL을 분리하는 간단한 방법을 개발했다.

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Seneshaw, M., Mirshahi, F., Min, H. K., Asgharpour, A., Mirshahi, S., Daita, K., Boyett, S., Santhekadur, P. K., Fuchs, M., Sanyal, A. J. Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (113), e54257, doi:10.3791/54257 (2016).

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Abstract

Protocol

혈액 샘플 1. 컬렉션

  1. 전주 포사에서 눈에 띄는 정맥의 표준 정맥 천자에 의해 (다른 항응고제에 비해 몇 가지 장점이 있습니다) 항응고제 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 10 ML의 플라스틱 튜브에 말초 정맥 혈액 샘플을 금식 수집합니다.
  2. 적혈구 및 RNA 소량의 자유 혈장을 얻었다 탁상 원심 분리기로 4 ℃에서 20 분 동안 1,600 XG에서 혈액 샘플을 원심 분리기.
  3. 순차적으로 각각 남아있는 세포 파편을 제거하기 위해 WBC 및 혈소판 15 분 후 추가를 제거하는 10 분 동안 스윙 버킷 로터에서 3,000g (4 °에 C)에서 상층 액을 원심 분리.
  4. 제조 지시에 따라 RT에서 농도계를 이용하여 플라즈마의 밀도를 측정한다.
    주 : 농도 조정 (d = 1.023 g / ㎖) 0.9 % 식염수 용액 엑소 좀을 제거하지만, 종래 밀도 구배 초 원심 분리 후 필요하다.
  5. 플라즈마 2. 엑소 좀 제거

    1. HDL 유사한 밀도가 순환 엑소 좀을 제거하고 miRNA의 (3)의 양적 중요한 소스를 나타냅니다.
      1. 4 ° C에서 30 분 동안 배양 한 다음 1 ml의 플라즈마에 252 ㎕의 엑소 좀 침전 솔루션을 추가하여이 작업을 수행합니다. 엑소 좀을 펠릿, 4 ℃에서 1,500g에서 30 분 동안 혼합물을 원심 분리.
      2. HDL, 밀도 구배 초 원심 분리하여 더 처리 카보네이트 두꺼운 초 원심 분리 튜브에 얻어진 상등액 전송 한 용액을 분리 (아래 참조).

    3. 밀도 구배 초 원심 분리 (그림 1).

    1. HDL은 고정 각 로터 448,811 X G에서 동작하는 8 ° C 각각과 바닥 초 원심 분리기를 사용하는 3 단계 프로세스를 사용하여 분리해서한다.
    2. 세 가지 다른 밀도 솔루션 순차적으로 각각의 분리를위한 신선한를 준비합니다.
      1. 용액 A를 준비 (VLDL의 분리 D = 1.006 g / ㎖) 11.4 g의 NaCl (염화나트륨 : 0.195 몰)을 용해하여 멸균 증류수 1,000 ㎖에 0.1 g의 EDTA2Na 1 ml의 1N NaOH를합니다. 그런 다음 멸균 증류수의 추가 3 ㎖를 추가합니다.
      2. 100 ㎖ 용액 A (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 2.44 몰)을 25.2 g의 NaBr은을 추가하여 용액 B를 준비 (LDL의 격리, D = 1.182 g / ㎖).
      3. 용액 A의 100 ㎖ (염화나트륨 0.195 몰, NaBr은 7.7 몰) 78.8 g의 NaBr은을 혼합하여 (D = 1.470 g / ㎖ HDL의 분리) 솔루션 C를 준비합니다. 농도계를 사용하여 실온에서 적절한 밀도를 확인합니다. 더 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 솔루션을 보관하십시오.

    VLDL 4. 분리

    1. 플라즈마 1 ㎖ (평균 밀도 = 1.023 g / ㎖) 6.5 ㎖의 폴리 카보네이트 두꺼운 벽으로 둘러싸인 초원 심 분리기 튜브에 지방 레드 7B와 뉴 클레아 무료 200 μl를 섞는다.
    2. 조심스럽게 혼합 위에 A 액 5 ㎖ 계층. 필요한 경우, 용액 A의 t의 상단에 추가로 지방 레드 7B를 추가O 각 튜브의 무게 균형. - 2 시간 (5 가속도)에 대한 원심 분리기 (감속 - 7).
      주 : 원심 동안 지단백질가 평형 농도 영역에서 대역으로 축적된다.
    3. 실행의 끝에서 2 층을 관찰합니다. 4 ° C에서 상단 층 및 저장소를 나타내는 VLDL 분획의 1.5 ml의를 제거합니다.
    4. 마지막으로, LDL을 포함하는 튜브의 바닥으로부터 피펫 전사 4 용액을 이용하여, HDL, LDL을 분리하기위한 새로운 폴리 카보네이트 튜브 알부민 및 지방산 분획.

