Impressionszytologie des Deckels Wiper Bereich

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Muntz, A., van Doorn, K., Subbaraman, L. N., Jones, L. W. Impression Cytology of the Lid Wiper Area. J. Vis. Exp. (114), e54261, doi:10.3791/54261 (2016).

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Abstract

Introduction

Der menschliche Oberlid führt rund 10.000 blinkt täglich 1, mit nur 1 - 2 mm schmaler konjunktivaler Region die Augapfels zu widersetzen . Aufgrund seiner Wischbewegung während des Blink, dieser Teil der Lidrand hat den "Deckel Wischer" Bereich 2 bezeichnet worden. Es wird angenommen, dass die Reibung in diesem Bereich während der gewöhnlichen Blinzeln erhöht wird, aufgrund der Deckel über der Kugel Abwischen. Dies kann eine wichtige Rolle in der Augen Komfort spielen. Kontaktlinsenträger insbesondere Erfahrung Augenbeschwerden und dies ist einer der Hauptgründe für Aufhören Linse 3 tragen. Wenn eine Kontaktlinse auf dem Auge platziert ist, ist der Reibungskoeffizient zwischen dem Linsenmaterial und der Augenoberfläche sich gezeigt , 4 zu ändern. Es gibt Hinweise darauf , dass Trockenheit Symptome auf diese veränderte Reibung 2,5,6 zusammenhängen könnte.

Dieser Verein kann auch in klinisch beobachtbaren Phänomenen reflektiert werden, insbesondere Deckel wipro Epitheliopathie (LWE), auch oberen Lidrand - Färbung (ULMS) 6 genannt. LWE ist ein frühes Zeichen der Augenreizung und ein potentieller Prädiktor für trockene Augenkrankheit. Es wird beobachtet, und durch die Vitalfärbung der oberen und unteren Deckelrandbereichen gemessen. Während dieses Grading - System 2 und ihrer klinischen Gültigkeit (dh Korrelation mit subjektiven Symptomen) noch immer umstritten sind, bleibt Augenbeschwerden ein Rätsel für Kliniker und Wissenschaftler gleichermaßen und, was am wichtigsten ist , eine Unannehmlichkeit für den Patienten.

Bis heute ist wenig über klinisch relevanten Veränderungen in der (Teil-) Zelluläre Anatomie und Physiologie des Bereichs Deckel Wischer bekannt 7 und lediglich ein Bericht macht Gebrauch von zytologischen Methoden 8. Impression Zytologie (IC) ist seit mehr als 40 Jahren beschäftigt Zellen aus der epithelialen Oberfläche des Bulbus oder Tarsalbindehaut durch Anwendung einer 9,10 Membran zu sammeln. Nach dem Entfernen erfahren die anhaftenden Zellen cytological Färbung und mikroskopische Bildgebung. Aufgrund der anatomischen und zellulären Unterschiede im Deckel Wischbereich erfordert diese Technik Optimierung.

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Protocol

Ethik-Anweisung: Vor der Zellen aus menschlichen Patienten zu sammeln, informierte Zustimmung und Ethik Genehmigung eingeholt werden muss.

1. Bereiten Sie Stain

HINWEIS: Bereiten Sie Fleck am Tag des Experiments.

  1. Werden 5 ul Ethidium (oder 4 & mgr; M) und 5 & mgr; l Calcein AM (oder 4 & mgr; M) zu 2,5 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) in 15 ml Zentrifugenröhrchen; mischen. Wickeln Sie in Aluminiumfolie vor Licht und lagern bei RT bis zur Verwendung zu schützen.

