친 유성 독소루비신 전구 약물 미셀의 제조 및 특성화

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

친 유성 독소루비신 전구 약물의 제조 및 특성화를위한 프로토콜 1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N로드 - [아미노 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (PEG-DSPE) 미셀 설명한다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

화학 요법은 일반적으로 암의 다양한 형태를 치료하는 데 사용됩니다. 모든 경우 대부분은 화학 요법 약물은 더 많은 생명을 위협 조건, 오심, 설사 등의 관리가 작은 조건에 따라 다를 수 독성 부작용이있다. 대부분의 항암제는 독성이 있기 때문에 정상 조직에 대한이 약의 비 선택적 노출은 필연적으로 독성이 발생합니다. 따라서, 선택적으로 암세포에 약물을 전달할 수있는 치료 방법에 대한 중대한 필요성이있다. 항암제의 투여와 함께 또 다른 문제는 가난한 수용성이다. 일반적으로, 가용 화제는 이러한 난 용성 약물을 수립 할 필요가있다. 그러나, 디메틸 설폭 사이드와 같은 대부분의 가용 화제, (DMSO), 크레 모포 EL 및 폴리 솔 베이트 80 (트윈 80) 간 및 신장 독성, 용혈, 급성 과민 반응 및 말초 신경 병증의 원인이 될 수 있습니다. 1 따라서, 안전하고 생체 적합성 제제는 필요하다 가난한 사람들의 임상 사용LY 수용성 항암제. Nanocarriers은 상기 과제에 대한 약물 전달 시스템을 약속한다. 이 nanocarriers는 리포좀,이 나노 입자, 3 미셀, 4-7 고분자 - 약물 접합체, 8, 무기 물질을 포함한다. 9 몇 나노 의학 제품 (예를 들어, Doxil, 아브 락산 및 Genexol)는 암 환자를 치료하기 위해 규제 기관에 의해 승인되었습니다. (10)

고분자 미셀이 성공적으로 항암제의 전달에 사용 된 나노 크기의 약물 전달 담체를 약속한다. 4-7,11,12 전형적인 고분자 미셀은 자기 조립 공정을 통해 양친 성 중합체로부터 제조된다. 코어 - 쉘 구조 고분자 미셀은 친수성 ​​쉘과 소수성 코어를 포함한다. 친수성 쉘은 입체적으로 미셀을 안정화시키고 혈류에서의 순환을 연장 할 수 있습니다. 소수성 코어는 효과적으로 소수성 D를 캡슐화 할 수 있습니다양탄자. 때문에 미셀 (일반적으로 미만 200 ㎚) 및 장기 순환 속성의 작은 크기, 고분자 미셀이 향상 침투성 및 보존 (EPR) 효과 (수동 종양 타겟팅)을 대상으로 종양을 달성 할 것으로 추정된다.

봉입 안정성은 미셀의 능력을 표적 종양 중요하다. 최적 종양 타겟팅을 달성하기 위해, 미셀은 종양 부위에 도달하기 전에 최소 누설 약물이 아직 신속 암세포를 입력 한 후 약물을 방출한다. 제제의 안정성이 제품 개발의 실행 가능성뿐만 아니라 개발 된 제품의 저장 수명을 결정하기 때문에 또한 제제 안정성, 또한, 제품 개발을위한 필수 요건이다. 최근 많은 노력 전달 담체에 약물의 로딩을 개선하려고했다. 친 유성 전구 약물 접근 지질 나노 입자 에멀젼에 약물 로딩을 개선 탐색 된 전략이다. 13,14 접속사약물과 지질의 ugation 크게 자신의 친 유성을 개선하고 nanocarriers의 친 유성 성분의로드 및 보존을 향상시킬 수 있습니다.