    LDL 5. 분리

    1. 각각 LDL과 HDL 비율 (4 절)를 포함하는 튜브에 용액 B 100 ㎕를 뉴 클레아 무료 지방 레드 7B 2 ㎖를 섞는다.
    2. 그런 다음 3 시간 (가속 9, 감속 7)을 위해 밖으로 원심 분리기. 그 후, 상단 층을 나타내는 LDL 분획의 1.5 ml의 제거 및 -80 ° C에서 4 °의 C 또는 저장하시오. 마지막으로, HDL을 함유하는 튜브의 바닥에서 4 ml의 전송새로운 폴리 카보네이트 튜브 부분.

    HDL 6. 분리

    1. 이 용액 C의 용액, 100 μL 클레아없는 지방 레드 7B 및 각각 HDL 분획을 함유하는 튜브에 98 % β 메르 캅토 에탄올의 15 μl를 섞는다.
    2. 3 시간 (가속 9, 감속 7)에 대한 원심 분리기. 그 후, 상부 층을 나타내는 HDL 분획이 용액을 제거하고 -80 ℃에서 4 ℃에서 보관하거나 저장하거나.

    7. 탈염 및 지단백질 분획의 농도

    1. 이후의 아가로 오스 겔 전기 영동 및 PCR과의 간섭을 방지하기 위해, 제조업체의 지침에 의해 설명 된 바와 같이 (LDL / HDL에 대한 VLDL 및 10K 튜브에 대한 3K 관) 적절한 분자량의 컷오프와 원심 필터 장치를 사용하여 밀도 구배 초 원심 분리 동안 추가 과도한 소금을 제거합니다.
      1. 간단히, 차가운 PBS (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCL, 8 밀리미터의 Na2HPO4, 2 mM의 KH2PO4, pH를 7.4) 2.5 ml에 추가 한 후 centrifuGE 전체 VLDL 분획 수집-동안 밀도 구배 초 원심 분리 4 ° C에서의 스윙 버킷 회 전자를 사용하여 60 분 동안.
      2. 30 분마다 10 ml의 빙냉 PBS로 두 번 LDL 분획을 탈염. 다음으로, HDL 분획을 탈염 두 번 13 ml의 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 높은 PBS 부피는 아가 로스 겔 전기 영동으로 이동도를 개선하는 것이 필요하다. 원심 분리 후, 지질 단백질 함유 용질을 제거하고 4 ° C에서 보관 또는 -80 ° C에 저장됩니다.

    8. 아가 로스 젤 전기 영동

    1. 다음과 같이 제조업체의 지침의 약간의 수정과 함께 키트를 사용 지단백 아가로 오스 겔 전기 영동을 Perfrom.
      참고 :이 단계는 집중 지질 단백질 샘플의 품질과 순도를 평가하기 위해 단지이다.
      1. 요약하면, 밀도 구배 초 원심 분리하여 탈염 지단백질 분획 6 μl를 구해서 미리 주조 지단백질 젤 상에 로딩. 인간의 lipop를 사용하여크기 기준으로 VLDL, LDL과 HDL에 대한 rotein 표준. 담당자 준비 버퍼를 사용하여 60 분 동안 100 V에서 RT에서 전기 영동을 수행하십시오.
      2. 10 분 동안 겔을 건조하고 지방 레드 7B와 함께 RT에서 10 분 동안 염색. 5 분 동안 다시 메탄올 - 물 75:25 (v / v)의 건조 혼합물에 겔 Destain.

