Preparação e caracterização de Lipofílica Doxorrubicina micelas Pro-drogas

Bioengineering

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Summary

Um protocolo para a preparação e caracterização de doxorrubicina lipofílico pró-fármaco carregado 1,2-distearoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG) micelas é descrito.

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Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

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Abstract

Introduction

A quimioterapia é utilizada para tratar várias formas de cancro. A maioria, se não todos, os fármacos de quimioterapia têm efeitos secundários tóxicos que podem variar de pequenas condições controláveis, tais como náusea e diarreia, condições que ameaçam a vida mais. Uma vez que a maioria dos fármacos anti-cancerígenos são tóxicos, não-exposição selectiva destes fármacos ao tecido normal, inevitavelmente, provoca toxicidade. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de uma abordagem terapêutica que possa entregar drogas selectivamente em células cancerosas. Um outro desafio com a administração de fármacos anti-cancro é a sua fraca solubilidade em água. Normalmente, os agentes de solubilização são necessários para formular estes fármacos pouco solúveis. No entanto, a maioria dos agentes de solubilização, tais como o sulfóxido de dimetilo (DMSO), Cremophor EL, e polissorbato 80 (Tween 80) podem causar toxicidade hepática e renal, hemólise, as reacções de hipersensibilidade aguda e neuropatias periféricas. 1 Assim, formulações seguros e biocompatíveis são necessários para o uso clínico de máfármacos anti-cancerígenos ly solúveis. Nanocarriers são promissores sistemas de entrega de drogas para enfrentar os desafios acima. Estes nanocarriers incluem lipossomas, 2 nanopartículas, 3 micelas, 4-7 conjugados de polímero-droga, 8 e materiais inorgânicos. 9 Vários produtos nanomedicina (por exemplo, DOXIL, Abraxane e Genexol) foram aprovados pelas agências reguladoras para tratar pacientes com câncer. 10

As micelas poliméricas são promissores transportadores de distribuição de drogas de nano-escala, que têm sido utilizados com êxito para a administração de fármacos anti-cancro. 4-7,11,12 micelas poliméricas típicas são preparadas a partir de polímeros anfifílicos através de um processo de auto-montagem. Os core-shell micelas poliméricas estruturadas incluem uma camada hidrófila e um núcleo hidrofóbico. A camada hidrófila pode estabilizar estereoquimicamente micelas e prolongar a sua circulação na corrente sanguínea. O núcleo hidrofóbico pode encapsular eficazmente d hidrofóbicotapetes. Devido ao pequeno tamanho de micelas (normalmente inferiores a 200 nM) e propriedades de longa circulação, micelas poliméricas são acreditados para atingir tumores direccionamento por meio de efeitos de retenção (EPR) (tumor passivo segmentação) e permeabilidade aumentada.

A carga de droga a estabilidade é crítica para a capacidade de direccionamento tumoral de micelas. Para alcançar segmentação tumor ideal, micelas deve ter vazamento de drogas mínima antes de chegar ao local do tumor, mas liberte rapidamente a droga depois de entrar células cancerosas. Além disso, a estabilidade da formulação é também um requisito essencial para o desenvolvimento do produto, porque a estabilidade da formulação determina a viabilidade do desenvolvimento do produto, bem como a vida de prateleira de produtos desenvolvidos. Recentemente, muitos esforços têm sido feitos para melhorar o carregamento de medicamentos em transportadores de entrega. A abordagem de pró-fármaco lipofílico é uma estratégia que tem sido explorado para melhorar a carga de fármaco em nanopartículas de lípidos e emulsões. 13,14 O conjugation de lipídios com drogas pode melhorar significativamente a sua lipofilicidade e aumentar a carga e retenção nos componentes lipofílicos de nanocarriers.

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de doxorrubicina lipofílico pró-drogas micelas carregadas. Em primeiro lugar, é descrito o procedimento de síntese para a doxorubicina lipofílico pró-droga. Então, um protocolo para a geração de micelas com um método de película-dispersão é introduzida. Este método tem sido utilizado com sucesso nos estudos anteriores. 5 DSPE-PEG foi seleccionado como o material transportador para a preparação de micelas porque tem sido utilizado com sucesso para a entrega de drogas micela 15,16. Finalmente, descreve-se vários testes in vitro utilizados para caracterizar micela formulações e para avaliar a atividade anticâncer.

