Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung

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Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).

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Abstract

Die kanonische Satz von Aminosäuren führt zu einer außergewöhnlich breites Spektrum von Protein-Funktionalität. Dennoch legt die Menge der Rückstände immer noch Beschränkungen auf mögliche Protein-Anwendungen. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können diesen Bereich vergrößern. Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von nicht-kanonischen Aminosäuren. Für ortsspezifischen Einbau, zusätzlich zu den endogenen kanonische translationale Maschinen, eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase-tRNA-Paar muss zur Verfügung gestellt werden, die nicht mit den kanonischen in Wechselwirkung tritt. Folglich, die ein Codon nicht auf eine kanonische Aminosäure zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon, ist ebenfalls erforderlich. Diese Erweiterung des genetischen Codes ermöglicht die Inkorporation eines nicht-kanonische Aminosäure an einer einzigen, gegebenen Stelle innerhalb des Proteins. Die hier vorgestellten Arbeit beschreibt Rückstand spezifischen Einbau, wo der genetische Code innerhalb des endogenen Translationssystem neu zugewiesen wird. Die Translationsmaschinerie einccepts die nicht - kanonische Aminosäure als Surrogat es kanonisch vorgeschriebenen Stellen zu übernehmen, dh alle Vorkommen einer kanonischen Aminosäure in dem Protein werden durch die nicht - kanonische ersetzt. Der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren können die Proteinstruktur verändern, was zu erheblich veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften. Nichtkanonische Aminosäureanaloga wirken oft als Zellwachstumshemmer für Wirte Ausdruck , da sie endogene Proteine ​​zu modifizieren, in vivo Proteinproduktion zu begrenzen. In - vivo - Einbau von toxischen nichtkanonischer Aminosäuren in Proteine ​​besonders herausfordernd bleibt. Hier wird ein zellfreier Ansatz für einen vollständigen Ersatz von L-Arginin durch die nicht-kanonische Aminosäure L-Canavanin dargestellt. Es umgeht die inhärenten Schwierigkeiten der in - vivo - Expression. Darüber hinaus wird ein Protokoll Zielproteine ​​für die Massenspektralanalyse herzustellen ist im Preis enthalten. Es wird, dass L-Lysin dargestellt durch L-hydroxy-Lysin ersetzt sein können,wenn auch mit geringerer Effizienz. Im Prinzip kann jedes nicht - kanonische Aminosäure analog solange eingearbeitet werden , um die vorgestellte Methode unter Verwendung als das endogene in vitro - Translationssystem erkennt.

Introduction

Der genetische Code ist in die Biosphäre universal. Es kodiert für einen Satz von 20 kanonischen Aminosäuren, die manchmal durch selenocysteine ​​1 oder Pyrrolysin 2 verlängert wird. Es ist das Ribosom, das mit Hilfe von tRNAs in Ketten von Aminosäuren, die in Proteine ​​falten den genetischen Code übersetzt. Die funktionellen Gruppen der kanonischen Aminosäuren in Kombination mit posttranslationalen Modifikationen beitragen, zu einem außergewöhnlich breites Spektrum von Proteinfunktion 3,4. Grundsätzlich funktionellen Einschränkungen aufgrund der begrenzten Anzahl von kanonischen Aminosäuren können durch den Einbau von weiteren, nicht - kanonischen Aminosäuren (NCAAs) , die ermöglichen , neue chemische Zusammensetzungen und neue Funktionalitäten 3,4 überwunden werden.

Es gibt zwei sich ergänzende Ansätze für die Einbeziehung von NCAAs: die orts- oder der Rest spezifischen Einbau. Die erste Methode ist mit erheblichen technischen Schwierigkeiten, da die kanonische Satz von Aminoacyl-tRNA-Synthesizeretases (aaRS) und tRNAs müssen durch eine orthogonale aaRS-tRNA-Paar erweitert werden, die nicht mit dem endogenen Translationsmaschinerie interagieren müssen. Basierend auf einer sorgfältigen Engineering, beinhaltet dieser Ansatz die NCAAs als einzelne Punktmutationen an den gewünschten Proteinstellen. Ortsspezifischen Einbau von NCAAs genetisch durch ein Codon codiert wird, die nicht auf eine kanonische Aminosäure (CAA) zugeordnet ist, in der Regel einem Stopcodon 5-9. Dieses Verfahren beinhaltet Änderungen in Funktion an einer bestimmten Stelle , anstatt über das gesamte Protein 10-13.

Im Gegensatz dazu Rückstand spezifischen Einbau stützt sich auf eine fehlerhafte Erkennung der nicht-kanonische Aminosäure durch die kanonische Translationsmaschinerie. Die Einarbeitung erfolgt aufgrund des Fehlens der Substratspezifität der aaRS. Der Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs, auf der Arbeit von Cohen gebaut und Mitarbeiter 14, hat zu wichtigen Anwendungen geführt 3,10, darunter bioorthogonalen Kennzeichnung 15-17 von Proteinenoder Strukturaufklärung von Proteinen in der Röntgenkristallographie 18.

Als natürliche aaRS im Allgemeinen ihre verwandten Aminosäure über eine isostruktureller NCAA, effizient in vivo Rückstand spezifischen Einbau bevorzugen erfordert in der Regel einen auxotrophen Expressionswirt nicht in der Lage die kanonische Analogon der NCAA zu synthetisieren. Die Wirtszellen werden in Wachstumsmedium kultiviert, die nur eine geringe Konzentration des analogen CAA liefert. Seine Erschöpfung in Kombination mit der laufenden Ergänzung mit der NCAA zwingt den Expressionswirt der NCAA in das Modellprotein an mehreren, kanonisch vorgeschriebenen Websites zu integrieren. Im Gegensatz zu den standortspezifischen Ansatz, dies hat in der Regel einen großen Einfluss auf die gesamte Proteinstruktur, was zu einer physikalischen und chemischen Eigenschaften von Proteinen 19,20 erheblich modifiziert. Allerdings sind die meisten der NCAAs sind Wachstumsinhibitoren für den Expressionswirt 3, wie sie in vielen anderen prot eingebaut sindeins neben denen von Interesse während der rekombinanten Genexpression. Dies zeigt deutlich begrenzt die in - vivo - Ansatz. Die in - vivo - Einbau von Aminosäuren, die toxisch sind oder starken Einfluss auf die Proteinstruktur bleibt besonders anspruchsvoll . Allerdings sind diese Moleküle zu den vielversprechendsten Proteine ​​mit außergewöhnlichen Funktionen zu konstruieren.

Ein Beispiel ist die toxische, nicht-kanonische, natürlich vorkommenden L-Canavanin (Can), einem Analogon von L-Arginin (Arg). Es wirkt sich und blockiert Arg assoziierte regulatorische und katalytische Reaktionswege, und seine Präsenz in der lebenden Zelle kann zum sofortigen Tod 3,21-23 führen. Sein Einbau in Proteine ​​an Arginin Positionen kann die Proteinstabilität 21-23 reduzieren. Aufgrund der resultierenden Toxizität Expression von Canavanin Proteine ​​in Escherichia coli (E. coli) und andere übliche Expressionswirte enthält bleibt eine Herausforderung. Aus diesen Gründen vollständig in vivo incorporation von Can an allen Arg Positionen hat in geeigneter Weise nur einmal 24, unter Verwendung eines erarbeiteten Einzelproteinproduktionssystem bestätigt. Jedoch wurde als Antikrebsmittel 25-27 und als Stimulator für Autoimmunerkrankungen bei Menschen 28 vorgeschlagen. Darüber hinaus ist es Gegenstand verschiedener Studien über seine anti-metabolischen, antibakterielle, antimykotische und antivirale Eigenschaften 25. Diese Eigenschaften erhöhen die Nachfrage nach effizienten und einfach zu führen Methoden zum Ausdruck bringen können Proteine ​​für pharmazeutische, medizinische und funktionelle Studien enthalten.

Obwohl viele Probleme , die zellfreie Expression in vivo - Produktion verbunden sind , unter Verwendung von Systemen umgangen werden kann, wurden in vitro Rückstand spezifische Ansätze nur bisher schlecht erforscht. Der zellfreie rückstandsspezifischen Einbau eines L-Tryptophan Analog 29 und mehrere NCAAs 30 berichtet. Diese Verfahren basieren auf der hoch efficient T7 RNA-Polymerase. Die T7-RNA-Polymerase beinhaltet bakteriophagenspezifischer wie Transkription, wodurch genetische Funktionalität im Vergleich zu endogenen Transkription reduzieren.