여기서는 친 독소루비신 전구 약물로드 미셀을 제조하는 프로토콜을 기술한다. 우선, 친 유성 약물 독소루비신위한 합성 과정을 설명한다. 이어서, 필름 분산 법 마이셀을 생성하는 프로토콜이 도입된다. 이 방법을 성공적으로 이전 연구에서 사용되었다. 5 DSPE-PEG가 성공적 미셀 약물 전달을 위해 사용 되었기 때문에 미셀을 제조하기위한 담체 물질로서 선택 하였다. (15, 16)는 마지막으로, 미셀을 특성화하는 데 사용되는 여러 가지 시험 관내 분석을 서술 제형은 항암 활성을 평가 하였다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

DOX-PA 1. 합성

  1. 독소루비신의 390 밀리그램과 팔 미트 산 히드라 지드 243 mg의 무게를 측정하고, 둥근 바닥 플라스크에 전송할 수 있습니다.
  2. 유리 주사기와 플라스크에 무수 메탄올 150 ㎖를 추가합니다. 피펫으로 트리 플루오로 아세트산 (TFA)의 39 μl를 추가합니다. 자기 교반기를 사용하여, 어두운 곳에서 실온에서 18 시간 동안 반응 혼합물을 교반 하였다.
    비고 : 반응 물질의 양을 확장 할 수있는 아래 DOX-PA의 상이한 양을 얻었다. 반응물의 비율을 같은 비율로 유지되어야한다. 78 ㎎을 1,170 ㎎의 범위에서 DOX 수량을 사용하는 반응은 일반 화학 실험실에서 수행 될 수있다.
  3. 실리카 겔 컬럼을 사용 DOX-PA 정제. 17
    1. 로타리 증발기로 반응 혼합물 중의 용매를 제거한다. 혼합물의 부피를 약 20 mL로 감소 된 후 실리카겔 3g을 추가한다. 건조 분말을 얻었다 회전 증발을 계속 t 수 있도록그 실리카 겔에 흡착 제품. 건조 분말을 형성 한 후 추가로 30 분 동안 진공 상태에서 시료를 유지한다.
    2. 용매로서 디클로로 메탄을 이용하여 컬럼에 실리카 겔 50g을 팩. 조심 컬럼에 흡착 생성물을 함유하는 실리카 겔 샘플을 추가한다.
    3. 이에 서서히 극성 용매 (표 1)의 증가, 메탄올의 비율을 증가시키면서, 디클로로 메탄 및 메탄올의 혼합물로 컬럼을 용출시켰다.
    4. 시험관에서의 용출액 분획 (25 ㎖ / 튜브)를 수집하고, 박층 크로마토 그래피 (T​​LC)에 의해 진행 상황을 모니터링한다.
    5. 순수한 DOX-PA 포함하는 모든 분획을 합하고 건조 분말이 형성 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한다. 또한 진공 O의 /의 N에서 제품을 건조.
  4. TLC에 의해 DOX-PA의 분석.
    1. TLC 판의 4cm X 8cm 부분을 잘라. TLC 스포팅 모세관을 가진 판의 바닥에서 현장 샘플 용액 0.5 cm 충족 사용용매로 한올.
    2. 디클로로 메탄 및 메탄올의 혼합물을 함유하는 현상 챔버로 TLC 판 위 (3/1, v / v)로. 용매의 깊이는 0.5 cm보다 그냥 작아야합니다.
    3. 용매 전면 판의 상단에 도달 할 때 현상 실에서 플레이트를 제거합니다. 연필로 용매 앞의 위치를​​ 표시하고 판을 건조 할 수 있습니다. 샘플을 시각화하기 위해 포화 된 요오드 증기를 함유하는 염색 챔버로 TLC 플레이트를 놓는다.
  5. 1 H 핵 자기 공명 분광법 (1H-NMR)와 DOX-PA 분석. 18
    1. 메틸 술폭 시드-D6 (DMSO) 1 ㎖에 DOX-PA 15 mg을 용해하고, NMR 튜브에 시료를 옮긴다.
    2. 핵 자기 공명 악기의 자석에 NMR 튜브를 삽입합니다. 용매로서 DMSO를 선택 양성자 스펙트럼을 측정한다. 자석에서 NMR 튜브를 제거합니다. NMR의 결과 (18)를 분석합니다.