2. Sammeln Zellen

  1. Entfernen Zellkultureinsätze aus ihrer Verpackung und Beschriftung für jede Augenlid abgetastet werden. Mark Orientierung der Zellsammlung auf der Seite der Membran Kunststoffhalter mit Permanentmarker. Conduct Spaltlampe Inspektion bei mäßiger Vergrößerung (etwa 20fach) eine angemessene Gesundheits der Region zu bestätigen IC zu unterziehen.
  2. Einen Tropfen Lokalanästhetikum (0,5% Proparacainhydrochlorid) im unteren Bindehautsack von each Auge und weisen Teilnehmer Augen zu halten für eine Minute geschlossen.
  3. Evert oberen Deckel Auge und halten Sie ihn durch die Wimpern; Kontakt mit dem Deckel Wischbereich zu vermeiden.
    Optional: die Hilfe eines sekundären Ermittler kann diesen Schritt auszuführen, erforderlich.
  4. Anwenden Membran senkrecht auf dem Mittelteil des Deckels Wischbereich mit minimalem Druck.
  5. Halten Membran anstelle 3 - 5 sec. Beachten Sie die Membran durchscheinend im Kontaktbereich. An diesem Punkt, entfernen Sie die Membran und ermöglichen dem Teilnehmer Deckel zu "kippen" zurück an ihren Platz.
  6. Unverzüglich einem Tropfen PBS auf die Probe anzuwenden, um es zu verhindern das Austrocknen. Membran schaltet lässig und sollte nicht drehen opaque jederzeit, da dies Trocknen angibt. Haben die Sekundär Ermittler gehen sofort mit der Bearbeitung der Proben (Abschnitt 3).
  7. Führen Prüfung endgültig Auge Integrität der Bindehaut zu gewährleisten. Dispense Augen Schmierstoffe und anweisen Teilnehmerreiben sich die Augen zu vermeiden, bis betäubende Wirkung nachlässt (ca. 15 min.).

3. Probenverarbeitung

  1. Mit Mikro-Schere, schneiden Sie die Membran in die Hälfte (die eine Hälfte für jede der Downstream-Analysen), die senkrecht durch die Mitte der Zellsammlung. Schneiden Sie entlang der äußeren Rand einer Membran Hälfte aus dem Kunststoffhalter zu trennen; vermeiden Wechselwirkung mit den gesammelten Zellen auf der Membran, auch sichergestellt wird, dass die Membran nicht auf sich selbst falten wird.
  2. Sichern Sie die Membran Pinzette vor dem vollständigen Lösen von dem Halter verwenden. Platz Membran in markierte 2 ml Zentrifugenröhrchen mit 500 ul 95% (v / v) Ethanol und lassen Sie für mindestens 20 Minuten bis maximal 2 Stunden zu beheben, bevor die Verarbeitung (Abschnitt 4.2).
  3. Unmittelbar separate zweite Hälfte der Membran (wie in Abschnitt 3.2 beschrieben) und prompt mit Abschnitt 4.1 fortfahren.

4. Probenfärbungs

  1. Immunocytochemical Anfärben
    1. Vorsichtig Membran in 35 mm Glasboden Kulturschale mit Sammlung Seite nach unten; gewährleisten Membran ist flach.
    2. Je 20 ul immunzytochemischer Zusammensetzung Fleck versammelt in Abschnitt 1 auf der Membran. Wenn Probe Locken, verwenden Sie Einweg-Pipettenspitzen vorsichtig die Membran flach an den Kanten nach unten drücken. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Zellsammelgebieten.
    3. Sanft decken die Membran mit Deckglas. Vermeiden Sie unnötige Bewegung der Probe. Deckel Schüssel mit Deckel und Dichtung mit Labor-Film an den Rändern. Nicht Transparenz der Schale (oben und unten) und die Sichtbarkeit der Probe behindern. Beschriften mit Labor-Marker.
    4. Unmittelbar gehen mit Bildgebung (Abschnitt 5.1), dann wieder auf Abschnitt 4.2 mit zytologische Färbung der anderen Hälfte der Membran fortzusetzen.
  2. Die zytologische Färbung
    1. Allmählich Membran Hydrat langsam 500 ul destilliertem Wasser zu dem Rohr Zugabe used zur Fixierung in Abschnitt 3.4. Absaugen Inhalt mehrmals in Pipettenspitze zu mischen, dann Inhalt zu entfernen.
    2. In 500 ul destilliertem Wasser. stehen lassen für ein paar Sekunden, dann entfernen. In 500 ul alcianblau und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen Sie 3 aufeinanderfolgende 500 & mgr; l destilliertes Wasser spült oder bis die Flüssigkeit spült klar.
    3. In 500 ul Hematoxylin # 1 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen in drei aufeinander folgenden 500 & mgr; l destilliertes Wasser Spülungen oder bis die Flüssigkeit spült klar. Entwässern (Rückseite der Abschnitt 4.2.1) durch die klare Flüssigkeit abgesaugt.
    4. In 500 ul Papanicolaou OG-6 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen Sie einen 500 & mgr; l 95% (v / v) Ethanol spülen.
    5. In 500 ul Papanicolaou EA-65 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen stain und führen 3 aufeinanderfolgende 500 & mgr; l 95% (v / v) Ethanol Spülungen.
    6. Fully dehydratisieren drei aufeinanderfolgende 500 & mgr; l 100% Ethanol Spülungen verwendet. Mit TWEezers, entfernen Probe aus der Lösung; vermeiden Sie das Berühren Zellsammelgebiete.
    7. Legen Membran auf Glasobjektträger; diese Zelle Sammelleitung sicherzustellen, ist entweder parallel oder senkrecht Rand zur leichteren Ausrichtung während der Bildgebung zu gleiten.
    8. Einen Tropfen von 100% Ethanol und Deckel mit Glas rutschen. Unmittelbar gehen mit Bildgebung (Abschnitt 5.2).