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Protocol

1. Síntese de DOX-PA

  1. Pesar 390 mg de doxorrubicina e 243 mg de hidrazida de ácido palmítico, e transferir para um balão de fundo redondo.
  2. Adicionar 150 ml de metanol anidro para o balão com uma seringa de vidro. Adicionar 39 ul de ácido trifluoroacético (TFA), com uma pipeta. Usando um agitador magnético, agita-se a mistura de reacção durante 18 horas à temperatura ambiente no escuro.
    NOTA: As quantidades de materiais de reacção podem ser ampliados ou reduzidos para se obter diferentes quantidades de DOX-PA. A proporção dos reagentes deve ser mantida nas mesmas proporções. As reacções que utilizam quantidades de DOX na gama de 78 mg a 1170 mg pode ser realizado num laboratório normal química.
  3. Purificação de DOX-PA usando uma coluna de gel de sílica. 17
    1. Remover o solvente na mistura de reacção com um evaporador rotativo. Adicionar 3 g de gel de sílica após o volume da mistura é reduzida para cerca de 20 ml. Continue a evaporação rotativa para se obter pós secos e para permitir que tele adsorção de produtos sobre o gel de sílica. Manter a amostra sob vácuo durante mais 30 min após os pós secos são formados.
    2. Pacote de 50 g de gel de sílica numa coluna usando diclorometano como solvente. Cuidadosamente adicionar a amostra de gel de sílica contendo o produto adsorvida para a coluna.
    3. Elui-se a coluna com uma mistura de diclorometano e metanol, aumentando gradualmente a percentagem de metanol, aumentando assim a polaridade do solvente (Tabela 1).
    4. Recolha fracções de eluente em tubos de ensaio (25 ml / tubo) e monitorizar o progresso por cromatografia de camada fina (TLC).
    5. Combinar todas as fracções contendo DOX-PA puro e remover o solvente usando um evaporador rotativo até o pó seca é formada. Além disso secar o produto sob um vácuo O / N.
  4. Análise de DOX-PA por TLC.
    1. Corte um x 8 cm secção de 4 cm de placa de TLC. soluções de amostra spot 0,5 cm da parte inferior da placa com TLC capilares mancha usando conheceuhanol como o solvente.
    2. Colocar a placa de TLC para uma câmara de desenvolvimento contendo uma mistura de diclorometano e metanol (3/1, v / v). A profundidade do solvente deve ser apenas menos de 0,5 cm.
    3. Remova a placa da câmara de revelação quando a frente de solvente atingir o topo da placa. Marcar a localização da frente de solvente com um lápis e permitem que a placa secar. Colocar a placa de TLC para uma câmara de coloração contendo vapor de iodo saturada, a fim de visualizar amostras.
  5. Análise de DOX-PA com um H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-RMN). 18
    1. Dissolve-se 15 mg de DOX-PA em 1 ml de sulfóxido de metil-d6 (DMSO) e transferir a amostra para um tubo de RMN.
    2. Insira o tubo de RMN para o ímã do instrumento de RMN. Medir o espectro de protões, seleccionando de DMSO como um solvente. Retire o tubo de RMN do ímã. Analise o resultado RMN 18.