    9. RNA 추출 및 정제

    1. 혈청 / 플라즈마 miRNA의 분리 및 정제 키트를 사용하여 정제 된 인간의 HDL에서의 miRNA의 분리를 Perfrom.
      1. 간단히하는 vortexer를 혼합 한 후 핵 단백질 복합체 및 RNases의 불 활성화의 완전한 분리를 보장하기 위해 RT에서 5 분 동안 배양, 정제 HDL 200 μL에 RNA 용해 시약 1 ㎖를 추가합니다.
      2. (1.6 × 10 8 복사 / μL CEL-은 miR-39) 혼합물에 다음 합성 Caenorhabditis 엘레 간스 마이크로 RNA의 3.5 μl를 스파이크. 그런 다음, 제조자의 지시에 따라 RNA의 추출을 실시한다.
    2. purificati를 수행제조업체의 지침에 따라 용출 스핀 열 추출-miRNA의의에. spectrophorometer와 정제 HDL에서의 miRNA의 농도를 측정한다.
      참고 : 스핀 컬럼에서의 miRNA의 용출 된 RNase없는 물 16 μl를 고용했다.

    10. 역전사 (RT-PCR)

    1. HDL에서의 miRNA 100 NG를 분리하여 miRNA의 합성 (CEL-은 miR-39)과 역전사 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 20 ㎕의 반응 부피로 역전사 타서.
    2. 템플릿의 miRNA (NTC)없이 역전사 효소 믹스 (NRT)없이 적절한 제어를 수행합니다.

    11. 실시간 PCR (QRT-PCR)

    1. cDNA를 2 희석, 10 ㎕의 PCR 혼합물, 2 μL 유니버설 프라이머 2의 miRNA 프라이머 μL, 4 ㎕의 RNA 분해 효소가없는 물 : 1 2 ㎕를 20 ㎕의 총 부피로 리얼 타임 PCR을 Perfrom.
    2. 를 Reacti을 실행15 초, 30 초 동안 55 ° C 및 30 ~ 70 ° C의 확장 단계에 94 ° C의 45주기 다음 15 분 동안 95 ° C에서 96 웰 플레이트에서의 삼중의 모든 반응을 Perfrom s.ec .
    3. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 합성 하우스 키핑 유전자에 정상화 후 2 -ΔΔ 코네티컷 방법을 사용하여 miRNA의의 Calcuate 상대적인 양.

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Representative Results

엑소 좀 제거 후 고밀도 지단백의 분리
고순도 HDL에서의 miRNA를 얻으려면이 miRNA의 오염 (7)의 소스를 대표하는 엑소 좀을 제거 할 필요가있다. 이것은 상업적으로 이용 가능한 키트 밀도 구배 초 원심 분리에 앞서 수행 하였다. 실용적으로 상업 회사에 의해 개발 된 3 단의 ​​표준 밀도 구배 초 원심 프로토콜 (도 1)를 변형시켰다. 이 프로토콜은 54,000 rpm으로 3, 8, 9, 10까지의 원심 분리 힘으로 일반적으로 사용되는 프로토콜보다 상당히 빠르다 140,000 rpm의 속도로 고정 각 로터로 원심 분리를 필요로한다. A의 널리 사용할 T-1270 로터를 채용 70,000 rpm으로 최대 힘 원심 분리는 처음 원심 분리 힘 레지스트 못했다 polyallomer 튜브 행했다. 튜브의 붕괴를 방지하기 위해,폴리 관이 성공적으로 사용되었다. 원심 분리 시간은 지단백의 산화 및 잠재적으로 miRNA의 저하 (11)에 대한 중요하다. 8 내지 96 시간의 총 레인 징 따라서 여러 번 원심 분리, 테스트 하였다. 원심 분리가 수행되었을 때의 온도 또​​한 각각 원심 시간 및 힘에 기초하여 조정되었다.

고밀도 지단백질 분획의 순도
절연 고밀도 지단백질 분획의 순도는 아가로 오스 겔 전기 영동으로 확인 하였다. 2. 구배 초 원심 분리에 의해 격리 HDL 빼기위한 전형적인 전기 영동 결과를 도시한다. 그것은 분명 HDL이 VLDL의 오염은없는 것으로 나타났다 전형적인 α-이동성을 나타낸다. VLDL 및 LDL 분획의 모든 α-마이그레이션 지질 단백질의 부재는 ultracent 동안 HDL의 완전한 회복을 보여줍니다rifugation 단계. 고밀도 지단백 분획 그러나 인해 오염 지단백질 (LP (a)) (12)에 β-이동성 공지 영동 줄무늬 패턴의 일부 추적 하였다.