5. Beispiel Imaging

  1. Imaging Fluorescent Immunzytochemische Stains
    1. Verwenden eines konfokalen Laserscanning - Mikroskops (CLSM) 11 oder Fluoreszenzmikroskop 12, mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet ist , mit einem Computer verbunden Software eine Bildaufnahme ausgeführt wird . Aufgrund der Proben innerhalb Kulturschalen enthalten ist, kann ein umgekehrtes Mikroskop erforderlich sein.
    2. Set up Mikroskop 11,12 nach Absorptions- und Emissionsspektren von Ethidium Homodimer-1 (528/617 nm Ex / Em maxima in Gegenwart von DNA) und Calcein AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
    3. Wählen Sie die kleinste Vergrößerung des Mikroskops (zB 2.5X Objektiv) und aktivieren Sie den Digital - Imaging - System; beachten Sie die auf dem Computermonitor angezeigt Probe.
    4. Überprüfen Sie Probe für zelluläre Funktionen von Interesse.
    5. Wählen Sie die gewünschte Mikroskopvergrößerung und Bilder aufzunehmen, Imaging-Software.
    6. Speichern von Dateien in entweder nativ Mikroskop - Dateiformat oder ein unkomprimiertes Dateiformat (zB * .raw, * .tif).
  2. Imaging zytologische Stains
    1. Mit einem Standard-Laborhellfeldmikroskop ohne Filter, mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet ist, mit einem Computer verbunden Software eine Bildaufnahme ausgeführt wird.
    2. Platz und Schloss Glasträger (aus Schritt 4.2.8) auf Mikroskoptisch. Rehydrieren Probe mit 100% Ethanol je nach Bedarf über den gesamten Abbildungsverfahren.
    3. Wählen Sie die kleinste Vergrößerung des Mikroskops (zB 2.5X Objektiv) und aktivieren the Digital-Imaging-System; beachten Sie die auf dem Computermonitor angezeigt Probe.
    4. Stellen Sie sicher, Zellsammlung ist entweder mit X oder Y-Achse des Mikroskoptisch Steuerung ausgerichtet. Stellen Sie, wenn nötig, durch das Deckglas zu entfernen und durch Drehen der Probe mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette.
    5. Unter Verwendung der Imaging-Software, Capture-Bild (er) der gesamten Probe mit dem niedrigsten Mikroskopvergrößerung.
    6. Wechseln Sie zu moderaten Mikroskopvergrößerung (zB 10 - 20fach - Objektiv) und justieren Mikroskop Lichtquelle und Software Abbildungsparameter (Belichtung, Kontrast, Weißabgleich, etc.), und deaktivieren Sie die automatische Software Metering. Speichern Sie diese Einstellungen für die zukünftige Verwendung.
    7. Bestimmen Sie Anfangs- und Endpunkte von Scan (zB oben links und unten rechts Ecken der Zellsammlung).
    8. Unter Verwendung der Imaging-Software, Capture-Bild (er) der gesamten Zelle Sammelbereich innerhalb der Anfangs- und Endpunkte. Stellen Sie sicher, 20% von Seite zu Seite und von oben nach unten überlappen between alle benachbarten Bildern.
    9. Speichern von Dateien mit dem nativen Mikroskop - Dateiformat oder ein unkomprimiertes Dateiformat (zB * .raw, * .tif).
    10. Generieren endgültige Panoramabild mit automatisierten Stitching - Software der Wahl (zB Adobe Photoshop Elements). Verwenden Sie Referenzbilder im Schritt genommen 5.2.5), um die Genauigkeit der automatischen Heften im endgültigen Bild zu bestätigen.