Der komplette Rest spezifischen Einbau in ein Modellprotein in allen Arg Positionen wurde vor kurzem 31 berichtet, 32 eine zellfreie Expressionssystem. Eine leichte Modifikation des gleichen Systems ortsspezifischen Einbau verschiedener Pyrrolysin Analoga in ein Modell Protein über Stop - Codon Unterdrückung 33 aktiviert. Die verwendete zellfreies System 31-33 basiert auf einer ganzen E. coli Transkriptions-Translations - System. Dennoch ermöglicht es die Proteinexpression so effizient wie in gegenwärtigen Systemen Bakteriophagen (0,5-1 mg / ml von rekombinantem Protein) 32, während ein Großteil der Original - Transkriptions-Translations - Modularität beibehalten wird .

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, wie die residue spezifischen Einbau von NCAAs realisiert werden, indem diese alle E. coli zellfreien System 32. Darüber hinaus weitere Schritte, um die exprimierten Proteine ​​für entsprechende Auswertung mittels HPLC-ESI-Massenspektroskopie vorgeschlagen vorzubereiten. Um die Eigenschaften dieser zellfreien System zu erweitern, geht diese Arbeit nicht nur beziehen sich auf die veröffentlichten Einbau von 31 , sondern auch neue Daten im Zusammenhang mit der nicht - kanonischen L-Lysinanalogon L-Hydroxy-Lysin.

Das folgende Protokoll für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs ist eine Anpassung eines Protokolls kürzlich in JoVE 34 veröffentlicht. Letzteres Protokoll beschreibt, wie hocheffiziente zellfreien Expression mit Standard-Aminosäuren durchzuführen. Außerdem stellt es die Herstellung des rohen zellfreien Extrakt, die Aminosäurelösung, die Energie-Stammlösung und der Energiepuffer in diesem Ansatz verwendet. Das folgende Protokoll konzentriert sich auf die veränderten Schritte im Vergleich zum vorherigen protokoll, um den Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs zu ermöglichen. Kalibrierte Pipetten, schwach bindende Pipettenspitzen und Mikrozentrifugenröhrchen werden zur Herstellung empfohlen. Im Folgenden IUPAC-Abkürzungen für die Aminosäuren verwendet.

Protocol

Achtung! Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der verwendeten Chemikalien sind akut toxisch. Persönliche Schutzausrüstung ist nicht erforderlich (eyeshield, Staubmaske, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe) sowie die Arbeit in einem Abzug.

1. Aminosäurelösung Vorbereitung

  1. Stammlösung Vorbereitung der NCAA (168 mM)
    HINWEIS: Die Stammlösung Vorbereitung der NCAA für die Arg analog beschrieben als ein Beispiel. entsprechend anpassen die Werte für andere NCAAs.
    1. Legen Sie ein 1,5 ml Reaktionsgefäß auf einer Mikrowaage. Abwiegen 46,1 mg der im Inneren des Reaktionsrohrs zur Herstellung von 1 ml einer 168 mM Lösung. Verwenden Sie eine sterile Mikros. Für eine racemische Mischung der NCAA, die doppelte Konzentration der Stammlösung.
    2. In 977 ul sterilem ddH 2 O. Gründlich vortexen, bis Can in vollständige Auflösung.
      HINWEIS: Bei einer Gesamtlösungsvolumen von 1 ml, das physikalische Volumen des gelösten Aminosäure kompensiert werden. Für jede der Aminosäuren, schätzen die Hälfte der festen Masse in mg als das entsprechende Volumenzunahme in ul 35 (100 mg Feststoff wird mit einem Volumen von 50 & mgr; l in der Lösung nehmen). Die meisten Aminosäuren können bei dieser Konzentration gelöst werden. Wenn nicht, ist die Konzentration bis zur vollständigen Auflösung.
    3. Direkt am Stammlösung für die Herstellung der Aminosäurelösungen in Abschnitt 1.2 oder Blitzeis es in flüssigem Stickstoff NCAA verwenden und lagern Sie es bei -20 ° C. ACHTUNG! Zur Sicherheit tragen eine eyeshield und Cryo-Handschuhe von Flüssigkeit geschützt werden Stickstoff spritzt.
  2. Herstellung der Aminosäurelösungen
    HINWEIS: Für die Herstellung der Aminosäure-Lösungen verwenden, um die Aminosäure-Sampler die L-Isomere der 20 CaaS in separaten Lager BereitstellungLösungen (1,5 ml, gepuffert mit HEPES / KOH, <0,1% NaN 3, pH 7,5), jeweils in einer Konzentration von 168 mM, mit Ausnahme von L-Leucin (140 mM). Für eine hausgemachte Herstellung dieser Stammlösungen (mit KOH gepuffert), folgen Sie diesem Protokoll 35.
    1. Tauen Sie die Stammlösungen der 20 CaaS (Aminosäure - Sampler oder hergestellt nach 35) und der NCAA (hergestellt in Abschnitt 1.1) bei RT.
    2. Nach dem Auftauen verwirbeln häufig die Stammlösungen alle gefällten Aminosäuren wieder zu lösen. Da einige Aminosäuren schwieriger zu lösen sind, brüten sie in einem Heizblock bei 37 ° C bis zur vollständigen Auflösung. Cys kann nicht vollständig auflösen. Legen Sie alle Aminosäuren auf Eis, mit Ausnahme von Asn, Phe und Cys - halten diese bei RT Fällung zu vermeiden.
    3. Verwenden Sie die folgenden Werte ein Siebtel des gesamten Kit verwenden.
      HINWEIS: Nach unten skalieren in geeigneter Weise mit kleineren Volumina zu arbeiten und Teile des Kits für weitere Experimente zu speichern. Scale up für IncorporatIon NCAAs in Modellproteinen in großem Maßstab. Um wiederholtes Auftauen zu verhindern, die die Stabilität der Aminosäuren zu verringern wahrscheinlich aliquotieren die einzelnen Aminosäure-Stammlösungen in Volumina von 200 & mgr; l. Diese 200 ul aliquoten Volumen und die aliquoten Mengen in Schritt 1.2.4.1 Konto für Verluste durch Pipettieren verwendet.
    4. Zuerst bereiten eine Aminosäure-Master-Mix-Lösung, die 1.2.4.3 in Schritt gespalten werden, um die Herstellung von 3 unterschiedlich zusammengesetzte Aminosäurelösungen (Abschnitte 1.2.5 - 1.2.7) zum Abschluss zu bringen. Bei diesen Lösungen konzentrieren sich alle Aminosäuren an 6 mM, mit Ausnahme von Leu (5 mM).
      1. Transfer 1,4 ml sterilem ddH 2 O in einen 15 ml - Zentrifugenröhrchen. Legen Sie es auf Eis. In 175 ul jeder Aminosäure-Stammlösung. In einer nach dem anderen, mit Ausnahme der Stammlösung des CAA (zB Arg) durch die NCAA ersetzt werden (zB kann). Gründlich vortexen nach jeder Zugabe und setzen Sie die Lösung wieder auf dem Eis.
        HINWEIS:Leu ist 5 mM in den 3 unterschiedlich zusammengesetzte Aminosäurelösungen, im Vergleich zu 6 mM für die anderen Aminosäuren. Die reduzierte Konzentration verringert nicht die Expressionseffizienz. Skalierung bis zu 6 mm als gut geeignet.
      2. Übertragen Sie die Aminosäure-Stammlösungen in folgender Reihenfolge zu vermeiden Fällung: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu und Cys. Denken Sie daran, nicht die Stammlösung des CAA hinzufügen (zB Arg), die mit dem NCAA analog (zB kann). Schließlich gründlich Wirbel. bei 37 ° C inkubieren die Lösung so klar wie möglich zu machen.
      3. Split diese Aminosäure Master-Mix-Lösung in drei gleiche Volumen von 1,35 ml. Übertragen jedes der geteilten Volumina in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Halten Sie sie auf Eis.
    5. Bereiten einer Aminosäurelösung, die jeweils in einer Konzentration von 6 mM aller 20 Caas besteht, mit Ausnahme von Leu, die 5 mM ist. Zum ersten Band of 1,35 ml, als Ergebnis der Spaltung in Schritt 1.2.4.3, fügen Sie 50 ul der 168 mM Stammlösung des CAA (zB Arg), die mit dem NCAA analog (zB kann). Gründlich Wirbel.
      1. Setzen Sie auf dem Eis zurück. Aliquotieren diese 1,4 ml Lösung in Mengen von 16 & mgr; l in die Reaktionsrohre. Beachten Sie, dass diese Lösungsvolumen auf 85 Aliquots ungefähr führt. Beschriften Sie diese Teilmengen "+ CAA" (zB + Arg).
      2. Blitzeis die Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. ACHTUNG! Zur Sicherheit tragen eine eyeshield und Cryo-Handschuhe aus flüssigem Stickstoff Spritzern geschützt werden.
    6. Bereiten Sie eine Aminosäurelösung , die von 19 CaaS mit Ausnahme der CAA zusammengesetzt ist (zB Arg), die mit dem NCAA analog (zB Can). Fügen jede Aminosäure in einer Konzentration von 6 mM, mit Ausnahme von Leu (5 mM).
      1. Je 50 ul sterilem ddH 2 O auf das zweite Volumen von 1,35 ml, als Ergebnis des Spaltin Schritt 1.2.4.3. Gründlich vortexen und wieder auf Eis gelegt. Aliquotieren diese 1,4 ml Lösung in Mengen von 16 & mgr; l in die Reaktionsrohre. Beachten Sie, dass diese Lösungsvolumen auf 85 Aliquots ungefähr führt. Beschriften Sie diese Teilmengen "- CAA" (zB - Arg).
      2. Blitzeis die Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. ACHTUNG! Zur Sicherheit tragen eine eyeshield und Cryo-Handschuhe aus Stickstoff Spritzern geschützt werden.
    7. Bereiten Sie eine Aminosäuremischung , die 19 CaaS und der NCAA enthält (zB Can), die die kanonischen ersetzt (zB Arg). Fügen jede Aminosäure in einer Konzentration von 6 mM, mit Ausnahme von Leu (5 mM). Bis zum letzten 1,35 ml Volumen, als Ergebnis der Spaltung in Schritt 1.2.4.3, fügen Sie 50 ul der 168 mM Stammlösung des NCAA (zB Can). Beschriften Sie es "+ NCAA" (zB + Can). Gründlich vortexen und wieder auf Eis gelegt.
      1. Aliquotieren diese 1,4 ml Lösung in Mengen von 16 & #181; l in die Reaktionsrohre. Beachten Sie, dass diese Lösungsvolumen auf 85 Aliquots ungefähr führt. Beschriften Sie diese Teilmengen "+ NCAA" (zB + Can).
      2. Blitzeis die Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. ACHTUNG! Zur Sicherheit tragen eine eyeshield und Cryo-Handschuhe aus Stickstoff Spritzern geschützt werden.
        HINWEIS: Die 16-ul-Aliquot Mengen verwendet in den Schritten 1.2.5.1, 1.2.6.1 und 1.2.7.1 sind etwas höher als für Verluste durch Pipettieren Konto erforderlich.