이. 필름 분산 방법에 의해 DOX-PA 미셀 준비

  1. DSPE-PEG (40 mg) 및 PA-DOX (4 mg)을 10 mL 유리 바이알에 2 ㎖의 메탄올로 용해.
  2. 바이알의 박막이 형성 될 때까지 회전 증발기를 사용하여 진공하에 유기 용매를 제거한다.
    대안 적으로, (예를 들어, 아르곤 또는 질소 가스) 막을 형성하고 상기 잔류 용매를 제거하고 진공 건조기에서 바이알을 유지하는 불활성 가스하에 유기 용매를 증발 : 참고.
  3. 전송 유리 병에 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (pH가 7.4, DPBS) 2 ㎖.
  4. 미셀을 생성하는 RT에서 3 분 동안 초음파 욕조에 병을 놓습니다.
    주 : 초음파 전력은 초음파 화장실의 다른 모델마다 다릅니다. 얇은 폴리머 / 약물 필름을 분산 할 수있는 충분한 초음파 전력을 생성 할 수있는 단위를 선택합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 초음파 욕의 출력 전력은 110 (W)이다
  5. 단기 저장을 위해 4 ° C에서 미셀을 유지하고 -20 오래 ° C ~-term 저장.
    참고 : 또한, 미셀은 또한 동결 건조 및 사용하기 전에 물을 재구성 할 수 있습니다. 일반적으로, 더 동결 방지제 또는 lyoprotectant이 제제 필요하지 않습니다.

DOX-PA 미셀 3. 특성

  1. 미셀의 약물 봉입 효율 DOX-PA 농도의 결정
    1. 1 ㎍ / ㎖, 5 μg의 / ㎖, 20 ㎍ / ㎖, 50 ㎍ / ㎖, 100 μg의 / ㎖ : DOX-PA 다섯 가지 농도 DOX-PA 용액을 제조 DMSO에 이전 단계에서 합성 녹인다. 490 nm에서 UV-VIS 스펙트로 DOX-PA 용액의 흡광도를 측정한다. DOX-PA 약물 농도 및 490 nm에서 그들의 대응 흡수에 기초하여 표준 곡선을 생성한다.
    2. DMSO 500 μL와 약물로드 미셀의 25 μl를 희석. 자외선 VIS 분광기로 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 3.1.1에서 생성 된 표준 곡선과 약물 농도를 계산한다.
    3. 다음 식을 사용하여 캡슐화 효율을 계산한다 :
      약물의 포위 효율 (%) = (미셀의 약물의 양) / (첨가 약물의 양) × 100 %
  2. 동적 광 산란 입자 크기의 특성 (DLS)
    1. 1 ㎎ / ㎖의 최종 DSPE-PEG 농도 DPBS (PH 7.4)으로 희석 미셀. Z 축 평균 크기 및 분산도 지수 (PDI)를 획득하기 위해 입도 분석기 2 mL의 샘플을 분석한다.
  3. 생체 외 항암 활성 평가
    참고 : 적절한 무균 기술을 사용하고 바이오 안전성 캐비닛 내부에 작동합니다.
    1. 세포 배양 플라스크에서 (예를 들어, T25)를 포함하는 DU-145 인간 전립선 암 세포를 세포 배양 배지를 제거하고 2 ㎖ DPBS (PH 7.4)에 세포를 헹군다.
    2. 대기음 DPBS는 트립신 용액 (0.25 %) 1 mL를 넣고 세포를 분리하여 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
    3. 10m 추가세포 배양 배지 L (RPMI 1640 + 10 % 태아 소 혈청 + 1 % 항생제 - 안티 곰팡이), 세포의 대부분은 플라스크로부터 분리 될 때. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에 세포를 전송합니다.
    4. 세포 배양 배지 5 ㎖과 세포 펠렛을 다시 중지 및 혈구 세포 수를 카운팅하는 샘플을 제거한다. 50000 세포 / ml의 농도로 세포 배양 배지와 세포를 희석. 96 웰 세포 배양 플레이트에 희석하여 세포 현탁액을 추가 (100 μL / 웰). 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 셀 (37 ° C를 5 % CO 2) 18 시간 동안 세포 부착을 허용한다.
    5. 각각 0.1 μM, 0.5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM을 최종 약물 농도를 얻기 위하여 세포 배양 배지와 DOX의 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 용액 DOX-PA DMSO 용액을 희석. 0.5 %에 위의 모든 샘플에서 최종 DMSO 농도를 유지합니다. 최종 약물 공동 얻었다 세포 배양 배지와 DOX-PA 미셀 희석0.1 μM의 ncentrations 각각 0.5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM. 빈 세포 배양 배지에게 컨트롤을 사용합니다.
    6. 배양기에서 96 웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 (각 그룹에 대해 N = 4) 단계 3.3.5에서 제조 된 다른 치료제를 함유하는 배지 100 ㎕와 세포 배양액을 교체한다. (2 37 ° C, 5 % CO) 추가로 72 시간 동안 세포 배양기에서 세포를 인큐베이션.
    7. 배지를 흡인 및 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) 0.5 ㎎ / ㎖을 함유하는 배지 100 ㎕ -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 추가한다.
    8. 추가로 2 시간 동안 세포 배양기에서 세포를 인큐베이션. 조심스럽게 매체를 제거하고 포르 마잔 결정을 용해 DMSO 100 ㎕를 추가합니다.
    9. 570 nm 파장과 670 nm의 참조 파장의 마이크로 플레이트 분광 광도계로 흡광도를 측정한다.
    10. 다음 식을 사용하여 세포 생존율을 계산한다 :
      (A 테스트 / A 컨트롤) × 100 %
      주 : 변동 (ANOVA) 통계 시험의 분석을 사용하여 서로 다른 그룹의 세포 생존율을 비교한다. 약물 농도 데이터 세포 생존 능력에 기초하여, IC (50)를 계산한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