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Representative Results

Die Zellkulturmembran über den Kunststoffhalter aufgespannt ist ein praktisches Werkzeug für Handheld-Sammlung von Epithelzellen aus dem Deckel Wischer Konjunktiven. Dieses Verfahren eliminiert die Notwendigkeit für zusätzliche sterilisierten Instrumente typischerweise verwendet zur Vorbereitung und IC Membranen verarbeiten. 1 ist die IC des Deckels Wischbereich stellt einen Zellkultureinsatz verwendet wird . Wir optimiert zwei verschiedenen Färbungsprotokolle, die sich gegenseitig ergänzen Epithelzellen vom Deckel Wischbereich auf eine neuartige Art und Weise zu charakterisieren. Fluorescent immunzytochemische Farbstoffe Esteraseaktivität zeigen, ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen und Nukleinsäuren, die Färbung von denen reflektiert Zellmembran Kompromiss wie in Figur 2 gezeigt. Die zytologische Färbeprotokoll für eine feine Unterscheidung zwischen Keratinisierung Grad ermöglicht. Figur 3 zeigt den Übergang zwischen niedrigen Verhornung in der Tarsalbindehaut und erweiterte Keratinrung im Deckel Wisch Konjunktiva und Epidermis. Panorama-Abbildung der Zytologie-gefärbten Zell Sammlungen ermöglicht die Analyse des gesamten Sammelgebiet, wie auf eine ausgewählte Region von Interesse entgegen. Die Bildauflösung ist ausreichend für die nukleare Ebene Zoomen; Zellmorphologie kann mit Genauigkeit bestimmt werden. Abbildung 4 das letzte Bild einer zytologisch gefärbten Zellsammlung zeigt, zusammen ca. verwendet genäht. 100 verschiedene Dateien mit hoher Auflösung. Diese Tools können die Wirkung von Reibung und / oder trockenes Auge auf neuartige Weise zu beurteilen, eingesetzt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Impressionszytologie des Deckels Wiper Area. Impressionszytologie am Deckel Wischbereich durch Umstülpen des oberen Deckels ausgesetzt durchgeführt. Membran verwendet wird die Zellkultur-Einsatz, 12 mm, hydrophile PTFE. Beachten Sie die Laschen des Membranhalters, die (im Gegensatz zu vorher zurückgehalten werden kannherigen Studien über die Augapfelbindehaut, in der sie vor der Anwendung entfernt wurden) , wie sie mit der Anwendung der Membran auf die schmale Lidrand nicht stören und tatsächlich Ausrichtung helfen können. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. fluoreszierende Zellen aus dem Deckel Wiper Region. Die konfokale Laser - Scanning - Mikroskopie zeigen , Variation der Zellmorphologie zwischen großen Plattenepithel - Zellen (A) und die kleineren säulen / quaderförmige Zellen (b). Grüne Fluoreszenz von Calcein AM zeigt Esteraseaktivität in dem Zellkörper (dh die Lebensfähigkeit der Zellen). Rote Fluoreszenz von Ethidium offenbart Nukleinsäuren, was anzeigt Zellmembran Kompromisse. Nur wenige Zellen zeigen intensiv grün und keine rote Fluoreszenz, die möglicherweise in dicative der Zellmembran Integrität (c). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die zytologische Färbung der IC Sample. Die Zellen der Region zeigen Deckel Wischer unterschiedlicher Morphologie und verschiedenen Verhornung Grad. Blaue Farbe von kleinen, säulen und quader Zellen mit großen Kernen, im Rand / Tarsalbindehaut gefunden, zeigt keine Verhornung (a); rot / orange Färbung des großen Plattenepithel-Zellen mit kondensierten Kernen des mukokutanen Kreuzung (MCJ / Marx 'Line) und kernlose Zellen der Epidermis stellt erweiterte Verhornung (c). Übergangsfarbe (rot / blau) und die Morphologie der Zellen in dem Deckel Wisch konjunktivale Bereich empfiehlt begrenzt Keratinisierung (b).g3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Composite-Lid Wiper Zellsammlung. Impressionszytologie des Bereichs Deckel Wischer nach zytologische Färbung. Bild zusammengenäht ca. verwenden. 100 einzelne Fotos mit einem Mikroskop und 20x-Objektiv genommen. (A) kleine säulen / quader Epithelzellen der tarsal / marginal Konjunktiva. Die Zellen hier zeigen blau / grün / lila Farbe anzeigt, keine Verhornung; (B) Zellen des Deckels Wisch Konjunktiva, Übergangs- in Morphologie und Fleckenfarbe zwischen den Regionen (a) und (c); (C) große Plattenepithel-Zellen des mukokutanen Kreuzung / Marx 'Linie. Orange Fleck Farbe zeigt einen gewissen Grad der Verhornung und rot / pink zeigen späten Stadium Plattenepithelkarzinom Übergang; (D) Meibum Eindruck; (E) kernlose, verhornten Zellen der Epidermis; (F) Goblet Zelle Eindruck oder Tränenfilm Muzine. Abwärtspfeil zeigt tarsal konjunktivaler Bereich, Pfeil nach oben zeigt an äußeren Deckel. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Impressionszytologie wird typischerweise auf der bulbären Bindehaut durchgeführt, gemischte Celluloseestermembranen. Proben werden aus Schüttgut Blätter zugeschnitten, sterilisiert, aufgetragen und von der Oberfläche entfernt konjunktivale mit einer Pinzette. Unter Verwendung der gleichen Membranmaterial, ein kolbengesteuertes wurde IC - Vorrichtung vor kurzem entwickelt , um die Oberflächengeometrie der bulbären Bindehaut zu entsprechen, und aufrechtzuerhalten konsistente Druck zwischen Anwendungen 13. Diese Ansätze sind ineffizient für die schmale, prominent gewölbtem Deckel Wischbereich (siehe Abbildung 1). Zusätzlich gemischte Celluloseester-Membranen bieten nicht die notwendige Transparenz für Installationen, bei denen Hellfeldmikroskopie notwendig ist, Proben auszurichten vor der Fluoreszenz-Bildgebung. Die Zellkultur-Einsätze in diesem Protokoll vorgeschlagen werden, sind praktisch, weil sie sterilisiert werden, der Größe her ideal und kann manuell gehandhabt werden, ohne weitere Ausrüstung, um sicherzustellen, schnelle Sammlungen. Die Membranen sind aushydrophile PTFE, das für die konfokale Mikroskopie Analyse ausreichende Transparenz gegeben ist.

Insgesamt decken sich morphologischen Merkmale der gesammelten Zellen mit früheren Literaturberichten 7,8,14,15. Ersetzen der häufig verwendete (und chromatisch sehr intensiv) Periodsäure-Schiff (PAS) Fleck mit Alcianblau ermöglicht nachfolgende Papanicolaou Farbstoffe feinere chromatischen Veränderung anzuzeigen, eine detailliertere Sicht auf die zelluläre Ebene Verhornung ermöglicht, als zuvor 7,8 berichtet.

Die mikroskopische Bildgebung von zytologischen Proben in der Regel beinhaltet visuelle Inspektion durch die Okulare und hoher Vergrößerung Fotografie von Strukturen als "interessant". Mit diesem Ansatz "größere Bild" Aspekte der gesamten Sammlung verloren gehen. Niedrige Vergrößerung Schüsse sind in der Regel von minderer optischer Qualität (aufgrund der Vignettierung, Abbildungsfehler, etc.) und die Auflösung ist nicht ausreichend zelluläre Detail darzustellens. Das Panorama-Stitching-Protokoll vorgeschlagen hier, während etwas mehr Zeit in Anspruch, von Vorteil ist, da es einen Überblick über die volle Membran bietet, sowie die Fähigkeit, nukleare Detail zu vergrößern, alles in einem Bild. Quantitative Metriken wie Zellzahl, Kern-zytoplasmatischen (NC) Verhältnis 16 und Entfernungen können hier berechnet werden.

Es gibt drei wichtige Schritte innerhalb des Protokolls, die besondere Aufmerksamkeit erfordern: korrekte Anwendung der Membran auf der Bindehaut (Abschnitt 2.4), das Timing zwischen den Probenverarbeitungsschritte (Abschnitte 2.6 und 3 bis 5) und konsistente Bildparameter für eine optimale Panorama-Stitching (Abschnitt 5.2 0,6 - 5.2.8). Im Gegensatz zu den relativ flachen Augapfelbindehaut weist der Deckel Wischbereich eine ausgeprägte Krümmung, eine schmale Breite von Spanning nur 1 - 2 mm zwischen Epidermis und Fußwurzel Sulkus. Es ist wesentlich, dass die Membran im richtigen Winkel angewendet werden, da dies stark die Art der Zellen gesammelt beeinflussen können. Zweitens membran Druck sollte konsistent zwischen Anwendungen. Der Prüfer sollte daher die notwendige Geschicklichkeit entwickeln, um sicherzustellen, wiederholbare Kollektionen. Nachdem die Proben die Impressionszytologie Technik gesammelt verwenden, wird der Zeitpunkt der Verarbeitung entscheidend. Die Proben sollten nie austrocknen, also erlaubt sein, sollte die Membran nicht undurchsichtig (Abschnitte 2.6, 3 bis 5). Während die Probe zytologisches Färbung zu unterziehen kann für eine längere Zeit in der Fixierlösung belassen werden (20 min - 2 h), sollten die immunzytochemische Flecken zugegeben und ohne Zeitverzögerung abgebildet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen so genau wie möglich zu beurteilen. Die Konsistenz der Timing ist auch wichtig für vergleichbare Ergebnisse zwischen den Proben; man sollte darauf abzielen gleich Fixierung und Färbung Zeiten zu halten für alle Proben verglichen werden. Schließlich, um qualitative Panorama - Bilder aus der Zytologie Probe, alle Bildparameter (Mikroskop Lichtintensität, Kamera Belichtung, Kontrast, Weißabgleich etc.) zu erhaltensollte mit der höchsten Vielfalt an Features von Interesse (dh Zelltypen), und alle automatischen Dosierung deaktiviert werden für alle weiteren Aufnahmen (siehe Abschnitt 5.2.6) zu einem repräsentativen Bereich der Probe, kalibriert werden. Der Prüfer sollte darauf abzielen, auch mit entweder der X- oder Y-Achse des Mikroskoptisches der Zellsammlung in Linie zu orientieren. Dadurch wird die Bildaufnahme und Stitching-Prozess erleichtern. Richten Sie zu finden und zu verwenden Besonderheiten auf der Probe (zB Zell Patches, meibum, Schutt, etc.) in den Überlappungsbereichen zwischen benachbarten Bildern. Das Mikroskop Fokus sollte die einzige Einstellung sein zwischen den Aufnahmen zu korrigieren.

Die Begrenzung dieser Technik liegt in der Variabilität der Zellansammlungen, wie ursprünglich von Jalbert 8 beobachtet, die bei der Erlangung konfluenten patches Deckelwischer Zellen eine 67% ige Erfolgsrate ausgewiesen. Der Auftragswinkel bestimmt die Anzahl und Art der Zellen gesammelt. In diesem Stadium ist es ungewiss, whether Sammlung Qualität (dh die Anzahl von Zellen auf der Probe) mit Augengesundheit korreliert. Klinische Studien mit größeren Stichprobengrößen sind notwendig, um die Gültigkeit dieser Technik zu beweisen. Ein weiterer Nachteil liegt in der inhärenten Invasivität der IC-Technik selbst. Die Superior-Zellschichten werden mit Gewalt aus der Bindehaut entfernt und diese Schäden hervorrufen kann. Während die immunzytochemische Flecken bestimmt sind, die Lebensfähigkeit der Zellen zu reflektieren (und Esterase-Aktivität in allen Sammlungen vorhanden ist), ist es unklar, was die rote Fluoreszenz der Zellkerne in unseren Sammlungen zeigen. Gelegentlich meibum (dh Lipide am Lidrand ausgeschieden) und andere Komponenten aus der Augenoberfläche oder Tränenfilm wird dazu neigen , zelluläre Funktionen zu decken und die Analyse erschweren oder unmöglich machen. Das Protokoll könnte mit einem zusätzlichen Spülgang in Xylen modifiziert werden meibum Lipide zu entfernen. Schließlich wird die Wirkung des Anästhetikums Tropfen auf der Bindehautzellen unbekannt.

Erhalten von Daten der Zellstruktur des Deckels Wischbereich hilft, die Korrelation zwischen dem Reibungs überprüfen, die zwischen diesen Zellen und der Augenoberfläche, und subjektiven Komfort auftritt. Dadurch wird wertvolle Erkenntnisse liefern und zukünftigen klinischen Studien ermöglichen die zellulären Besonderheiten von Kontaktlinsenträgern, Patienten mit Deckel Wisch Epitheliopathie, trockene Augen oder Trockenheit Symptome, im Gegensatz zu asymptomatischen Patienten zu erforschen, hoffentlich zu beleuchten das Thema Augenbeschwerden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid Sigma B8438-250ML
Hematoxylin, Gill 1 Sigma GHS116-500ML
Papanicolaou stain, OG-6 Sigma HT40116-500 ml
Papanicolaou stain, Modified EA Sigma HT40232-1L
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies L-3224 contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes
Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) Alcon
Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm EMD Millipore PICM01250 
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-0-20-C

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References

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