2. Energiepuffer Vorbereitung

HINWEIS: Jede Charge Rohextrakt ist einzigartig und erfordert Konzentrationen von Mg- und K-Glutamat - 34 optimiert. Der Rohextrakt aliquoten Volumen ist abhängig von der Proteinkonzentration 34. Verwenden Sie die mitgelieferte Berechnungsvorlage (Supplemental Material 1) für unterschiedliche Werte. Finden Sie weitere Anweisungen in Supplemental Material 1 Figur Legende explaining wie diese Vorlage zu verwenden.

  1. Herstellung und Lagerung bei -80 ° C , um die 14x Energielösung und Rohextrakt Aliquots nach dem unmodifizierten Protokoll 34. Kalibrieren Sie den Rohextrakt in Abhängigkeit von den Mg- und K-Glutamat - Konzentrationen für eine optimierte Expressionseffizienz 34.
    HINWEIS: Die Endzusammensetzung 14x Energielösung: 700 mM HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12,6 mM CTP, 12,6 mM UTP, 2,8 mg / ml tRNA, 3,64 mM CoA, 4,62 mM NAD, 10,5 mM cAMP, 0,95 mM Folinsäure, 14 mM Spermidin, 420 mM 3-PGA.
  2. Thaw auf Eis die 100 mM Mg-Glutamat-Stammlösung, 3 M K-Glutamat-Stammlösung, 14x Energie-Lösung und 40% PEG-8000 den Master-Mix vorzubereiten. Halten Sie sie auf Eis.
  3. Mischungs 9,18 ul 100 mM Mg-glutamat - Stammlösung, 3,06 & mgr; l 3 M K-Glutamat - Stammlösung, 21,86 & mgr; l 14x Energielösung, 15,3 & mgr; l von 40% PEG-8000 und 1,6 & mgr; l sterilem ddH 2 O in einem Reaktionsrohr. Gründlich vortexen diesen Master nach jeder Zugabe mischen, und halten Sie sie auf Eis.
  4. Aliquot der Master-Mix (51 ul) in Mengen von 16 & mgr; l (3 Aliquots) in die Reaktionsrohre. Häufig verwirbeln die Master-Mix während der Aliquotierung. Flash die Aliquots in flüssigem Stickstoff einfrieren.
    HINWEIS: Der 16-ul-Aliquot Volumen sowie die Master-Mix Lautstärke etwas höher als aufgrund Pipettieren Verlusten Rechnung zu tragen erforderlich.
  5. Verwenden Sie ein Sieb, um die Energiepuffer Rohre zu sammeln. Lagern Sie die Röhrchen bei -80 ° C. ACHTUNG! Tragen Sie eine eyeshield und Cryo-Handschuhe aus Stickstoff Spritzern geschützt werden.