그림 1은 DOX-PA의 합성 방식을 보여줍니다. DOX-PA는 pH 민감성 히드라 존 결합을 통해 독소루비신 팔 미트 산의 결합에 의해 합성 하였다. 팔 미트 산 히드라 지드의 약간 과량은 반응의 완료를 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 반응에있어서 매우 높은 효율이 독소루비신의 소량은 18 시간 반응 (도 2) 뒤에 남아 있었다. 수율은 약 88 %였다. 반응의 끝에서, DOX-PA는 실리카 겔 컬럼을 사용하여 정제하고 순수한 적색 고체 생성물을 얻었다. DOX-PA 정제 된 DOX-PA (도 2)에 대해 하나의 스팟을 보여 TLC로 분석 하였다. (3)이 PA-DOX의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 독소루비신 및 팔미틴산 모두의 특성 NMR 피크 상기 접합 반응의 성공을 확인하는 관찰되었다.

모양은도 4에 도시한다. 약물이없는 빈 DSPE-PEG 미셀 투명한 액체로서 나타난다. DOX-PA DSPE-PEG 미셀은 붉은 액체로 표시; 적색은 미셀에로드 DOX-PA 때문이다. 입자 크기 분석의 대표적인 결과가도 5에 도시되어있다. 빈 DSPE-PEG 미셀의 Z 평균 평균 입경은 17.0 ± 0.5 nm의 (PDI = 0.034 ± 0.019)이었다. DOX-PA의 로딩 약간 미셀 입자 크기 증가; DOX-PA DSPE-PEG에 대한 미셀 Z 평균 평균 입경은 25.7 ± 1.6 nm의 (PDI = 0.407 ± 0.035)이었다.

미셀 조성물의 DOX-PA 농도를 490 ㎚ 흡광도에 근거하여 결정 하였다. PEG-DSPE는 DOX-PA 농도의 분석에 간섭하지 않기 때문에,이 파장의 흡수를 무시할 수있다. 미셀 제형의 DOX-PA의 농도는1.99 ± 0.11 ml의 밀리그램 /과 약물 적재 효율은 99.3 ± 5.7 %였다. 높은 캡슐화 효율 때문에 미셀의 소수성 코어의 보존을 향상 DOX-PA의 친 유성 특징이다. 배합물은 우수한 안정성을 나타내었다. 삼주 4 ° C - 저장시 눈에 보이는 강수량은 없었다. 약물 농도의 유의 한 변화는 저장 동안 관찰되지 않았다.

DU-145 인간 전립선 암 세포가없는 독소루비신 다른 농도의, 무료 DOX-PA와 DOX-PA DSPE-PEG 미셀로 처리 하였다. 세포 생존은 MTT 분석 (도 6)를 사용하여 72 시간 처리의 마지막에 측정 하였다. 세포 생존의 농도 의존적 감소가없는 독소루비신 (IC 50 = 0.10 μM), 무료 DOX-PA (IC 50 = 0.33 μM) 또는 DOX-PA 미셀 (IC 50 = 0.25 μM)로 DU145 세포를 처리함으로써 달성되었다. 무료 독소루비신은 있지만 무료 DOX-PA 또는 낮은 농도에서 DOX-PA 미셀 (0.1 μM 0.5 μM)보다 더 효과적, DOX-PA 그룹은 높은 농도 (2-10 μM)에서 무료로 독소루비신보다 세포 생존에 큰 감소를 보였다. 또한, 모두 높고 낮은 농도에서 DOX-PA 및 DOX-PA 미셀 사이에 유의 한 차이가없는 것으로 나타났다. 빈 DSPE-PEG 미셀들은 약물 전달 담체 물질 좋은 생체 적합성 DSPE-PEG의 안정성을 나타낸다 (데이타는 도시되지 않음)에 독성을 보이지 않았다.