2. Preparação de micelas de DOX-PA pelo método de película-dispersão

  1. Dissolve-se DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) com 2 ml de metanol em um frasco de vidro de 10 ml.
  2. Remover o solvente orgânico sob vácuo utilizando um evaporador rotativo, até se formar um filme fino no frasco.
    NOTA: Como alternativa, evapora-se os solventes orgânicos sob gás inerte (por exemplo, árgon ou azoto gasoso) para formar uma película e manter o frasco em um exsicador de vácuo para remover adicionalmente o solvente residual.
  3. Transferência de 2 ml de solução salina de Dulbecco tamponada com fosfato (pH 7,4, DPBS) para o frasco de vidro.
  4. Colocar o frasco num banho de ultra-sons durante 3 minutos à temperatura ambiente para gerar micelas.
    NOTA: A energia de ultra-som varia entre os diferentes modelos de banhos ultra-sônicos. Seleccionar uma unidade que pode gerar energia ultra-sónica suficiente para dispersar o filme de polímero / fármaco fina. O poder de banho ultra-sônico usado neste protocolo de saída é de 110 W.
  5. Manter micelas a 4 ° C para armazenagem de curta duração e -20 ° C durante longoarmazenamento -termo.
    NOTA: Como alternativa, micelas também podem ser liofilizados e reconstituídos com água antes da utilização. Normalmente, não cryoprotectant ou lioprotector é necessário para esta formulação.

3. Caracterização de DOX-PA As micelas

  1. Determinação da concentração de DOX-PA em micelas e eficiência de encapsulação de drogas
    1. Dissolve DOX-PA sintetizados nos passos anteriores em DMSO para se preparar soluções de DOX-PA de cinco concentrações diferentes: 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml, e 100 ug / ml. Medir a absorção de soluções de DOX-PA com um espectrómetro de UV-VIS a 490 nm. Gerar uma curva padrão baseada nas concentrações de droga DOX-PA e o seu correspondente de absorção a 490 nm.
    2. Diluir 25 uL de micelas carregadas com fármaco com 500 ul de DMSO. Medir a absorção a 490 nm com um espectrómetro UV-VIS. Calcule as concentrações de droga com a curva padrão gerada no ponto 3.1.1.
    3. Calcular a eficiência de encapsulação usando a seguinte equação:
      Eficiência de encapsulamento de droga (%) = (quantidade de drogas em micelas) / (quantidade de fármaco adicionado) x 100%
  2. Caracterização do tamanho de partícula com dispersão de luz dinâmica (DLS)
    1. Diluir micelas com DPBS (pH 7,4) até uma concentração final de DSPE-PEG de 1 mg / ml. Analisar uma amostra de 2 ml com um analisador de tamanho de partículas para se obter o tamanho e a polidispersidade índice médio Z (PDI).
  3. Avaliação in vitro actividade anti-cancro
    NOTA: Use técnica estéril apropriada e operar dentro de uma cabine de segurança biológica.
    1. Remover o meio de cultura celular a partir de um frasco de cultura de células (por exemplo, T25) contendo células DU-145 de cancro da próstata humano e lavar as células com 2 mL de DPBS (pH 7,4).
    2. Aspirar DPBS, adicionar 1 ml de solução de tripsina (0,25%), e incuba-se durante 2 min a 37 ° C para separar as células.
    3. Adicionar 10 ml de meio de cultura celular (RPMI 1640 + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% de antibiótico-antimicótico), quando a maioria das células são separadas do balão. Transferir as células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar as células a 1000 xg durante 5 min.
    4. Re-suspender o sedimento de células com 5 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para a contagem do número de células com um hemocitómetro. Dilui-se as células com meio de cultura celular a uma densidade de 50.000 células / ml. Adicionar as suspensões de células diluídas em uma placa de cultura celular de 96 poços (100 ul / poço). Incubam-se as células numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO 2) durante 18 h, para permitir a fixação das células.
    5. Diluir DOX dimetil sulfóxido solução (DMSO) e solução de DOX-PA DMSO com meio de cultura de células para se obter concentrações finais da droga de 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM e, respectivamente. Manter a concentração final de DMSO em todas as amostras acima de 0,5%. Diluir micela DOX-PA com meio de cultura de células para se obter co farmacológico finalncentrations de 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM e, respectivamente. Utilizar o meio de cultura de células em branco um controlo.
    6. Remova a placa de cultura celular de 96 poços a partir do incubador e substituir o meio de cultura de células com 100 ul de meio contendo diferentes agentes de tratamento preparado no passo 3.3.5 (n = 4 para cada grupo). Incubam-se as células na incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO 2) durante uma 72 horas adicionais.
    7. Aspirar o meio e adicionar 100 uL de meio contendo 0,5 mg / ml de 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT).
    8. Incubam-se as células na incubadora de cultura de células durante mais 2 h. Remova cuidadosamente o meio e adicionar 100 ul de DMSO para dissolver cristais de formazano.
    9. Medir a absorvância com o espectrofotómetro de microplacas a um comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de referência de 670 nm.
    10. Calcula-se a viabilidade celular utilizando a seguinte equação:
      (A Teste / controlo) × 100%
      NOTA: Comparar a viabilidade celular entre os diferentes grupos usando uma análise de uma via de variância (ANOVA) teste estatístico. Calcula-se a CI 50 com base na viabilidade celular comparada dados de concentração de droga.