격리 HDL에서 LP (a)의 제거
HDL에서 수행의 miRNAs를 공부하는 것은 가장 높은 순도의 HDL의 분리가 필요합니다. 지단백의 간섭 (a)는 HDL과 LDL 잠재적에서 수행의 miRNAs와 HDL의 교차 오염에 기여한다. HDL이 오염을 최소화하기 위해, β 머 캅토 에탄올 (10)의 15 μL 마지막 원심 분리 공정 (도 1) 중 용액 C를 첨가 하였다. β 머 캅토 에탄올의 첨가는 HDL 농도 특성 (10)를 변경하지 않는 것으로 나타났다. 도 3에 표시된 바와 같이, β 머 캅토 에탄올의 첨가는 LP (a) 매우 효과적으로 제거와 일치하는 B-이주 지단백질의 부재의 결과.

"1">의 miRNA의 정화를 HDL에서
된 miRNA의 분리는 초기에 일반적으로 혈액으로부터 RNA 추출을 위해 사용되는 이용 용해 시약을 시도 하였다. 이 방법은 아주 좋은 RNA 수율 (91.45 NG / μL)이 아니라 후 결과 있지만 분광 분석은 만족스럽지 못한 RNA의 순도를 보여 주었다. 페놀을 제거하여 분리 된 RNA의 추가의 정제하여 순도를 향상되지만 RNA 수율 이제 크게 낮았다. 다음으로, 다른 키트는 허용 RNA 순도 (1.7의 280 분의 260 nm의 비율)하지만, RNA 수율이 26 배 낮은 용해 시약 (3.45 91.45 NG / μL)과 비교 하였다을 보여 주었다있는 테스트되었습니다. (1.6의 260/280 nm의 비율 48.2 NG / μL) 따라서이 추출 과정 이후 격리에서의 miRNA의 검출을 위해 사용 된 양호한 수율로 허용되는 RNA 순도에 대한 최상의 결과를 miRNeasy 혈청 / 혈장 키트 얻었다 HDL 지단백질 분획.

(3)화물에서 확인하고, HDL 콜레스테롤 흡수 (5)를 억제하는 것으로했기 때문에이 miRNA의이 선택되었다. 그림의 4A. PCR을의 미르-223에 대한 반응의 최적화 후베이스 라인 임계 값 및 임계 사이클 값을 비교 증폭 곡선의 전형적인 로그 플롯을 표시 아군 된 CEL-미르-39. 플라즈마에서의 miRNA 알려진 정규화 제어에 대한보고가없는 한 이러한 합성 유전자는 내부 대조군으로서 사용 하였다. 또한, RNU6-2, RNU-48과 같은 몇 가지 잠재적 인 설립 내생 하우스 키핑 유전자, HY3가 감지 할 수없는 및 SNORD95는 정제 HDL 검출 할 수 있지만, 미르-223과 SNORD95의 코네티컷 값의 차이 (5 개 미만이다 데이터) 미도. 그림 5에 도시 녹는 곡선 분석은 분명히 하나의 뚜렷한 표시앞의 PCR의 선택의 miRNA의 증폭과 일치 피크. 도 4b. 도시 된 바와 같이, 결과 miR-223 및 기준 모두 CEL-미르 39 일관 여섯 프로 대역에서 검출 될 수있다. 모든 개인 사이의 비교적 작은 변형은 miR-223에 비해 CEL-미르-39 관찰되었다. 이러한 연구 결과는 miRNA의화물을 검출 할 수 있도록 고순도 HDL의 격리를 지원합니다.

정제 된 HDL 미르-223의 검출
실시간 정량적 PCR 법은 단일 가닥의 miRNA 이중 헤어핀 구조의 miRNA 전구체를 정량화 하였다. 이 방법은 정 / 역 유전자 특이 프라이머 및 cDNA를로의 miRNA의 머리 핀의 자형 구조를 변환하는 내열성 역 효소를 필요로한다. cDNA를 연속적으로 증폭 SYBR 그린 검출의 도움으로 실시간 qPCR에를 사용하여 정량 하였다. 혈청, 혈장 및 정제 HDL 플라즈마에서 마이크로 RNA는 PROFIL 정확하게 할 수있다에드는 miRNA의 RT PCR 시스템을 사용.