그림 1
도 1 독소루비신 친 전구 약물의 합성 (DOX-PA) 시약 및 조건 :. 메탄올 독소루비신 (DOX), 팔 미트 산 히드라 지드 (PA) 및 트리 플루오로 아세트산 (TFA)을에 RT에서 18 시간 동안 교반시켰다 어두운. t = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 박층 크로마토 그래피 (TLC). (1) 독소루비신 TLC, (2) 원료 반응 혼합물 (3) 팔 미트 산 히드라 지드, (4) DOX-PA 복합체. 샘플을 디클로로 메탄 및 메탄올의 혼합물로 개발되었다 (3/1, v / v)의 요오드로 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
중수 소화 DMSO에 DOX-PA도 3의 1 H-NMR. DOX 및 PA 모두에서 특징적인 피크의 존재는 결합 반응의 성공을 설명한다.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
미셀의 외관도 4. (A) DSPE-PEG 미셀 및 (B) DOX-PA DSPE-PEG 미셀. 대표적인 인물은 빈 DSPE-PEG 미셀과 DOX-PA DSPE-PEG 미셀의 모습을 보여주기 위해 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 입경 미셀의 크기 분포. (A) DSPE-PEG 미셀 및 (B) DOX -PA DSPE-PEG 미셀. 미셀의 크기는 동적 광 산란에 의해 결정된다. 대표적인 수치는 입자 크기 및 크​​기 분포를 보여주기 위해 제공된다. 제시된 데이터는 평균 ± SD (N = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
미셀 제형도 6 항암 활성. DU145 세포는 MTT 분석을 사용하여 측정하고 72 시간 세포 생존을 위해 처리 하였다. 그림에 제시된 데이터는 평균 ± SD (N = 4)이다. DOX 그룹을 처리에 * P <0.01, 비교했다. 그룹 치료 DOX-PA 및 DOX-PA 미셀 사이에 통계적으로 유의 한 차이가 없습니다. IC (50)는 약물 농도 데이터 세포 생존 능력에 기초하여 산출 하였다.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블

DOX-PA의 정제에 사용되는 용매로 용출 1을 CH2Cl2 / CH 3 OH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

본 연구에서 우리는 미셀의 제조를위한 단순한, 신속한 필름 분산 법을 설명한다. 이 방법은, 양친 성 고분자의 자기 조립 특성을 이용한다 (예를 들어 DSPE-PEG)를 수성 환경에서 코어 - 쉘 구조의 미셀을 형성한다. 이 미셀의 제조 방법은 여러 가지 장점을 갖는다. 1. 일반적 리포좀, 나노 입자 및 nanoemulsions. 19 (2)의 제조에 사용되는 (예를 들면 압출 또는 균질화 같은) 복잡한 크기 환원 단계의 사용을 피하는 간단한 제형 공정을 포함한다. 그것은 좋은 재현성을 가지고있다. 제제 최적화 확립 된 후에 우수한 뱃치 일관성을 달성 할 수있다. 프로토콜은 이러한 초음파 강도와 시간 등 제조 공정 변수의 변화에​​ 관대하다. (예 : 투석 방법이나 에멀젼 용매 증발 방법 등) 다른 방법 미셀의 제조에 사용할 수 있지만, 막 분산액방법은 더 편리하고 효율적이다. 따라서 제약 산업의 미셀의 대규모 제조에 사용하기 위해 적응 될 수있는 큰 잠재력을 갖는다. 이러한 방법의 한계는 이러한 특성을 갖는 재료로 제한 따라서 담체 물질의 자기 조립 특성에 의존한다는 것이다. 고분자 재료의 부적절한 선택은 양호한 미셀 조성물 생성에 실패를 초래할 수있다. 또한, 상기 제조 방법은 중합체 / 약물 막을 분산하고 미셀의 형성을 용이하게하기 위해 초음파에 의존한다. 단지 약한 초음파 전력 미셀을 형성하기 위해 필요하기 때문에 대부분의 시판 화장실 초음파가 적합하다. 미약 전력 초음파 욕을 사용하는 경우, 이것은 문제가 될 수있다.