3. Vorbereitung und Durchführung von zellfreien Reaktionen für die Rückstandsspezifische Einarbeitung von NCAAs

  1. Zuerst bereiten die DNA - Vektor - Lösung in ddH 2 O.
    1. Für hocheffiziente Proteinexpression, verwenden Sie den Expressionsvektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Klonen Sie das Gen , das für das Modellprotein in diesen Vektor 36,37 </ Sup>.
      HINWEIS: Alternativ können andere Promotoren verwenden , die 70 als auch durch σ erkannt werden, aber beachten Sie, dass die Expressionseffizienz reduziert werden kann.
    2. Transformation 37,38 der Vektor in E. coli - Stamm KL 740 32 (Yale CGCs #: 4382), verstärkt Vektor - DNA 37,39 läutern und die Konzentration der DNA - Lösung 40-42 quantifizieren. Bewahren Sie die DNA-Lösung bei -20 ° C oder direkt verwenden für die zell Gebühr Reaktionsansatz (Schritte 3.4.1, 3.4.2 und 3.4.3).
  2. Kalibrieren Sie den zellfreien Expressionseffizienz in Abhängigkeit von der verwendeten Vektorkonstrukt Konzentration nach dem unmodifizierten Protokoll 34. Verwenden Sie die optimale Konzentration, die für die zellfreie Reaktionsansatz bis zur höchsten Proteinausbeuten führt (Schritte 3.4.1, 3.4.2 und 3.4.3).
    HINWEIS: Die Herstellung von zellfreien Reaktionen wird beispielhaft mit 90 nM Vektor-DNA-Stammlösung verwendet, die in der zellfreien in eine endgültige Vektor Konzentration von 10 nM führtund die Reaktion folgt die obigen optimalen Werte von Mg- und K-Glutamat sowie den Extrakt aliquoten Volumen. Verwenden Sie die Berechnungsvorlage für unterschiedliche Werte.
  3. Auftau auf Eis 3 Rohextrakt Aliquots von jeweils 30 & mgr; l Volumen (hergestellt nach unmodifizierten Protokoll 34), 1 Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "+ CAA" (zB + Arg), 1 Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "- CAA" (zB - Arg) und 1 Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "+ ncaa" (zB +) Kann (hergestellt in Abschnitte 1.2.5 - 1.2.7), 3 Energiepuffer Aliquots (hergestellt in Abschnitt 2) und dem Vektor - DNA - Lösung ( hergestellt in Abschnitt 3.1).
    HINWEIS: Der Rohextrakt leicht zähflüssig ist und es kann Luftblasen enthalten. Entfernen Sie Luftblasen durch 30 s bei 4 ° C bei 10.000 × g zentrifugiert. Setzen Sie Rohextrakt Aliquots zurück auf dem Eis.
  4. Bereiten Sie drei unterschiedlich zusammengesetzte zellfreien Reaktionen (je 90 & mgr; l Endvolumen) durch Rohextrakt (33.33%) Mischen, EnergiePuffer (16,67%), 1 der 3 unterschiedlich Aminosäurelösung Aliquots zusammengesetzt (16,67%) und Vektor-DNA-Lösung. Fügen Sie optional weitere Biomoleküle (DNA, Proteine, tRNA, etc.), aber entsprechend das Volumen der ddH 2 O reduzieren
    1. Bereiten Sie die Referenzzellfreie Reaktion (90 & mgr; l) Expression des nicht-modifizierten Modellprotein.
      1. Fügen Sie die 15 ul Energiepuffer, 15 ul der Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "+ CAA" (zB + Arg), 10 & mgr; l 90 nM Vektor - DNA - Lösung und 20 ul sterilem ddH 2 O zu den 30 ul rohem Extrakt. Mischen durch Pipettieren von oben und unten und sanft Wirbel nach der Zugabe der einzelnen Inhaltsstoffe.
      2. Aliquot der 90 & mgr; l des zellfreien Reaktions in 15 gleiche Volumina von 6 & mgr; l. Übertragen, jede der 15 Volumen in einem separaten Reaktionsröhrchen. Schließen Sie die Rohre und setzte sie wieder auf dem Eis. Beschriften Sie alle Reaktionsrohre als "CFR (+ CAA)" (zB CFR (+ Arg)).
    2. (zB Arg) noch die nicht - kanonischen analog (zB kann) zugegeben.
      1. Fügen Sie die 15 ul Energiepuffer, 15 ul der Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "- CAA" (zB - Arg), 10 & mgr; l 90 nM Vektor - DNA - Lösung und 20 ul sterilem ddH 2 O zu den 30 ul rohem Extrakt. Mischen durch Pipettieren von oben und unten und sanft Wirbel nach der Zugabe der einzelnen Inhaltsstoffe.
      2. Aliquot der 90 & mgr; l des zellfreien Reaktions in 15 gleiche Volumina von 6 & mgr; l. Übertragen, jede der 15 Volumen in einem separaten Reaktionsröhrchen. Schließen Sie die Rohre und setzte sie wieder auf dem Eis. Beschriften Sie alle Reaktionsrohre als "CFR (-cAA)" (zB CFR (-Arg)).
    3. Bereiten Sie die zellfreie Reaktion (90 & mgr; l) , die angeblich bis Rest spezifisch integrieren die NCAA (zB kann) in das ausgedrückt Modellprotein.
      1. Fügen Sie die 15ul Energiepuffer, 15 ul der Aminosäurelösung Aliquot der Bezeichnung "+ ncaa" (zB + Can), 10 ul von 90 nM DNA - Lösung und 20 ul sterilem ddH 2 O zu den 30 ul Rohextrakt. Mischen durch Pipettieren von oben und unten und sanft Wirbel nach der Zugabe der einzelnen Inhaltsstoffe.
        HINWEIS: Die Expressionseffizienz mit Standard-Aminosäuren kann zur Expression im Vergleich reduziert werden. Bei Bedarf skalieren einfach die zellfreie Reaktionsvolumen.
      2. Aliquot der 90 & mgr; l des zellfreien Reaktions in 15 gleiche Volumina von 6 & mgr; l. Übertragen, jede der 15 Volumen in einem separaten Reaktionsröhrchen. Schließen Sie die Rohre und setzte sie wieder auf dem Eis. Zur Erhöhung der Reaktionsvolumina aliquote entsprechend in weiteren Volumina von 6 ul. Beschriften Sie alle Reaktionsrohre als "CFR (+ NCAA)" (zB CFR (+ Can)).
  5. Inkubieren Sie alle Röhrchen bei 29 ° CO / N.
    HINWEIS: Nur noch geringe Reaktionsvolumina ermöglichen ausreichend Sauerstoff diffusion in die Reaktion, die für eine hocheffiziente Proteinexpression entscheidend ist. Die Reaktionsvolumina von mehr als 10 & mgr; l erfordern aktive Sauerstoffzufuhr durch Rühren 34. Für große Mengen, spaltete die Reaktion in Mengen von weniger als 15 & mgr; l.
  6. Nach dem zellfreien Ausdruck, Pool alle gleich geteilten zellfreien Reaktionen von 6 ul zusammen. Zuerst Pool Alle 15 Split zellfreien Reaktionen von 6 ul der Bezeichnung "CFR (+ CAA)" (zB CFR (+ Arg)). Dann Pool Alle 15 Split zellfreien Reaktionen von 6 ul der Bezeichnung "CFR (-cAA)" (zB CFR (-Arg)). Schließlich Pool Alle 15 Split zellfreien Reaktionen von 6 ul der Bezeichnung "CFR (+ NCAA)" (zB CFR (+ Can)). Zur Erhöhung der Reaktionsvolumina bündeln entsprechend weitere Bände von 6 ul.
  7. Schauen Sie sich die Expressionsniveau des Modellproteins in allen drei gepoolt, unterschiedlich zellfreien Reaktionen zusammengesetzt , indem denaturierende SDS-PAGE 43,44 (Abschnitt 4.1).
    HINWEIS: Verwenden Sie diese metho d für eine vorläufige Bewertung des Einbaus Experiment.
  8. Bereiten Sie die zellfreie ausgedrückt Modellproteine ​​für eine angemessene Analyse über HPLC-ESI-Massenspektroskopie (Abschnitt 4.4). Zuerst reinigen 45 sie (Abschnitt 4.2). Schließlich tauschen Sie den Puffer (Abschnitt 4.3) hohe Hintergrundrauschen während der Massenspektroskopie zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Abschnitte 3.4.1, 3.4.2 und 3.4.3 führen zu typischen zellfreien Reaktionsbedingungen 34: 8,9-9,9 mg / ml Protein (aus Rohextrakt), 4,5-10,5 mM Mg-Glutamat, 40 bis 160 mM K-Glutamat, 1 mM jeder Aminosäure außer Leucin, 0,83 mM Leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP und GTP, 0,9 mM CTP und UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP , 0,068 mM Folinsäure, 1 mM Spermidin, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000 und 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Falls gewünscht, kann ein anderes Verfahren der zellfreie Reaktionsansatz durchgeführt werden, die oberhalb der Reaktionsbedingungen führt.
le "> 4. Vorläufiges Auswertung über SDS-PAGE 43,44 und Herstellung der zellfreien Ausgedrückt Modellproteine ​​für die HPLC-ESI - Massenspektrometrie

  1. SDS-PAGE der zellfreien Reaktionen
    ANMERKUNG: Führen Sie SDS-PAGE für eine schnelle und vorläufige Analyse der exprimierten Proteine ​​ohne weitere Reinigung oder Extraktion, und führen Sie die folgenden Schritte denaturierenden.
    1. Auftauen Proteinstandard auf dem Eis. Sicherzustellen, dass es von Proteinen mit Molekulargewichten ähnlich dem exprimierten Protein-Modell auf dem Gel (Schritt 4.1.13) für seine Lokalisierung besteht.
      HINWEIS: Hier wird die verwendete Standard liefert Proteine ​​über einen weiten Bereich von Molekulargewichten (Myosin: 212 kDa, Maltose-Bindungsprotein-β-Galactosidase: 158 kDa, β-Galactosidase: 116 kDa, Phosphorylase b: 97 kDa, Serumalbumin : 66 kDa, Glutaminsäure-Dehydrogenase: 56 kDa, Maltose-Bindungsprotein: 43 kDa, Thioredoxinreduktase: 35 kDa, Triosephosphatisomerase: 27 kDa, Trypsin-Inhibitor: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, Aprotinin: 7 kDa, Insulin A: 3 kDa, B-Kette: 2 kDa).
    2. Da zellfreien Reaktionen aufgrund der hohen Proteinkonzentration leicht viskos sind, verdünnte sie mit sterilem ddH 2 O von 5 bis 10 mal vor dem SDS-PAGE - Gel entsprechende Migration zu gewährleisten und die Sättigung nach der Färbung zu vermeiden. Um nicht zu viel Probe zu verschwenden, verdünnen 1 ul zellfreie Reaktion in 4 ul sterilem ddH 2 O. Bereiten Sie die Verdünnung in Reaktionsgefäßen, gründlich Wirbel und kurz die Flüssigkeit Spin-down mit einem Mini-Zentrifuge für 2 - 3 Sekunden bei 2000 x g.
    3. In 5 ul 2x Ladepuffer bis 5 & mgr; l der verdünnten zellfreie Reaktion. Gründlich vortexen und Spin-down mit einem Mini-Zentrifuge für 2 - 3 Sekunden bei 2000 x g.
      HINWEIS: Hier wird nach Zugabe, die Biomoleküle in 62,5 mM Tris / Cl gelöst -, 10% Glycerin, 2% SDS und 0,0025% Bromphenolblau bei pH 6,8, eine typische Zusammensetzung. Die Verwendung anderer Lade Farbstoffe, die leicht unterschiedliche Verdünnung Co führen zuBedingungen ausgebracht können auch geeignet sein.
    4. Gründlich vortexen den Proteinstandard und Transfer 15 ul in ein Reaktionsrohr.
      HINWEIS: Je nach Gelgröße und für andere Protein-Standards, kann die empfohlene Volumen von oben abweichen.
    5. Legen Sie die Reaktionsgefäße in einen Heizblock. Prüfen, ob die Deckel der Röhren geschlossen sind. Wärme bei 95 bis 100 ° C für 3 - 5 min. Diese Mitteilung, die Proteine ​​zu denaturieren und SDS-Umwickeln des Protein-Rückgrats zu ermöglichen.
      HINWEIS: Einige Proteinstandards darf nicht beheizt werden und liefert Anweisungen zu sehen.
    6. Inzwischen, übertragen Sie den Laufpuffer in die Gel-Elektrophorese Kammer. Der Inhalt 1x Laufpuffer ist 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS bei pH 8,3 (mit HCl).
    7. Befestigen Sie die Fertig 4 - 20% Steigung Tris-Glycin-SDS-Gel (10 cm x 10 cm x 1 mm) in die Elektrophoresekammer. Nehmen Sie den Kamm und spülen Sie die Vertiefungen mit einer Spritze mit Laufpuffer geladen.
      HINWEIS: Die Gelkonzentration strongly hängt von der Größe und der Art des exprimierten Proteins Modell. Die obige Konzentration trennt die E. coli - Rohextrakt Proteine ​​sowie niedermolekulare Modellproteinen. Selbst gegossen Gele sind ebenfalls geeignet.
    8. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Heizblock. Drehen Sie die Flüssigkeit nach unten mit einem Mini-Zentrifuge für 2 - 3 Sekunden bei 2000 x g. Kurz Wirbel und wiederholen Spinnen für 2 nach unten - bei 2.000 x g 3 Sek.
    9. Übertragen Sie die 15 ul Protein-Standard (24 bis 48 & mgr; g Protein) und 10 & mgr; l (11 bis 22 & mgr; g Protein) jeder Probe in die Vertiefungen und starten Elektrophorese. für ca. 90 min, ein typisches Protokoll 40 mA - Hier SDS-PAGE bei 125 V und 20 durchgeführt.
    10. extrahieren Sie vorsichtig das Gel der Kassette. Bringen Sie sie in die Fixierungslösung (50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% ddH 2 O) für 30 min. ACHTUNG! Methanol ist giftig beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut. Schutzhandschuhe tragen und arbeiten unter einer Abzugshaube.
    11. Übertragen Sie das Gel in Färbelösung (0,025% Coomassie Brilliant Blue G-250, 10% Essigsäure, 90% ddH 2 O). Stain für 60 min.
    12. Transfer des Gels in Entfärbelösung (10% Essigsäure, 90% ddH 2 O) für 60 bis 120 min.
      HINWEIS: Fixierung, Färbung und Entfärbung stark abhängig von der Größe und Art des exprimierten Proteins. Dieses Protokoll gilt für eine breite Palette von Proteinen von relativ kleinen Molekulargewichten 46.
    13. Anschließend verdrängt man das Gel auf eine matte Transparenz auf einem weißen Hintergrund, der für die gefärbten Proteinbanden einen geeigneten Kontrast erzeugt.
  2. Die Reinigung der His-Tag 45 Modell - Proteine ​​aus den zellfreien Reaktionen
    HINWEIS: Für die Proteinreinigung, gibt es mehrere Methoden, die ähnliche Ergebnisse liefern. Dieses Protokoll reinigt zellfreien ausgedrückt Modellproteinen, die ein C-terminales Polyhistidin-tag (His-tag) haben. Es verwendet ein Reinigungs-Kit geeignet für Proteine, die exp sindin den kleinen Reaktionsvolumina von zellfreien Proteinexpression ressed. Es ist identisch für die Reinigung von nativen oder modifizierten Modellproteinen. Somit ist es auf der Grundlage einer einzigen zellfreien Reaktions allgemein beschrieben.
    1. Für eine geeignete HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse, extrahieren und die Modellproteine ​​aus der zellfreien Reaktion zu reinigen und die folgenden Schritte ausführen.
      1. Mischungs gleichen Volumina von 90 bis 150 & mgr; l His-Bindungspuffer und 90 bis 150 ul zellfreien Reaktion. Pipette nach oben und unten, gefolgt von leichter Verwirbelung.
        HINWEIS: His-Bindungspuffer wird empfohlen. Jedoch zellfreien Reaktionsmedium, das ein Ausgangsmaterial, so lange sein kann, wie das Modell Protein löslich ist, pH-Wert zwischen 7,5 bis 8, Imidazol / His-Konzentration <10 mM, die Konzentration von starken Reduktionsmitteln beträgt <15 mM und nicht metall- Komplexbildner sind vorhanden. Wenn Ihr Gemischvolumen 300 & mgr; l überschreitet, spaltete es in gleiche Volumina und aliquoten Thesen Volumina in verschiedene reaction Rohre für die folgenden Reinigungsschritte.
      2. Bereiten Sie die Säulensystem. Gründlich vortexen die Stammlösung des His-Affinitätsgels, bis das Gel Harz vollständig gelöst ist. Übertragung von 250 ul Gelharz in die Säule. Verwenden Sie eine 1 ml Pipettenspitze für das viskose Gel Harz. Platzieren Sie die Säule in ein Sammelröhrchen.
      3. Zentrifugensäule / Sammelrohr 5 - 10 sec bei 13.000 - 15.000 x g. Stellen Sie sicher, dass das Gel Harz vollständig entleert ist. Wenn nicht, verlängern die Zentrifugation Zeit zusätzlich um 5 - 10 s eingestellt, aber darauf achten, dass die Affinität Gel nicht über getrocknet. entsprechend verlängern die Zentrifugation Zeit in Schritten 4.2.1.5, 4.2.1.7 und 4.2.1.9.
        HINWEIS: Das Gel Harz vollständig entleert wird, wenn sie steif wird und kein Überstand bleibt an der Spitze.
      4. Übertragung von 150-300 & mgr; l des zellfreien Reaktions / His-Bindungspuffer auf die Säule. Wenn das Gemischvolumen die empfohlene Volumen überschreitet, aufgeteilt über mehrere Spin-Säulen. Resuspendieren das Gel Harz durch frequent tippen und leichter Verwirbelung bei einer Inkubationszeit von mindestens 2 min. Für Volumina von mehr als 200 & mgr; l, Inkubation für weitere 1 bis 2 min.
        HINWEIS: Eine ausreichende Inkubationszeit ist von entscheidender Bedeutung für die auf das Gel Harz der Modellproteine ​​binden.
      5. Zentrifugensäule / Sammelrohr 5 - 10 sec bei 13.000 - 15.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und legen Sie die Säule wieder in das Sammelrohr.
      6. In 250 ul His-Waschpuffer. Resuspendieren das Gel Harz durch Klopfen und leichter Verwirbelung.
      7. Zentrifugensäule / Sammelrohr 5 - 10 sec bei 13.000 - 15.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und legen Sie die Säule wieder in das Sammelrohr. Wiederholen Sie Schritt 4.2.1.6 und Zentrifuge erneut für 5 - 10 Sekunden bei 13.000 - 15.000 x g.
      8. Die Säule in eine Standard-1,5 ml Reaktionsgefäß. In 150 ul Elutionspuffer und resuspendieren das Gel Harz durch und leichter Verwirbelung tippen. Reduzieren Sie die Lautstärke auf 100 & mgr; l für höhere gereinigtes Modellprotein conzent nach der Elution im nächsten Schritt 4.2.1.9.
        Hinweis: Der Gesamtfluss an gereinigtem Modellprotein kann aufgrund einer möglichen unvollständigen Elution aller harzgebundenen Proteine ​​Gel reduziert werden, wenn der Elutionspuffer Volumen reduziert wird.
      9. Zentrifugensäule / Reaktionsrohr 5 - 10 sec bei 13.000 - 15.000 xg das gereinigte Protein im Elutionspuffer zu verdünnen. Wenn vor geteilt, bündeln alle Lösungen in einer Stammlösung.
      10. Vor der Ausführung des Pufferaustausch, bestimmen die Proteinkonzentration unter Verwendung von Standardverfahren, zB Assay der Bradford 47,48.
        HINWEIS: Bei einer geeigneten HPLC-ESI-Massenspektroskopie (Abschnitt 4.4), verwenden Sie eine optimale Proteinkonzentrationen, die mit den erforderlichen Volumina von 20 in der Regel etwa 0,5 mg / ml sind - 50 & mgr; l. Wenn die Konzentration unter 0,2 mg / ml, konzentriert, um die Proteinlösung nach der Pufferaustausch eine Spinn Vakuumkonzentrator verwenden. In diesem Fall lesen Sie zuerst Abschnitt 4.3.8 in geeigneter Weise den Austausch von Buff anpassener.
  3. Der Pufferaustausch für die HPLC-ESI - Massenspektroskopie
    HINWEIS: Austausch des Puffers His-tag Elution verrauschten in massenspektroskopische Analyse zu vermeiden aufgrund der hohen Konzentration an Imidazol (> 150 mM) und andere Salze wie NaH 2 PO 4 (> 300 mm) oder NaCl (> 50 mM) 49. Der folgende Pufferaustausch-Protokoll verwendet eine prähydratisierten Spinsäulensystem Gelfiltration. Es ist identisch für native oder modifizierte Modellproteinen durchgeführt. Somit ist es auf der Grundlage einer einzigen zellfreien Reaktions allgemein beschrieben. Beachten Sie, dass es andere leicht zu führen Pufferaustauschverfahren, beispielsweise Mini-Dialysekartuschen.
    1. Herstellung von 100 ml Protein Aufbewahrungspuffer (50 mM Tris-Cl pH 8, 100 mM NaCl und 10% Glycerol). Man wiegt in einem autoklavierbaren 100 ml 605,7 mg Tris-Base, 584,4 mg NaCl-Flasche und 10 ml Glycerin hinzu. Füllen Sie auf ca. 80 ml auffüllen und den pH-Wert auf 8 durch einedding NaOH. Stetig die mit einem pH-Meter pH-Wert überprüfen. Schließlich füllen auf die 100-ml-Markierung auf.
      ANMERKUNG: Um diesen Puffer Verwenden Sie eine breite Palette an Modellproteinen zu stabilisieren und nicht die massenspektroskopischen Analyse zu stören, solange HPLC zur massenspektroskopischen Messung vor durchgeführt wird. Jedoch abhängig von der Art des exprimierten Modellprotein, verwenden andere Puffer, die besser geeignet sein könnten. Wenn Ihr Zielprotein bei pH 8 nicht stabil ist, den pH - Wert entsprechend. Keine höheren Glycerinkonzentrationen verwendet werden .
    2. Warm up die Gelfiltrations-Spin-Säulen für mindestens 15 min auf RT.
    3. Resuspendieren vorhydratisiert Gel durch leichtes Klopfen oder Verwirbelung und Luftblasen zu entfernen.
    4. Entfernen Sie zuerst die untere Kappe und dann die obere Kappe nehmen. Platzieren der Säule in eine Waschröhre (mindestens 2 ml). Übertragen Sie die Spalte / Spülrohr in die Zentrifuge. Jede Spalte besitzt eine Orientierungsmarke. Zentrifuge bei 1000 × g für 2 min das Gel-Speicherpuffer zu entfernen. Scheibeard den Durchfluss.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, in dieser Reihenfolge, um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass die Säule die gleiche Ausrichtung in allen weiteren Zentrifugationsschritte hat.
    5. In den 400 ul des Proteins Speicherpuffer auf. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g. Wiederholen Sie diesen Vorgang vollständig das Protein Speicherpuffer in Gel laden. Sorgfältig in den 100 ul der Lösung des gereinigten Modellprotein auf. Pipette direkt auf die Mitte des Gelbett.
      HINWEIS: Die Lösungsvolumina von gereinigten Proteinen, insbesondere von modifizierten Proteinen, könnte höher sein. Split solche Lösungen über mehrere Pufferaustauschsäulen. Proteine ​​müssen haben Molekulargewichte von mehr als 5 kDa für diese Art von Pufferaustausch.
    6. Platzieren Sie die Säule in ein Sammelröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 1000 x g.
      Hinweis: Dieser Schritt zur Verdünnung des gereinigten Modellproteins führt in dem Protein-Speicherpuffer. Wenn vor geteilt, bündeln alle Lösungen in einer Stammlösung.
    7. Blitzeis the Proteinlösung in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C oder es direkt über Massen HPLC-ESI - Spektroskopie 50 (Abschnitt 4.4) zu analysieren. ACHTUNG! Tragen Sie eine eyeshield und Cryo-Handschuhe aus Stickstoff Spritzern geschützt werden.
    8. Führen Sie die folgenden Schritte des Protokolls der Proteinlösung unter Verwendung eines Spinn Vakuum - Konzentrator zu konzentrieren , die sorgfältig das Lösungsmittel 51 verdampft.
      HINWEIS: HPLC-ESI-Massenspektroskopie Diese Schritte sind erforderlich, wenn die Proteinkonzentration für zu niedrig (<0,2 mg / ml). Das Volumen der Lösung und Modellproteinkonzentration ist in etwa die gleiche vor und nach dem Pufferaustausch. Der Konzentrationsprozess wird durch das folgende Beispiel beschrieben: Nach dem His-Tag-Reinigung wird das Modellprotein in 100 & mgr; l His Elutionspuffer gelöst wird (Schritt 4.2.1.9) und hat eine Konzentration von 0,07 mg / ml (Schritt 4.2.1.10) .
      1. Um sicherzustellen, dass die Proteinkonzentration und das Lösungsvolumen sind nach der Verdampfung beimindestens 0,2 mg / ml und 20 & mgr; l bzw. zu verdünnen, bevor Pufferaustausch, der Pufferspeicherprotein in Schritt hergestellten 4.3.1 mindestens das Dreifache, aber höchstens das Fünffache. verdunsten Ebenso im folgenden mindestens zwei Drittel (66,67 ul) oder höchstens vier Fünftel (80 ul).
        HINWEIS: Die Verdünnung des Proteins Speicherpuffer, bevor der Pufferaustausch entscheidend ist zu berücksichtigen, daß die Konzentrationswerte dieses Puffers (Schritt 4.3.1) noch trotz der Verdampfung realisiert wird. Nach der Verdünnung des Speicherpuffer Protein zuerst den Pufferaustausch durchzuführen (Schritte 4.3.2 - 4.3.6), bevor Sie die folgenden Schritte 4.3.8.2 Ausführung - 4.3.8.4.
      2. Nach dem Pufferaustausch, legen Sie die komplette 100 ul Modell Proteinlösung in einem offenen Rohr in den Spinn Vakuum-Konzentrator.
        HINWEIS: Das Modell Protein wird in den verdünnten Protein-Speicherpuffer gelöst. Neigen Sie es in Richtung der Drehmitte Flüssigkeitsverlust während der Rotation zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass ein offener Rohling aus dem gleichen VolumenH 2 O ist symmetrisch zum Ausgleich der Spinnsystem angeordnet.
      3. Schließen Sie den Deckel des Konzentrators und starten Rotation. Um die Proteinstabilität zu gewährleisten, Konzentrat bei RT oder bei niedrigen Temperaturen bis zu 30 ° C.
        HINWEIS: Der verwendete Konzentrator automatisch auf 170 × g beschleunigt und stellt die Vakuum. Im folgenden wird es beschleunigt auf seine maximale Geschwindigkeit von 240 x g.
      4. Häufig unterbrechen den Konzentrationsprozess das Flüssigkeitsvolumen zu untersuchen. Stoppen Sie die Konzentration, wenn die verbleibende Lösungsvolumen zwischen 20 & mgr; l und 33 & mgr; l ist.
        HINWEIS: entsprechend anpassen die Schritte 4.3.8.1 - 4.3.8.4 für andere Lösungsvolumina (Schritt 4.2.1.9) und andere Proteinkonzentrationen (Schritt 4.2.1.10). Flash die konzentrierte Proteinlösung in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C einfrieren, oder direkt mittels HPLC-ESI - Massenspektroskopie 50 zu analysieren. VORSICHT! Tragen Sie ein eyeshield und Cryo-Handschuhe aus Stickstoff Spritzern geschützt werden.
  4. HPLC-ESI - massenspektrometrischen Analyse 50 von Modellproteinen
    1. Führen HPLC-Trennung von 5 bis 15 & mgr; l Proteinlösung (hergestellt in Abschnitt 4.3) auf einer C5-Umkehrphasensäule (3 & mgr; m, 100 x 2,1 mm) mit einem Gradienten von 20% - 90% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure über 25 min und anschließender ESI-Massenspektrometrie mit Erkennung auf einer Time-of-Flight-Masse analysator im Bereich von 300 - 3000 m / z.
      HINWEIS: In Abhängigkeit von der Art des exprimierten Modellprotein, andere Lösungsmittel verwenden oder Spalten, die besser geeignet sein könnten.
    2. Dekonvolutieren Massenspektren unter Verwendung geeigneter Software 52 gemessen Null-Ladung Massen zu berechnen.

Representative Results

Dieses Protokoll führt durch die zellfreien Rückstand spezifischen Einbau von NCAAs in Modellproteine. Er schlägt vor, SDS-PAGE für eine vorläufige Bewertung des Einbaus Experiment und weitere Schritte, um die Modellproteine ​​für eine geeignete HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse vorzubereiten.

Hier sind repräsentative Ergebnisse der zellfreien Rückstand spezifischen Einbau des Arg Analogon kann, sowie die Lys analoge L-Hydroxy-Lysin (Hyl) vorgestellt. Die verschiedenen Aminosäurelösungen, die Energiepuffer, der Vektor DNA kodierend für das Modellprotein und zellfreien Reaktionen werden wie oben beschrieben hergestellt. Der Referenzzellfreie Reaktion wird mit der Aminosäurelösung zur Verfügung gestellt, bestehend aus den 20 Caas. Für jedes Experiment wird eine negative Kontrolle zellfreie Reaktion mit der Aminosäurelösung zugeführt, die die kanonischen Analogon der ncaa in Frage fehlt. Für jede ca.oach, einer zellfreien Reaktions drückt das Modellprotein in Gegenwart der Aminosäure-Lösung, bei der CAA durch die nicht-kanonische analog substituiert ist. His-tag Reinigung, Pufferaustausch und HPLC-ESI massenspektrometrische Analyse werden entsprechend ausgeführt zu dem oben beschriebenen Protokoll.

Das Modell - Protein ist das C-terminale deGFP 32 His-tagged, eine verkürzte Version von EGFP 53. Seine eine Buchstaben-Aminosäuresequenz kann in (Supplemental Material 2) gefunden werden. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und Lys 18 - Positionen, respectively. Der Expressionsvektor ist pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.

Im Falle der vollständigen Einbeziehung der NCAA, kann man davon ausgehen, dass die negative Kontrollreaktion drückt nicht deGFP, da einer der 20 CaaS fehlt. die native eine in der Refe: Im Gegensatz, in den beiden anderen Reaktionen nachweisbar sein deGFP müssenrenz zellfreie Reaktion und das modifizierte Protein in dem zellfreien Reaktion, die mit der NCAA vorgesehen ist.

Figur 1A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Can Inkorporation experiment. Die Referenzzellfreie Reaktion hat die höchste deGFP Expressionsniveau. In dem zellfreien Reaktion, die mit vorgesehen ist, wird deGFP bei etwas niedrigeren Konzentration ausgedrückt. Kein deGFP Expression kann in der negativen Kontrolle nachgewiesen werden. Dieses SDS-PAGE Ergebnis ist ein guter Indikator für eine erfolgreiche Integration von Can in das Zielprotein deGFP.

Um die Hypothese aufgestellt , die völlige Eingliederung von Can in deGFP sowohl gereinigte Modellproteinen, visualisiert in 1B beweisen, werden durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie analysiert. 1C zeigt die entfalteten Massenspektren der gereinigten deGFP Molekülen. Die entfalteten Masse von DEGF P, die in der Referenzzelle freien Reaktions ausgedrückt ist 26,192.8 Da. Für deGFP ausgedrückt in der Dose enthalten, zellfreie Reaktion eine Masse von 26202,5 ​​Da erscheint. Die erwarteten Massen für den nativen deGFP6Arg und dem modifizierten deGFP6Can mit Arg vollständig von Can sind 26.193 Da und 26.204 Da bzw. ersetzt werden. Die Massendifferenz von 1,5 Da für deGFP6Can ist innerhalb der Fehler des Spektrums Entfaltungs. Somit ist die vollständige Einbeziehung von Can in deGFP bei allen 6 Arg Positionen bestätigt.

Die beiden Spitzen der reduzierten Intensität entsprechen dem nativen deGFP6Arg und modifizierte deGFP6Can, die nicht ihre reifen Fluorophor erreichen. Der Fluorophor ist autokatalytisch durch Abspaltung eines H 2 O - Molekül erzeugt wird , gefolgt von einer Oxidation. Dies führt zu einer Masse von 20 Da erhöht, wenn dieser Prozess nicht abläuft.

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Abbildung 1. SDS-PAGE Auswertung des Experiments Einarbeitung kann und HPLC-ESI - Massenspektroskopie der zellfreien exprimiert und gereinigt deGFP Molekülen. (A) Vorläufige Bewertung des Can SDS-PAGE Einverleibung Experiment verwendet wird . Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (C) Bestätigung der vollständigen Einbeziehung kann durch HPLC-ESI - Massenspektroskopie. Die erwarteten Massen des nativen deGFP und dem modifizierten deGFP mit Arg vollständig durch Can ersetzt sind 26.193 Da und 26.204 Da auf. Jedes Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen werden angezeigtin Da. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original - Gel Fahrspuren in ergänzendes Material präsentiert 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2A zeigt die vorläufige SDS-PAGE Auswertung des Hyl Inkorporation experiment. In dem zellfreien Reaktion, die mit Hyl vorgesehen ist, wird deGFP ausgedrückt. Im Gegensatz zu dem ersten Experiment wurde eine schwache deGFP Band kann in der negativen Kontrollreaktion zu beobachten. Dies könnte zu Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen beruhen. Dies ermöglicht einen leichten deGFP Expression in der negativen Kontrollreaktion, wo weder noch Lys Hyl zugegeben.

Für H PLC-ESI - Massenspektroskopie, die deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion bereitgestellt mit Hyl werden gereinigt und der Puffer ausgetauscht wird (2B).

Figur 2
Abbildung 2. SDS-PAGE Auswertung des Hyl Einverleibung Experiment (A) Von links nach rechts:. Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion , die Hyl und Proteinstandard. (B) SDS-PAGE nach His-Tag Reinigung und Pufferaustausch der exprimierten deGFP Molekülen. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard. Für die Visualisierung werden die Gel-Bahnen aus dem Gel Bilder extrahiert, miteinander verbunden sind, werden in Grauskala-Format umgewandelt wird Größe optimiert und Kontrast sowie Helligkeit verbessert werden. Original-Gel Fahrspuren in ergänzendes Material 3 dargestellt.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3 zeigt den entfalteten Massenspektrum von gereinigtem deGFP Molekülen. 3A die Hypothese bereits Lys - Reste in den zellfreien Reaktionen bestätigt. Die vorherrschende Spitze des Spektrums entspricht der nativen deGFP (erwartete Masse: 26.193 Da). deGFP Moleküle einer 20 Da höhere Masse, die nicht ihre Fluorophor entwickeln kann wieder erkannt werden. Die Lys - Reste werden bevorzugt auf die tRNA Lys geladen durch Lysyl-tRNA-Synthetase zu einem hohen Expressionsniveau der einheimischen deGFP18Lys führt.

Die Massendifferenz zwischen Hyl und Lys 16 Da. Aufgrund des Vorhandenseins von Hyl, die an die Lys-Reste alle möglichen deGFP Spezies erzeugt werden, in Konkurrenz (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (3B). Zugegeben, überlappt die Spitze des deGFP1Hyl + 17Lys mit der Spitze des nativen deGFP, die nicht seine Fluorophore (3A) und die Masse von einigen Spitzen erzeugen unterscheidet sich mehr als 2 Da von der erwarteten Masse. Diese Massendifferenzen können aufgrund der geringen Mengen der deGFP Spezies zu hohen Lärm zurückzuführen. Jedoch wird Hyl allgemein durch das zellfreie System eingebaut. Weitere Verbesserungen haben getan werden Lys-Reste in den zellfreien Reaktionen abzuschaffen.

Figur 3
. Abbildung 3. HPLC-ESI - Massenspektroskopie der gereinigten deGFP Moleküle der zellfreien Reaktion , die Hyl (A) Die nativen deGFP18Lys wird überwiegend nachgewiesen (erwartete Massen: mit Fluorophor 26.193 Da, ohne reife Fluorophor 26.213 Da). (B)Vergrößerung offenbart die Existenz aller möglichen deGFP Arten (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Ihre erwarteten Massen sind 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Das Spektrum wird normiert auf die höchste Intensität (counts). Spitzenpositionen in Da angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 1

Ergänzendes Material 1. Berechnung Vorlage. In Abschnitt 2 wird die Vorbereitung des Master - Mix Energiepuffer wird mit Rohextrakt Aliquots von 30 & mgr; l beispielhaft und optimale Mg- und K-Glutamat - Konzentrationen von jeweils 3 mm und 30 mm. Dieses Beispiel führt zu einem Master-Mix Volumen, das 3 Energiepuffer Aliquots ergibt. in section 3 wird die Herstellung der zellfreien Reaktion beispielhaft auf einen optimalen Vektor - DNA - Konzentration von 10 nM in der zellfreien Reaktion eine 90 nM DNA - Stammlösung führt. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Für eine geeignete Rückverfolgbarkeit, die Verwendung der Berechnungsvorlage wird durch Einsetzen dieser typischen Werte veranschaulicht, die von dem obigen Beispiel abweichen: Rohextrakt Volumen: 28 & mgr; l, optimal Mg-glutamat: 2 mM, optimaler K-Glutamat: 40 mm, Anzahl der gewünschten Puffer Aliquots: 100, optimale Vektor-Konzentration in zellfreien Reaktion: 8 nM, DNA-Vektor-Stammlösung: 150 nM.

Zunächst 28 & mgr; l als Rohextrakt Volumen in den orangefarbenen Bereich des ersten Abschnitts Vorlage eingeben. Geben Sie dann in die zweite Schablonenabschnitt 2 mM eined 40 mM als optimal Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen in den orangefarbenen Feldern. Unter Berücksichtigung der optimalen Mg- und K-Konzentrationen, die Zusammensetzung einer 15 ul Energiepuffer, sowie eine entsprechende, vergrößert 16 & mgr; l-Aliquot wird berechnet. Unten geben Sie entsprechend 100 als gewünschte Anzahl von Energiepuffer Aliquots (16 ul). Die Vorlage passt die Volumina der verschiedenen Pufferkomponenten für die 1.700 & mgr; l Master-Mix, wie folgt: 204 ul 100 mM Mg-glutamat-Stammlösung, 136 ul 3 M K-Glutamat-Stammlösung, 728,73 & mgr; l 14x Energielösung, 510 ul von 40% PEG-8000 und 121,27 ul steriles ddH 2 O. Schließlich wird in der dritten Schablonenabschnitt, geben Sie 8 nM und 150 nM als optimale Vektor-Konzentration in der zellfreien Reaktion und jeweils Vektor-DNA-Stammlösung Konzentration. Die Vorlage passt die Mengen der verschiedenen Komponenten, die zu den 28 & mgr; l Rohextrakt zugegeben werden müssen, die Herstellung einer 90 & mgr; l zu finalisierenzellfreie Reaktion wie folgt: 15 ul Energiepuffer, 15 ul einer der drei unterschiedlich zusammengesetzte Lösungen Aminosäure, 4,80 ul Vektor - DNA - Lösung (150 nM) und 27,20 & mgr; l sterilem ddH 2 O.

Figur 2
Ergänzendes Material 2. Ein - Buchstaben - Aminosäuresequenz des Modellproteins deGFP. Dieses Modell Protein enthält 6 Arg und 18 Lys Positionen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Ergänzendes Material 3. In voller Länge und nicht modifizierten Gelspuren , die in jedem einzelnen s präsentiert die Gelt Bilder präsentiert Abbildung 1 und 2. Die Gelspuren entsprechen ubfigure aus demselben SDS-Polyacrylamidgel extrahiert. In Abbildung 1 und 2 dieser Bahnen wurden zusammen für Präsentationszwecke verbunden. Molekulargewichte der Proteinstandard Bänder neben den Figuren angedeutet. (A.1) Unkupierte Gelspuren von 1A. Von links nach rechts: Protein-Standard, Referenz zellfreie Reaktion, negative Kontrolle und zellfreie Reaktion Bereitstellung anstelle von Arg Can. (A.2) Unkupierte Gelspuren von 1B. Von links nach rechts: Protein-Standard, gereinigt deGFP aus der Referenzreaktion gereinigt deGFP aus der Dose enthält Reaktion. (B.1) Unkupierte Gelspuren von 2A. Von links nach rechts: Negative Kontrolle zellfreie Reaktion, zellfreie Reaktion, die Hyl und Proteinstandard. (B.2) Unkupierte Gelspuren von 2B. Von links nach rechts: Gereinigte deGFP aus der Hyl enthaltenden Reaktions und Proteinstandard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

An-einfach zu zellfreien Expressionssystem als eine tragfähige Strategie verwenden, um Rest-spezifisch NCAAs in Proteine ​​einzubauen, wird präsentiert. Zu diesem Zweck wird der Rohextrakt mit Vektor-DNA, die für das interessierende Protein ergänzt, den Energiepuffer und den entsprechenden Aminosäuren. Beachten Sie, dass Volumen des aliquoten Teils auf dem Rohextrakt Proteinkonzentration 34 Rohextrakt abhängt. Der zellfreie Expressionseffizienz in Abhängigkeit von der Konzentration-Vektor-DNA Konstruktion optimiert. Die Volumina der Energiepufferkomponenten variieren als Funktion der optimierten Mg- und K-Glutamat-Konzentrationen, um hohe Ausbeuten an zellfreien ausgedrückt Modellprotein zu ermöglichen.

Eine vorläufige Auswertung des Einbaus Experiment kann durch Durchführen der SDS-PAGE des gereinigten zellfreien Reaktionsmedium erhalten werden. Für eine detailliertere Analyse, HPLC-ESI-Massenspektroskopie wird als ein Mittel vorgeschlagen, für eine vollständige, rückstandsspezifischen incor zu überprüfenFungs der NCAA. Als Vorbereitung für die letzteren sind spin column Systemen verwendet His-tag Reinigung und Pufferaustausch mit den kleinen Volumina, die in diesem Protokoll verwenden, zu ermöglichen.

Einschließlich HPLC-ESI-Massenspektroskopie kann das gesamte Protokoll innerhalb von 2 Tagen durchgeführt werden. Es enthält keine besonders kritischen Schritte. Allerdings Konzentration Optimierungen von Mg- und K-Glutamat sowie von Vektor-DNA sind von entscheidender Bedeutung, um hohe Ausbeuten des Modellproteins zu exprimieren. Die Verwendung des hocheffizienten Expressionsvektor pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 wird dringend empfohlen. Elution von His-markierten Proteinen ist in der Regel wegen der hohen Konzentration an Imidazol (> 150 mM) und andere Salze wie NaH 2 PO 4 (> 300 mm) oder NaCl (> 50 mm) , die hohe Hintergrundrauschanalyse in massenspektroskopische erzeugen 49 . Austausch solcher Elutionspuffer mit einem geeigneten Protein-Speicherpuffer stabilisiert das Modell Protein und drastisch reduziert Hintergrundgeräusche während der massenspektroskopischen Analyse.

Als Ergebnis kann Arg innerhalb des Modellproteins an allen sechs Positionen ersetzt. In dem Expressionssystem, können keine Arg Rückstände festgestellt werden. Dies vereinfacht die rückstandsspezifischen Einbau Arg - Analoga im Vergleich zu anderen Expressionssystemen , die weitere Abreicherung Strategien 29,30 erfordern. Die präsentierten zellfreien Ansatz umgeht die inhärenten Einschränkungen von in - vivo - Ansätze , die zu Can Toxizität zurückzuführen sind, oder die starke Abhängigkeit von mRNA - Sequenz in einzelne Proteinproduktionsstrategien 24,31. Im Gegensatz, in vivo Spaltung kann , um die in - vitro - System verwendet , um Homoserin und Hydroxyguanidin 31 auftritt.

Jedoch behält das zellfreie System eine ausreichende Menge an Lys mit Analoga wie Hyl zu konkurrieren. Die HPLC-ESI-Massenspektroskopie-Analyse zeigt, dass das Modell Protein enthält sowohl die canonical sowie die nicht-kanonischen analog in unterschiedlichen Anteilen. Der Rückstand spezifischen Einbau von Lys ist möglich, in der Regel aber für eine vollständige Substitution, weitere Abreicherung Strategien oder speziell entwickelten aaRS und tRNA für die Anerkennung von NCAAs optimiert müssen entwickelt werden.

Wir erzielten ausgezeichnete Ausbeuten von zellfreien ausgedrückt, modifizierte Modell Proteine, die durch die NCAA in der gleichen Konzentration wie die kanonische hinzufügen. Die Einbaueffizienz hängt von der Art des ncaa aufzunehmen. Noch höhere Ausbeuten durch die Optimierung der Konzentration des NCAA könnte noch realisierbar sein.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit des verwendeten Systems für die rückstandsspezifischen Einbau NCAAs solange sie durch die kanonische endogene Translationssystem akzeptiert werden. Für den Rest spezifischen Einbau von spezifischen NCAAs, einen weiteren Bedarf zu prüfen, ob die Rückstände des analogen CAA Stöb des Expressionssystems.

Die zellfreien Transkriptions-Translationssysteme können aus verschiedenen Organismen gentechnisch verändert werden 54 unterschiedliche Anforderungen reagieren zu können . Die alle E. coli Transkriptions-Translations - Maschinerien der hier vorgestellten zellfreies System ermöglichen die Verwendung von Bakteriophagen und E. coli - Promotoren, und sie können 55 parallel oder nacheinander in Kaskaden handeln. Die allgemeine Anwendbarkeit und Benutzerfreundlichkeit machen das Verfahren ein wirksames Instrument für die weitere Forschung in der Aminosäure-Toxizität und therapeutische Anwendung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

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