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Representative Results

A Figura 1 mostra o esquema de síntese de DOX-PA. DOX-PA foi sintetizada por conjugação de ácido palmítico com doxorrubicina através de uma ligação de hidrazona sensível a pH. Um ligeiro excesso de hidrazida de ácido palmítico foi usada para facilitar a finalização da reacção. Este método de reacção tem uma eficiência muito elevada e apenas uma pequena quantidade de doxorubicina permaneceu após uma reacção de 18 h (Figura 2). O rendimento foi de aproximadamente 88%. No final da reacção, DOX-PA foi purificado usando uma coluna de gel de sílica e secou-se para se obter um produto sólido vermelho puro. DOX-PA foi analisada por TLC, que mostrou um único ponto para purificada DOX-PA (Figura 2). A Figura 3 mostra o espectro de 1 H-RMN de DOX-PA. picos de NMR característicos de ambos doxorrubicina e ácido palmítico foram observadas, o que confirmou ainda o sucesso da reacção de conjugação.

Figura 4. vazios micelas de DSPE-PEG sem droga aparece como um líquido transparente. micelas DOX-PA DSPE-PEG aparecem como um líquido vermelho; a cor vermelha é devido ao DOX-PA carregados nas micelas. Os resultados representativos das análises de tamanho de partículas são mostrados na Figura 5. O tamanho médio de partícula média Z em branco para micelas de DSPE-PEG foi de 17,0 ± 0,5 nM (PDI = 0,034 ± 0,019). O carregamento de DOX-PA aumentaram de tamanho de partícula de micelas ligeiramente; o tamanho médio de partícula média Z para micelas DOX-PA DSPE-PEG foi de 25,7 ± 1,6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).

A concentração de DOX-PA na formulação de micelas foi determinado com base na absorção a 490 nm. DSPE-PEG tem absorção desprezível a este comprimento de onda, assim não interfere na análise de concentração de DOX-PA. A concentração de DOX-PA na formulação micelar foi1,99 ± 0,11 mg / ml e a eficiência de carga de fármaco era de 99,3 ± 5,7%. A elevada eficiência de encapsulação é devido à característica lipofílica de DOX-PA, o que aumenta a sua retenção no núcleo hidrofóbico das micelas. A formulação apresentou uma estabilidade excelente. Não houve precipitação visível quando armazenado a - 4 ° C durante 3 semanas. Não se observou qualquer alteração significativa na concentração do fármaco durante o armazenamento.

células cancerosas humanas da próstata DU-145 foram tratadas com diferentes concentrações de doxorrubicina livre, livre DOX-PA, e micelas DOX-PA DSPE-PEG. A viabilidade celular foi determinada no final de um tratamento de 72 horas utilizando um ensaio de MTT (Figura 6). Uma redução dependente da concentração na viabilidade das células foi obtida por tratamento de células DU145 com doxorubicina livre (IC50 = 0,10 uM), livre de DOX-PA (IC50 = 0,33 uM), ou micelas de DOX-PA (IC50 = 0,25 uM). Embora doxorrubicina livre é mais eficaz do que micelas DOX-PA em concentrações mais baixas livre DOX-PA ou (0,1 mM e 0,5 mM), grupos DOX-PA apresentaram maior redução da viabilidade celular do que a doxorrubicina livre em concentrações mais elevadas (2-10 m). Além disso, não parecia haver nenhuma diferença significativa entre micelas DOX-PA DOX-PA e a ambas as concentrações mais altas e mais baixas. Em branco micelas de DSPE-PEG mostraram nenhuma toxicidade (dados não mostrados), indicando uma boa biocompatibilidade e segurança de DSPE-PEG como um material veículo de entrega de drogas.

figura 1
Figura 1. Síntese de pró-fármaco lipofílico de doxorrubicina (DOX-PA) Reagentes e condições:. Doxorrubicina (DOX), hidrazida do ácido palmítico (PA) e ácido trifluoroacético (TFA) em metanol foram agitados durante 18 horas à temperatura ambiente na escuro. t = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Cromatografia em camada fina (TLC). TLC de (1) a doxorrubicina, (2) mistura de reacção em bruto, (3) hidrazida do ácido palmítico, e (4) conjugado de DOX-PA. As amostras foram desenvolvidos com uma mistura de diclorometano e metanol (3/1, v / v) e corados com iodo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. 1 H-RMN de DOX-PA em DMSO deuterado. A presença de picos característicos de ambos DOX e PA demonstra o êxito da reacção de conjugação.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Aspecto de micelas. (A) micelas de DSPE-PEG e (b) micelas DOX-PA DSPE-PEG. Figuras representativas são apresentados para demonstrar a aparência de branco micelas de DSPE-PEG e micelas DOX-PA DSPE-PEG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. O tamanho de partícula e distribuição do tamanho das micelas. (A) micelas de DSPE-PEG e (B) DOX micelas -PA DSPE-PEG. O tamanho micelar é determinado por dispersão de luz dinâmica. valores representativos são apresentados para demonstrar o tamanho de partícula e distribuição de tamanho. Os dados apresentados são SD ± Média (n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. actividade anti-cancro das formulações micelares. DU145 células foram tratadas durante 72 horas e a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio MTT. Os dados apresentados na figura são a média ± SD (n = 4). *, P <0,01, em comparação com grupos tratados com DOX. Não há diferença estatística entre as micelas DOX-PA DOX-PA e os grupos tratados. IC 50 foi calculado com base na viabilidade celular comparada dados de concentração de droga.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1

Tabela 1. CH 2 Cl 2 / CH 3 OH eluindo solventes utilizados na purificação de DOX-PA.

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Discussion

Neste trabalho, nós descrevemos, um método de filme rápida dispersão simples para a preparação de micelas. Este método utiliza as propriedades de auto-montagem de um polímero anfifílico (por exemplo, DSPE-PEG) para formar micelas com núcleo e camadas estruturadas num ambiente aquoso. Este método de preparação de micelas tem várias vantagens. 1. Trata-se de um processo de formulação simples, o que evita a utilização de passos de redução de tamanho (complicados, tais como extrusão ou homogeneização) vulgarmente utilizados na preparação de lipossomas, nanopartículas, e nanoemulsões. 19 2. Ele tem uma boa reprodutibilidade. Excelente consistência de lote para lote pode ser conseguido uma vez que a formulação foi optimizado e estabelecida. O protocolo é tolerante a variações nas variáveis ​​do processo de preparação, tais como a resistência e o tempo de sonicação. Embora outros métodos (tais como a abordagem de diálise ou a abordagem de evaporação de emulsão-solvente) estão disponíveis para preparar micelas, a dispersão filmemétodo é mais conveniente e eficiente. Por conseguinte, tem um grande potencial para ser adaptado para o uso na fabricação em grande escala de micelas na indústria farmacêutica. A limitação deste método é que ele depende das propriedades de auto-montagem de materiais de suporte e, assim, é restrito a materiais com as mesmas propriedades. O inadequado selecção de materiais poliméricos pode levar à insuficiência na geração de formulações micelares satisfatórios. Além disso, o método de preparação baseia-se ultra-sons para dispersar o filme de polímero / fármaco e para facilitar a formação de micelas. Comercialmente mais banhos de ultra-sons disponíveis são adequados porque só uma energia ultra-sônica fraca é necessário para formar micelas. No entanto, pode ser um problema se um banho de ultra-sons com uma potência muito fraca é utilizada.

a carga de droga pobres e liberação prematura de drogas são as principais preocupações para a entrega de micelas de drogas. Neste protocolo, desenvolvemos uma estratégia pró-fármaco lipofílico para aumentar a cargaing da doxorrubicina em micelas DSPE-PEG. Conjugação de doxorrubicina com lípidos melhorou significativamente a compatibilidade e a interacção da droga com o núcleo lipídico das micelas de DSPE-PEG. A pró-droga, DOX-PA, foi sintetizada por conjugação com doxorrubicina lípido através de um ligante hidrazona pH-responsive ácida. Este ligante é estável a pH neutro e clivável a pH ácido. 20,21 Assim, DOX é carregado de forma estável em micelas de DSPE-PEG como um pró-fármaco a pH neutro e tem fuga mínima de droga durante a armazenagem e durante a circulação no sangue. Uma vez que as micelas de DOX-PA entrar nas células tumorais através de endocitose, DOX-PA pró-droga vai ser clivada e convertido em DOX livre em resposta ao ambiente endossoma ácida (pH 5-6). Desde DOX é mais hidrófilo do que a DOX-PA, esta conversão prejudicar as interacções entre DOX e o núcleo hidrofóbico de micelas, e, assim, facilitar a rápida libertação de DOX a partir de micelas. Este recurso design inovador vai evitar a libertação incompleta de drogas, queé um importante problema relacionado com conjugados de medicamentos utilizando ligantes não cliváveis ​​ou lenta de clivagem. 22 Esta abordagem também pode ser aplicada para a entrega de outros medicamentos. A selecção de um ligante adequado é crítico para o sucesso desta abordagem. Os ligantes devem ser estáveis ​​em um ambiente fisiológico, a fim de maximizar a estabilidade da formulação. Os ligantes devem também ser eficientemente clivado em resposta a desencadeia no microambiente tumoral (por exemplo, pH, enzimas, etc.) para libertar o fármaco original.

Neste protocolo, DOX-PA foi eficientemente carregado em micelas com elevada eficiência de encapsulação (~ 100%). A formulação micelar também demonstraram uma estabilidade superior e manteve-se intacto durante pelo menos três semanas, sem precipitação da droga ou a redução da concentração do fármaco. Isto é devido à maior interacção entre radicais lipídicos no pró-fármaco e o núcleo lipídico das micelas de DSPE-PEG. Engenharia da compatibilidade de moléculas portadoras com drogas para melhorar a sua interacção é uma estratégia promissora para a melhoria do desempenho de micelas e outros nanotransportadores. Esta abordagem pode aumentar a carga de fármaco e minimizar a libertação de drogas pré-madura para estes nanotransportadores. 23 A selecção de um par de droga / polímero adequado é um passo crítico na concepção da formulação micelar. A estrutura das moléculas de fármaco pode ser modificado (abordagem pró-fármaco) ou o desenho de materiais de suporte podem ser optimizadas, a fim de melhorar a compatibilidade e a aumentar as interacções fármaco / veículo. 23 24 Além disso, a modelação computacional pode ser uma ferramenta útil para ajudar na otimização de nanocarriers e torná-lo possível preparar um nanocarrier projetado sob medida para uma droga específica específico.

Em resumo, descreve-se aqui um método para sintetizar um pró-fármaco lipofílico de doxorrubicina. Protocolos para a preparação e caracterização de micelas carregadas com droga também são described. O método de película-dispersão é um método simples e promissor para a preparação de uma variedade de sistemas de entrega de auto-montagem em nano-escala. Os métodos de caracterização descritos aqui podem ser utilizados como padrão em ensaios in vitro para determinar as propriedades de nanomedicamentos, portanto, pode facilitar a optimização dos processos de formulação e desenvolvimento de produto.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17, (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6, (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9, (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26, (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11, (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1, (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143, (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54, (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7, (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48, (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11, (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334, (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86, (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164, (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46, (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43, (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87, (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13, (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11, (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8, (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

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