평균은 miR-223 유전자 발현의 우리의 실험 제품은 정제 HDL에 30.9의 코네티컷 값을 보였고, 그 대응하는 음성 대조군은 차단 35 이상이었다 (NTC = 38.1 코네티컷 값, NRT 및 NAC는 증폭되지 않았다). 이 실험에서는, 저 융점 온도 정제 HDL 샘플에 프라이머 - 이량 체 형성을보고 (미르 - 223 73 ° C 및 75.5 ° C CEL-은 miR-39) 및 특정의 miRNA 분석법보다 C의 t 값 (표 1). 표 1의 프라이머 - 다이머 때문에 용액 프라이머 고농도 아마 발생한다. 프라이머 분자 30 PCR 사이클 13 후에 서로 부착 할 때 주로 발생한다. 이것은 그들이 어떤 templat (다른 프라이머 분자 효과에 어닐링되지 선형 미니 템플릿되고 더 높은 배경의 원인이됩니다 및 C t 값 <NTC 40 세대로 이어질 수 있습니다전자 제어) 샘플.

그림 1
그림 1. HDL 격리 절차의 도식 표현. HDL은 세 원심 분리하는 일련의 단계에서 밀도 구배 초 원심 분리하여 제조 하였다. 밀도 구배 지단백 밴드와 중간 분수의 분포가 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
β 머 캅토 에탄올없이 격리 지단백질도 2 아가 로스 겔 전기 영동. VLDL, 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 단리 LDL 및 HDL 분획 용액 C의 demonst에 β 메르 캅토 에탄올을 첨가없이고밀도 지단백 분획 LP (a)의 존재를 평가. 레인 1, 2, 9, 및 10 각각은 사이즈 마커를 나타내고; 레인 3/4, 5/6 및 7/8은 각각 VLDL, LDL과 HDL을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
β-머 캅토 에탄올로입니다. 마지막으로 원심 분리 단계 이전에 솔루션 C에 β 메르 캅토 에탄올을 추가 HDL의 그림 3. 아가로 오스 겔 전기 영동은 HDL 분획에서의 (a) 지단백의 제거 결과. 각 사이즈 마커를 나타내는도 9 및도 10, 레인 1, 2; 레인 3-8은 HDL을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 4. 증폭 두 개의 다른의 miRNAs의 플롯 및 CEL-은 miR-39은 miR-223의 발현. 한 바와 같이 (A) 실시간 정량 PCR 격리 HDL 채용 행했다. PCR을 45 사이클 곡선이 임계 값 C가 T - 값이다 교차하는 지점에 대해 실행 하였다. 데이터의 표현을 보여 CEL-은 miR-39 (왼쪽 패널) 및은 miR-223 (오른쪽 패널), 각각. 수평 라인이 검출 임계 값을 나타냅니다. (35)의 사이클 수는 긍정적 증폭 컷오프로 설정 하였다. (6) 샘플로부터 얻어진 절연 HDL에서 (B) 주제 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 원시 코네티컷 값이 발현 수준이 다른 기증자로부터 6 샘플, 각각의 사이에 정제 HDL 혈장 분획 미만 2 코네티컷 값을 변화 CEL-은 miR-39은 miR-223에 대한 표시됩니다 것을 의미한다. 발현 프로파일은 PCR 시스템 및 인간 혈청 및 혈장 miRN를 사용하여 수행 하였다QRT-PCR은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
CEL-은 miR-39은 miR-223 그림 5. 녹는 곡선입니다. 도시 된 바와 같이 단일 피크의 존재는. CEL-은 miR-39 (오른쪽 패널)과은 miR-223 (왼쪽 패널), 각각의 특정 증폭을 나타냅니다 하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블
음과 양의 합성 CEL-은 miR-39의 제어은 miR-223의 혈청, 혈장, cDNA를 특징으로, 정제 HDL 분획의 표 1. 행 C의 t 값입니다. NTC (없음 templat 없습니다전자 제어), NRT (없음 역전사 효소), NAC (QRT-PCR 없음 증폭 제어, 단지 물과 시약).

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Discussion

혈액에서 새로운 바이오 마커의 식별은 각종 질병의 임상 진단 및 예후에 도움이됩니다. 마이크로 RNA는 바이오 마커의 모든 자질을 가지고하는 것으로 알려져하고 다양한 연구 14-17에 표시되어있다. 이 연구에서 우리는 플라즈마 HDL에서의 miRNA를 분리하기 위해 신속하고 간단한 쉬운 방법을 증명하고있다. VLDL, LDL 및 HDL의 분리의 종래의 밀도 구배 초 원심 분리 방법은, 플라즈마의 정확한 샘플링 완충액 정밀 제조, 밀도 및 하부 지단백질 분획 8 정량적 전송 측정에 의존한다. HDL 8 -11을 분리 설명 된 여러 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법은 종종 매우 힘든 중 하나 또는 탈염 고립 지질 단백질에 대한 플라즈마 및 광범위한 투석의 많은 양을 필요로 완전히의 miRNAs 3의 소스로 엑소 좀과 지질 단백질을 제거하지 마십시오. 이시를 설립 우리는 이러한 단점을 해결하기 위해mple 플라즈마 HDL에서의 miRNA의 분리의 빠른 방법.

주요 목표와 본 연구의 주요 목적은 분리 적혈구없이 초 원심 분리에 의해 HDL-miRNA의 복합체를 분리하는 것이 었습니다, 버피 코트, 엑소 좀, 분비 소포, VLDL, LDL과 지방 단백질 (a)에 간섭하고 정제 된 HDL에서의 miRNAs는 분리. HDL와 이러한 구성 요소의 오염의 간섭이 예상되는 실험 결과 miRNA의 프로파일 데이터를 변경한다. 혈액에서 DNA, RNA와의 miRNAs의 분리로 인해 복잡한 특성으로 매우 어려운 작업입니다. 그것은 항상 세포, 조직 및 장기 샘플 (18)에 비해 추출 및 정제 (의 miRNAs 포함) 핵산의 기술 과제의 많은 제기되고있다. 또한 혈액 세포 순환 존재 상대적의 miRNA 유전자들이있다. 혈액은 18 상대적으로 적게 엑소 좀, 분비 소포 무료 순환의 miRNAs와 함께 HDL에 대한 알려진 캐리어입니다. 따라서, 큰혈액 혈장 샘플 볼륨의 마운트는 HDL-miRNA의 복합체의 처리 및 분리가 필요합니다. 또한 miRNA가 그들의 표적 서열의 짧은 본​​질은 어려운 표준 PCR 올리고 뉴클레오타이드 기술 충분한 특이성을 달성 할 수있다. 혈액의 세포 성분은 항상 온도, 미생물 및 독소 나 스트레스를 포함한 외부 환경의 변화에​​ 대응하여 miRNA의와 mRNA의 분비 알고 있습니다. 또한 혈액 클레아 제, RNases, 순환 단백질과 다른 효소의 존재는 이러한 miRNA의 분리에 영향을 미칠 것입니다.

QRT-PCR의 ΔΔCt 방법을 사용하는 동안 순환 miRNA의 증폭은 데이터 정상화를위한 β - 굴지 또는 GAPDH 같은 잘 설립 알려진 하우스 키핑 유전자 없다. 이는 다시 혈액의 혈청 또는 혈장 (19)를 순환에서 프로파일의 miRNA의 주요 장애물 중 하나 포즈. 일반적으로 짧은 비 코딩 snoRNAs를 사용 snRNAs는 거의 혈액이 m로 표시되지 않습니다내부 통제 유전자로를 활용에 더 어려운 AKE를. snoRNAs 및 snRNAs의 이러한 단점을 해결하기 위해 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 다음과 같이 우리가 내부 통제 유전자와 분석에서 혈청 / 플라즈마 합성 스파이크-에서 컨트롤을 사용하는 기술적 인 문제를 방지 할 수 있습니다. 그것은 어떤 비특이적 증폭 정상화에 도움 변화가 miRNA의 정화 및 PCR 반응 (18) 동안 오류가 발생했습니다. 비록 miRNA의 열화 또는 특정 miRNA의 증폭 신호의 부재의 경우에, 스파이크의 QRT-PCR 반응에서 증폭 상당히 일정하고 균일 코네티컷 값과 예상 된 신호를 제공한다 제어. 세 개의 음성 대조군과 양성 대조군과 함께 제어 증폭의 스파이크를 바탕으로 우리는은 miR-223 유전자에 좋은 최적의 데이터 유효성 검사를 얻었다. 이것은 우리가이 간단한 방법에서 플라즈마 HDL을 순환에서은 miR-223의 좋은 수율을 가지고 있음을 확인.

결론적으로, 우리는 방법 O를 설립혈장 HDL로부터 miRNA의 정화용 β 머 캅토 에탄올의 첨가 F 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC). 이 방법은 몇 가지 장점이있다 : (a) VLDL, LDL 및 HDL 24해야하는 다른 방법과 비교 바닥 초 원심 분리기에 의해 단시간에 분리 - 96 시간 8-11; (b)는 LDL과 HDL 투석, 탈염 / 농축, 24 시간 이상 8,9했다 다른 방법과 비교 1 시간 내에 일어날; 지단백질 (c) 오염 HDL 분획 β 머 캅토 에탄올로 제거되지만 LDL 분획에 사용되는 것은 아니다; (d)는 요구되는 샘플 부피는 모두 단계적 VLDL, LDL에만 한 용액이며 HDL 아이솔레이션 개 시료 부피를 필요로하는 다른 방법과 비교; (전자)은 분리 11시 HDL에 산화 적 손상을 최소화; (F) 12 샘플의 최대 단일 지단백질 분리 분석 실행을 분석 할 수있다; (g) 추출 된 HDL의 250 μL 샘플 볼륨 m을 분석하기에 충분IRNA 농도 / 순도, 아가 로스 겔 전기 영동, 단백질 농도, 마이크로 어레이와 RT-qPCR의 절차. 우리의 방법의 한계는 HDL-miRNA의 작은 비율은 엑소 좀 침전 단계에서 잃을 수 있으며, 필요한 플라즈마 샘플 볼륨이 HDL-miRNA를 격리하는 200 개 이상의 μl를해야한다는 것입니다.

마지막으로, 플라즈마 마이크로 RNA에만 순환 손상 또는 배신자 혈액 세포에서뿐만 아니라 건강한 정상 적혈구와 신체의 지속적인 건강 상태에 의해 영향을받는 다양한 건강과 질환 조직 및 기관을 포함하는 신체의 다른 부분에서 세포로부터 유래하지 (20)이 본 연구는 체계적으로 인간 혈장의 격리 HDL에서 성숙은 miR-223를 정제하고있다. 이 연구는 명확하게 고순도 HDL 플라즈마의 성숙은 miR-223의 수준은 이에 크게 지질 단백질, 리튬에 대한 미래 검사의 임상 적 사용을 촉진, 검출 안정, 재현성 및 개인 샘플 간의 일관성이 있는지 보여줍니다버전, 심장 혈관 및 기타 대사 증후군. 놀랍게도, HDL 플라즈마에서 특히은 miR-223 성숙의 miRNAs는, 아마 잠재적으로 정제 HDL 미르-223의 안정성을 설명 소화와 다른 가혹한 조건을 클레아에 내성이다. RNases에은 miR-223의 저항의 메커니즘은 더 많은 연구를 필요로한다. 물론, 이러한 정제 HDL 플라즈마에서의 miRNA 발현 양상을 연구하는 다양한 질병을 연구 미래 miRNA의 마커에 빛을 흘릴 것입니다. 혈장 HDL 연관된 이러한 마이크로 RNA는 잠재적 임상 진단 바이오 마커로서 사용하고 향후 약을 개인화 할 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes  Becton, Dickinson and Company 366643
Centrifuge Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R  75004261
Densito 30PX densitometer Mettler Toledo MT51324450
ExoQuick solution  Invitrogen 4484451
Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube Thermo Scientific O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuge  Thermo Scientific 46902
Fat Red 7B  Sigma-Aldrich 201618
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K Millipore UFC901008
Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K Millipore UFC800308
QuickGel Lipo kit  Helena Laboratories  3344,3544T
Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL LipoTrol; Helena Laboratories 5069
Rep Prep buffer  Helena Laboratories  3100
RNeasy MinElute spin columns  Qiagen
NanoDrop 1000 analyzer Thermo Scientific
miScript II RT Kit  Qiagen 218161
CFX96 Touch real-time PCR detection system BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit QIAGEN 217184
miScript Primer Assays QIAGEN 141078139
miScript SYBR Green PCR Kit  QIAGEN 218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control QIAGEN 219610
NaOH SIGMA-ALDRICH 480878
0.20 µM sterile syringe filter SIGMA-ALDRICH Z227536

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References

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