가난한 마약 로딩 및 조기 약물 방출은 미셀 약물 전달에 대한 주요 관심사입니다. 이러한 프로토콜에서는, 부하를 향상시키기 위해 친 전구 약물 전략을 개발DSPE-PEG 미셀로 독소루비신 보내고. 지질과 독소루비신의 활용이 크게 DSPE-PEG 미셀의 지질 코어와 약물의 호환성과 상호 작용을 개선. 친 약물 DOX-PA는 산성의 pH 응답 히드라 링커를 통해 지질과 독소루비신 공역에 의해 합성 하였다. 이 링커. 따라서, DOX가 안정적으로 중성 pH에서 프로 약물로서 DSPE-PEG 미셀에로드 (20, 21) 산성 pH에서 중성 pH에서 안정적으로 절단 및 보관시 혈액에서 순환하는 동안 최소한의 약물 누출이 있습니다. DOX-PA 미셀는 엔도 시토 시스를 통해 종양 세포를 입력하면, DOX-PA 전구 약물은 절단 및 산성 엔도 좀의 환경 (PH 5-6)에 대한 응답으로 무료 DOX로 변환됩니다. DOX가 DOX-PA보다 친수성이므로,이 변환은 DOX와 미셀의 소수성 코어 사이의 상호 작용을 방해하고, 따라서 미셀 DOX로부터의 빠른 방출을 촉진 할 것이다. 이 혁신적인 디자인 기능은 불완전 약물 방출을 방지 할 수있는비 분해성 또는 느린 절단 링커를 사용하여 약물 접합체와 관련된 중요한 문제이다.이 방법 (22)은 또한 다른 약제의 전달에 적용될 수있다. 적합한 링커의 선택은이 방법의 성공에 중요하다. 링커는 제형의 안정성을 최대화하기 위해 생리 환경에서 안정해야한다. 링커는 효율적 모 약물을 방출하는 종양 미세 환경 (예, pH가 효소 등)의 트리거에 응답하여 절단한다.

이 프로토콜에서 DOX-PA 효율적으로 높은 캡슐화 효율 (~ 100 %)와 미셀으로로드했습니다. 미셀 조성물은 우수한 안정성을 증명 약물의 석출이나 약물 농도의 감소없이 적어도 3 주 동안 그대로 남아 있었다. 이는 전구 약물의 지질 잔기 사이의 향상된 상호 작용 DSPE-PEG 미셀의 지질 코어 때문이다. compatibi 엔지니어상호 작용을 향상시키는 약물 담체 분자는 미셀 lity nanocarriers 등의 성능을 향상시키기위한 유망한 전략이다. 이 방법은 약물 로딩을 강화하고 이러한 nanocarriers에 대한 사전 성숙한 약물 방출을 최소화 할 수 있습니다. 23 적절한 약물 / 고분자 쌍의 선택은 미셀 제형을 설계에서 중요한 단계입니다. 약물 분자의 구조가 변형 될 수있다 (전구 약물 방식) 또는 담체 물질의 설계는 호환성을 향상시키고, 약물 / 담체의 상호 작용을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 또 23 24 계산 모델링 돕기 위해 유용한 도구 및 nanocarriers의 최적화에 가능한 특정 특정 약물에 대한 맞춤형 설계 nanocarrier를 준비 할 수 있습니다.

요약하면, 여기 독소루비신의 친 전구 약물을 합성하는 방법을 설명한다. 약물로드 미셀의 제조 및 특성에 대한 프로토콜은 DESCR 있습니다ibed. 필름 분산 법은 나노 스케일 자기 조립 전달 시스템의 다양한 제조 간단한 유망한 방법이다. 여기에 설명 된 특성화 방법은 제제 및 제품 개발 프로세스의 최적화를 용이하게 할 수있다, 따라서, 나노 의학의 특성을 결정하기 위해 시험 관내 분석에서 표준으로 사용될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics