में हिंसक व्यवहार दूध पिलाने की परख * These authors contributed equally

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Lightfoot, J. W., Wilecki, M., Okumura, M., Sommer, R. J. Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes. J. Vis. Exp. (115), e54404, doi:10.3791/54404 (2016).

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Abstract

Introduction

उनके छोटे लेकिन जटिल नर्वस सिस्टम के साथ नेमाटोड व्यवहार सहित तंत्रिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को समझने के लिए शक्तिशाली उपकरण साबित कर दिया है। इस शोध के ज्यादातर मॉडल जीव Caenorhabditis एलिगेंस जिसमें अलग व्यवहार का खजाना सफलतापूर्वक विच्छेदित कर दिया गया है और विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है। ये mechanosensory 3, 4 कीमोटैक्टिक, thermotactic 5,6 और 7 magnetotactic प्रभावित संभोग 8,9, 10 सीखने और खिला व्यवहार 11 में शामिल हैं। हालांकि, अन्य अधिक दूर से संबंधित निमेटोड प्रजातियों व्यवहार जो rhabditid सी में नहीं मनाया जाता प्रदर्शित एलिगेंस या वैकल्पिक रूप से जटिलता है, जो उनके विकास और विनियमन के संबंध में उचित सवाल उठता है की अतिरिक्त स्तर दिखा। इस का एक उदाहरण इस तरह दूर से संबंधित diplogastrid निमेटोड Pristionchus pacificus है, जो बहुत अधिक जटिल हो खिला प्रदर्शित करता है में मनाया जा सकता हैhaviors और से सी में मनाया जाता लय एलिगेंस 1। इस के बावजूद दो प्रजातियों के मुताबिक़ ग्रसनी न्यूरॉन्स 12 बांटने है। इन अतिरिक्त खिला व्यवहार, पी के साथ coinciding pacificus भी, एक विस्तारित आहार रेंज को प्रदर्शित करता है के रूप में वे शौकीन चावला शिकारियों भी अन्य नेमाटोड के लार्वा पर ​​खिलाने से उनकी बैक्टीरियल आहार का सप्लीमेंट में सक्षम हैं। सौभाग्य से, पी pacificus तुलनात्मक और एकीकृत विकासवादी जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है और इसलिए कई आणविक और आनुवंशिक उपकरण अब उपलब्ध हैं। ये एक पूरी तरह से अनुक्रम और एनोटेट जीनोम 13, 14 और ट्रांसजीन CRISPR / Cas9 15,16 के रूप में अच्छी तरह के रूप में अपनी नई खोज की बहन प्रजातियों सहित 25 से अधिक बारीकी से संबंधित प्रजातियों के साथ एक विस्तृत और अच्छी तरह से एनोटेट फिलोजेनी 17 सहित आणविक और आनुवंशिक उपकरण शामिल हैं। इसके अलावा, पी सहित कई Pristionchus प्रजातियों की पारिस्थितिकी pacificus हम हैडालूँगा कई प्रजातियों के साथ परिभाषित अब scarab बीटल के साथ एक necromenic एसोसिएशन, वे अक्सर अन्य निमेटोड प्रजातियों 18 के साथ साझा एक मेजबान बांटने का वर्णन किया गया है। पी pacificus इसलिए साथ जो व्यवहार उपन्यास के विकास और उनके पारिस्थितिक महत्व टुकड़े करना एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।

आदेश में इस तरह के रूप में पी निमेटोड प्रजातियों में हिंसक खिला व्यवहार का विश्लेषण करने में pacificus हम आसान अवलोकन और हिंसक कार्रवाई की मात्रा का ठहराव के लिए कई उपन्यास व्यवहार assays विकसित की है। पी के रूप में pacificus एक द्विरूपी मुंह संरचना है, जो दृढ़ता से हिंसक व्यवहार को प्रभावित करती है, सही मोर्फोटाइप पहचान आवश्यक 1,2 है दिखाता है। संकीर्ण मुँह stenostomatous रूप एक भी कुंद पृष्ठीय दांत होते हैं और किसी भी हिंसक खिलाने में संलग्न नहीं है। वैकल्पिक रूप से, विस्तृत मुँह eurystomatous रूप में एक बहुत बड़ा पंजा आकार का पृष्ठीय दांत और एक अतिरिक्त का विरोध शामिलउप-उदर दांत, जो एक साथ कुशलता से अपने शिकार की छल्ली को खोलने के लिए कार्य करते हैं। गैर-हिंसक stenostomatous प्रपत्र को हिंसक eurystomatous के अनुपात पी भीतर Pristionchus प्रजातियों के बीच बदलता है और भी pacificus, तथापि, eurystomatous मुंह का प्रतिशत पी में morph 90% 2 - pacificus जंगली प्रकार तनाव (PS312) आम तौर पर 70 है। इसके अतिरिक्त, मुंह प्रपत्र अनुपात के पर्यावरणीय प्रभावों भिन्न (दोनों में जाना जाता है, भुखमरी और कुछ छोटे अणु के रूप में अच्छी तरह से अज्ञात कारकों के रूप में संकेत भी शामिल है), इस प्रकार सही पहचान और अलगाव हिंसक eurystomatous मुंह फार्म के आधार पर उतार चढ़ाव हो सकते सफल हिंसक assays के लिए आवश्यक है।

हिंसक मुंह प्रपत्र के विवरण के साथ-साथ हम प्रत्यक्ष अवलोकन और काटने की मौत हो गई और घटनाओं खिला सहित हिंसक व्यवहार की मात्रा का ठहराव के लिए एक "काटने परख" विकसित किया है। यहाँ शिकार नेमाटोड फिल्टर के माध्यम से अलग कर रहे हैंनव भूखे संस्कृतियों का हैैं और हिंसक वयस्क पी से अवगत कराया pacificus, जो थोड़े समय के अंतराल पर एक साथ मनाया जाता है। इसके अलावा, हम भी एक उच्च throughput "लाश परख" हिंसक घटनाओं के अप्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से हिंसक व्यवहार की तेजी से जांच की सुविधा के लिए विकसित किया है। यह शिकार के लिए स्क्रीन के लिए एक उपकरण के रूप में लार्वा लाशों की मौजूदगी का फायदा उठाते हैं। दोनों assays देख और ऐसे पी के रूप में निमेटोड प्रजातियों में हिंसक व्यवहार को मापने के लिए आसान है और अत्यधिक repeatable तरीके प्रदान pacificus।

Protocol

1. मुँह प्रपत्र phenotyping

  1. Agarose पैड पर मुंह पर्चा पहचान
    नोट: आदेश में, निमेटोड मुंह morphs कल्पना agarose पैड पर एक हल्के संवेदनाहारी के उपचार के साथ कीड़े स्थिर करना और इस प्रकार के रूप में निरीक्षण करने के लिए।
    1. आगे बढ़ें और ऐसे पी के रूप में निमेटोड संस्कृतियों को बनाए रखने pacificus पर 6 सेमी मानक निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) प्लेटें और के एक जीवाणु लॉन पर फ़ीड कोलाई OP50 19।
    2. पहले 3 मिलीलीटर 2% agarose समाधान करने के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 3 मिलीलीटर एच 2 ओ को 0.06 छ agarose जोड़कर agarose पैड बनाने। यह 4 डिग्री सेल्सियस पर एक साल तक के लिए भंडारित किया जा सकता है
    3. मिक्स और एक माइक्रोवेव में अच्छी तरह से पिघल agarose या वैकल्पिक रूप से एक गर्मी ब्लॉक> 88 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट का उपयोग
    4. एक बार पूरी तरह पिघल, agarose करने के लिए एक 10% सोडियम azide समाधान के 10 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। चेतावनी: सूखी सोडियम azide प्रतिक्रियाशील है और सभी रूपों विषाक्त कर रहे हैं।
    5. 1 मिलीलीटर का प्रयोगmicropipette, एक मानक गिलास खुर्दबीन स्लाइड के बीच पर तरल agarose azide मिश्रण का कोई कम से कम 300 μl की एक बूंद जगह है।
    6. इससे पहले कि अगर होता है, जल्दी से आदेश agarose जो ठंडा होने पर एक पैड रूपों को समतल करने में गिरावट के शीर्ष पर एक दूसरे खुर्दबीन स्लाइड जगह है। के रूप में कई पैड के लिए दोहराएँ के रूप में आवश्यक है।
    7. बस उन्हें एक दूसरे से दूर फिसलने से उपयोग करने, छील के अलावा कांच खुर्दबीन स्लाइड पहले। नोट: agarose पैड अग्रिम में भी अभी तक तैयार कर रहे हैं वे जरूरत से ज्यादा शुष्क हो सकता है और नेमाटोड नुकसान हो सकता है।
    8. पैड के केंद्र पर - (3 μl 2) संवेदनाहारी agarose पैड करने के लिए कीड़े हस्तांतरण करने के लिए, M9 बफर की एक बूंद जगह है। इस यूजर को 2 - 3 जवान पी पैड पर ध्यान से एक कवर पर्ची रखने से पहले M9 की बूंद में pacificus वयस्कों। पी pacificus नेमाटोड agarose में स्थिर और कल्पना करने के लिए तैयार हो जाएगा।
    9. एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप एक माइक्रोस्कोप anesthetized कीड़ा युक्त स्लाइड स्थानांतरणएन डी 63X Nomarski प्रकाशिकी के तहत निरीक्षण करते हैं। वर्गीकृत निम्नलिखित विशेषताओं के आधार पर रूप पहचान: एक अतिरिक्त उप-उदर दांत, बढ़े हुए पृष्ठीय दांत और चौड़े मुंह खोलने की उपस्थिति, एक eurystomatous मुंह रूप जानवर का सूचक है, जबकि एक भी पृष्ठीय दांत और संकरा मुंह खोलने की उपस्थिति एक stenostomatous इंगित करता है जानवर (चित्रा 1)।
      नोट: पशु के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, कीड़े अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए अगर पैड पर बनाए रखा जाना चाहिए।
    10. मुंह रूप पहचान करने के बाद, या तो eurystomatous या stenostomatous नेमाटोड के रूप में धीरे इसे बंद agarose पैड फिसलने से कवर पर्ची हटाने के द्वारा आवश्यक ठीक हो। ध्यान से agarose पैड से चयनित जानवरों लेने ताजा एन जी एम प्लेटों पर (ई कोलाई OP50 मदद करने के लिए यह stickier बना ले पर इस्तेमाल किया जा सकता है)। संवेदनाहारी से वसूली की अनुमति जब तक सामान्य गतिशील व्यवहार शुरू कर दी है जिस पर जानवरों के आगे हिंसक assays के लिए तैयार हैं।
  2. <li> रैपिड मुँह phenotyping
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अधिक अनुभव के साथ, मुंह प्रपत्र प्रकार उच्च बढ़ाई (150X) के साथ एक stereomicroscope के माध्यम से किसी भी संवेदनाहारी के इलाज के लिए आवश्यकता के बिना यत्न किया जा सकता है।
    1. की एक जीवाणु लॉन के साथ मानक एन जी एम प्लेटों पर प्लेस नेमाटोड माइक्रोस्कोप देखने के क्षेत्र पर कोलाई OP50।
    2. मुंह के आकार और चौड़ाई में अंतर का पता लगाने। नोट: इस बढ़ाई संरचनाओं की तरह कोई दांत इसलिए मुंह रूप पहचान पूरी तरह संकीर्ण मुंह बनाम विस्तृत मुंह पर आधारित है प्रत्यक्ष कर रहे हैं।

2. काटो परख

नोट: काट assays एक विस्तृत हिंसक व्यवहार विश्लेषण की अनुमति है।

  1. आगे बढ़ें और मानक एन जी एम प्लेट (6 सेमी) पर निमेटोड संस्कृतियों को बनाए रखने और के एक जीवाणु लॉन पर फ़ीड कोलाई OP50 19।
  2. ऐसे सी के रूप में चयनित शिकार निमेटोड लार्वा की एक बड़ी मात्रा बढ़ती द्वारा परख प्लेटें बनाओ एलिगेंस या अलternatively एक उपयुक्त पारिस्थितिकी प्रासंगिक शिकार। नोट: वयस्क सी एलिगेंस भी उपयुक्त शिकार होना करने के लिए बड़े हैं तो यह लार्वा चरण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. सी बनाए रखें एलिगेंस या के एक जीवाणु लॉन पर मानक एन जी एम प्लेटों और चारा पर अन्य संभावित शिकार प्रजातियों कोलाई OP50 जब तक जनसंख्या हौसले की कमी से जूझ रहा है, युवा एल 1 लार्वा की एक बहुतायत में जिसके परिणामस्वरूप।
      नोट: भुखमरी के लिए समय कई पर्यावरण और प्रयोगात्मक कारकों, संस्कृति शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया नेमाटोड की संख्या, की राशि शामिल है, पर निर्भर है कोलाई OP50 गयी, और परिवेश के तापमान।
  3. M9 के साथ चार या अधिक हौसले की कमी से जूझ शिकार प्लेटें धोने और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में संग्रह करने से पहले सभी बड़े जानवरों और किसी भी शेष अंडे को दूर करने के लिए दो 20 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से कीड़ा समाधान गुजरती हैं। केवल छोटे लार्वा समाधान में रहना चाहिए।
  4. एक लार्वा गोली 1 मिनट के लिए 377 XG पर छान शिकार अपकेंद्रित्र के रूप में।
  5. ई के साथ एक 6 सेमी एन जी एम थाली पर शुद्ध कीड़ा गोली के μl कोलाई OP50 वर्तमान और इंतजार में कम से कम 30 मिनट के लार्वा पर्याप्त बाहर का प्रसार करने के लिए एक परख प्लेट उत्पन्न करते हैं।
    नोट: मानक परख प्लेटों पर शुद्ध कीड़ा गोली के 3 μl> 3,000 शिकार लार्वा होते हैं। यह शिकारियों और शिकार के बीच लगातार संपर्क उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है।
  6. आवश्यक मुंह रूप (1 प्रोटोकॉल) के लिए स्क्रीन हिंसक नेमाटोड।
  7. मानक कीड़ा उठा तकनीकों और एक प्रकाश stereomicroscope 19 का उपयोग करना, परख थाली करने पर सही ढंग से वर्गीकृत शिकारियों हस्तांतरण। जब आदेश जीवाणु संक्रमण को कम करने में शिकारियों के हस्तांतरण परख थाली करने के लिए जितना संभव हो कम OP50 बैक्टीरिया हस्तांतरण करने के लिए ध्यान रखना। कीड़ा का तबादला होने के तनाव से उबरने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कीड़े हस्तांतरण से क्षतिग्रस्त नहीं किया गया है जंगली प्रकार गतिशील व्यवहार के लिए जाँच करने के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: पी भूखा करने की कोई जरूरत नहीं है पीएसीificus, के रूप में वे अन्य निमेटोड लार्वा की अत्यधिक कुशल शिकारियों करते हुए भी अच्छी तरह से बैक्टीरिया पर खिलाया जाता है।
  8. वसूली के बाद, 10 मिनट के लिए एक प्रकाश stereomicroscope का उपयोग शिकारी निरीक्षण करते हैं। इस उपकरण के साथ, पालन और इस तरह काट रहा है, शिकारी शिकार के आंदोलन को प्रतिबंधित करने की विशेषता के रूप में अलग खिला घटनाओं को चिह्नित;, हत्या, जहां शिकार छल्ली का पता चला है की एक खोलने के द्वारा; और खिला, शिकार धर्मशाला (चित्रा 2A, बी और मूवी 1) के एक नमूदार खपत द्वारा वर्गीकृत।
  9. स्क्रीनिंग और 10 अलग-अलग हिंसक नेमाटोड की एक न्यूनतम अवलोकन सटीकता सुनिश्चित करने के द्वारा परख दोहराएँ।

3. लाश परख

नोट: लाश assays के हिंसक व्यवहार का एक और अधिक तेजी मात्रा का ठहराव की सुविधा।

  1. आगे बढ़ें और मानक एन जी एम प्लेटों पर निमेटोड संस्कृतियों को बनाए रखने और एक जीवाणु एल पर फ़ीड का अन्न की बाल कोलाई OP50 19। परख प्लेटें पहले उल्लेख (- 2.5 प्रोटोकॉल 2.1) के triplicates उत्पन्न करता है।
  2. आवश्यक मुंह रूप देने के लिए स्क्रीन हिंसक नेमाटोड के रूप में प्रोटोकॉल 1 में वर्णित मानक कीड़ा उठा तकनीकों और प्रत्येक परख थाली करने के लिए आवश्यक मुंह रूप के साथ एक प्रकाश stereomicroscope हस्तांतरण 5 हिंसक नेमाटोड का उपयोग करना। 2 घंटे के लिए शिकार के साथ एक साथ शिकारियों छोड़ दें।
  3. 2 घंटा स्क्रीन खाली कर लाशों (चित्रा 2 बी और सी) की उपस्थिति के लिए परख थाली के बाद। धर्मशाला लीक या कीड़ा टुकड़े लापता सहित स्पष्ट रूपात्मक दोष के साथ-साथ गतिशीलता के अभाव से लाशों को पहचानें।

4. ग्रसनी और टूथ आंदोलन का विश्लेषण

  1. आगे बढ़ें और मानक एन जी एम प्लेटों पर निमेटोड संस्कृतियों को बनाए रखने और के एक जीवाणु लॉन पर फ़ीड कोलाई OP50 19। परख प्लेटें उत्पन्न पहले (प्रोटोकॉल 2.1 - 2.5) उल्लेख किया है। अगर मानक 6 सेमीएन जी एम प्लेटों उद्देश्य और माइक्रोस्कोप मंच के बीच फिट नहीं है, छोटे 35 मिमी पेट्री एक उपयुक्त विकल्प के रूप में 2 मिलीलीटर एन जी एम युक्त व्यंजन का ढक्कन का उपयोग करें।
  2. आवश्यक मुंह रूप देने के लिए स्क्रीन हिंसक नेमाटोड प्रोटोकॉल 1 में वर्णित के रूप में मानक कीड़ा तकनीक उठा और एक प्रकाश stereomicroscope का प्रयोग, परख थाली करने के लिए पर एक भी सही ढंग से वर्गीकृत शिकारी हस्तांतरण। कीड़ा का तबादला होने के तनाव से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  3. 40 पर एक माइक्रोस्कोप पर हिंसक जानवरों का निरीक्षण करें - 63X Normaski, एक उच्च गति कैमरा (फिल्म 2 और 3) के साथ। रिकार्ड ग्रसनी पंप और 15 सेकंड से अधिक दांत आंदोलन, कम से कम 20 जानवरों में 50 हर्ट्ज पर सटीक मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए। फिर से खेलना आदेश व्यक्तिगत पंप और दांत की घटनाओं की गिनती करने में वांछित गति से फिल्में दर्ज की गई।
    नोट: पंप, कोष, ग्रसनी के मध्य में स्थित में मनाया जाता है, जबकि दांत आंदोलन मुंह खोलने में detectable है और केवल ओबी हैपृष्ठीय दांत से सेवा की।

Representative Results

पी में उचित मुंह रूप से सफल पहचान के बाद pacificus, eurystomatous और stenostomatous जानवरों के बीच स्पष्ट मतभेद केवल eurystomatous व्यवहार की हत्या में उलझाने जानवरों के साथ (चित्रा 3) का पता लगाया जा सकता है। stenostomatous जानवरों में इस व्यवहार को पूरी तरह से दबा दिया जा रहा है। इसके अलावा, दांत गतिविधि और ग्रसनी बैक्टीरिया और शिकार पर eurystomatous जानवरों के पंप में मतभेद (और चित्रा 4 और फिल्म 2 3) ने भी स्पष्ट कर रहे हैं। जबकि हिंसक खिला, पम्पिंग दर बैक्टीरियल खिलाने और दांत आंदोलन ग्रसनी पंप के साथ एक अनुपात करने के लिए एक से एक में पाया जाता है के दौरान देखा कि नीचे कम हो जाता है। इस कुंजी नियामक आहार भिन्न करने के लिए व्यवहार प्रतिक्रिया नियमन तंत्र के संभावित संकेत है।

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चित्रा 1. पी pacificus एक मुँह द्विरूपता जो खिला व्यवहार को प्रभावित करती है। (ए) eurystomatous मुंह प्रपत्र शिकार करने में सक्षम है और एक बड़े आकार का पंजा पृष्ठीय दांत (झूठी रंग लाल) और (बी) के एक बड़े आकार का विरोध हुक उप-उदर दांत (झूठी रंग नीला) के साथ एक चौड़े मुंह खोलने की है। (सी) stenostomatous मुंह प्रपत्र केवल बैक्टीरिया पर फ़ीड करने में सक्षम है और एक चकमक पत्थर के आकार का पृष्ठीय दांत (झूठी रंग लाल) और (डी) कोई उप-उदर दांत (*) के साथ एक संकरा मुंह खोलने की है। Normaski छवियों 63X हैं और बड़े पैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
शिकार assays। (ए) पी pacificus काटता है और ऐसे सी के रूप में अन्य नेमाटोड के लार्वा को मारता है एलिगेंस। (बी) के काटने assays के लिए, bitesby शिकारियों (*) की संख्या एक प्रकाश stereomicroscope और सफल हत्या का उपयोग कर और घटनाओं को भी दर्ज की गई खिला देखा जा सकता है। लाशों लाश assays के लिए दिखाई (हलकों) स्पष्ट रूप से भी कर रहे हैं। (सी), लार्वा शवों (तीर) आसानी से लार्वा रहने वाले की तुलना में पहचाना जा सकता है। स्केल पट्टी बी में 1 मिमी और सी में 150 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. काटने और सी पर लाश assays के परिणाम एलिगेंस शिकार करते हैं। (ए) काटने व्यवहार ही स्पष्ट है इस व्यवहार के साथ eurystomatous मुंह रूप में stenostomatous पशुओं में प्रदर्शित नहीं किया। त्रुटि बार 10 प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) कोई काट व्यवहार stenostomatous जानवरों से स्पष्ट के साथ coinciding, लाश assays भी केवल eurystomatous जानवरों की परख प्लेटों पर शवों का पता चलता है। त्रुटि बार 5 प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Eurystomatous हिंसक दूध पिलाने के दौरान दर और टूथ आंदोलन को पंप। टूथ आंदोलन केवल जबकि eurystomatous जानवरों हिंसक खिलाने में लगे हुए हैं मनाया जाता है। यह भी ग्रसनी पंप में कमी के साथ मेल खाता है। त्रुटि बार 10 प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है। href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
मूवी 1. एक लाइट stereomicroscope का उपयोग काटो परख के लिए व्यवहार हत्या का अवलोकन। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

फिल्म 2
पी की मूवी 2. उच्च गति कैमरा मूवी pacificus सी की हत्या एलिगेंस लार्वा। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

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मूवी 3. शिकार के दौरान टूथ आंदोलन की उच्च गति कैमरा में तेजी से बढ़ी। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

Discussion

नेमाटोड सी के साथ तंत्रिका जीव विज्ञान और व्यवहार को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान एलिगेंस इस प्रकार अब तक प्राथमिक उपकरण किया जा रहा है। पी सहित हालांकि, कई प्रजातियों निमेटोड pacificus प्रदर्शन व्यवहार है, जो अनुपस्थित रहे हैं या मॉडल जीव सी से जटिलताओं में भिन्नता एलिगेंस और इसलिए विकास और इन कार्यों के नियमन के बारे में आकर्षक सवाल उठा। ऐसा ही एक अतिरिक्त व्यवहार पी सहित कई अन्य निमेटोड प्रजातियों में पाया pacificus क्षमता हिंसक खिला 1, 20 में उलझाने के द्वारा अपने बैक्टीरियल आहार पूरक है। इसलिए हम विकसित किया है और नेमाटोड में ये पहले से unanalyzed हिंसक व्यवहार के लिए आसान और तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है।

सबसे पहले, हम निमेटोड मुंह के भीतर तंत्र खिलाने में बदलाव के लिए स्क्रीन करने के तरीकों प्रदान की है। सही मुंह प्रकार की पहचान के लिए एक आवश्यक पहला s हैसफल शिकार assays के लिए TEP, के रूप में कम से कम Pristionchus जीनस के भीतर ही eurystomatous जानवरों हिंसक खिलाने में सक्षम हैं। यह सबसे अच्छा मुँह इस पद्धति के रूप में प्रोटोकॉल 1.2 में वर्णित "तेजी से मुंह phenotyping" प्रोटोकॉल के साथ morphs की पहचान है बहुत कम आक्रामक है और इसलिए यह कम संभावना है कि हिंसक व्यवहार परेशान किया जा सकता है। हालांकि, यह पहली अगर पैड पर anesthetized जानवरों (प्रोटोकॉल 1.1) के साथ पहचान से अलग मुंह संरचनाओं के साथ परिचित बनने के लिए सिफारिश की है।

वांछित मुंह रूप की पहचान के बाद, हम हिंसक खिला बढ़ाता के लिए दो assays का वर्णन किया है। ये एक तेजी से, उच्च throughput "लाश परख" (प्रोटोकॉल 3) और एक अधिक समय लगता है लेकिन अधिक गहराई "काटने परख" के माध्यम से व्यवहार विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2) कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉल के दोनों आदेश experimen के आधार पर assays अनुकूलन करने में कई संशोधनों के लिए अनुमति अत्यधिक लचीला कर रहे हैंताल आवश्यकताओं। पी का उपयोग कर काटने assays के लिए सी पर pacificus शिकारियों एलिगेंस शिकार, 10 मिनट की एक समय खिड़की के लिए हिंसक व्यवहार बातचीत की टिप्पणियों अन्य खिला घटनाओं के साथ-साथ काटने का एक महत्वपूर्ण राशि यों के लिए पर्याप्त था। "लाश assays" फिर पी के उपयोग के लिए सी पर pacificus शिकारियों एलिगेंस शिकार, 2 घंटे के लिए 5 शिकारियों आसानी से मात्रात्मक और लगातार लाश तेजी से व्यवहार विश्लेषण के लिए अनुमति संख्या का उत्पादन किया। हालांकि, यह अलग गति में हिंसक निमेटोड चाल की विभिन्न प्रजातियों ध्यान दिया जाना चाहिए, अलग दरों पर खाने के लिए और आम तौर पर अन्य व्यवहार 1 में एक बड़ी विविधता प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न शिकार प्रजातियों को भी इसी तरह के कारणों के लिए अलग-अलग दरों पर खाया जा सकता है। इसलिए यह पर्यावरण की स्थिति में कोई मतभेद के लिए दोनों का परीक्षण किया शिकारियों और शिकार के रूप में निमेटोड प्रजातियों पर आधारित assays के अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है, और भी है। दोनों "काटने" और "कोर के दौरानई "assays यह महत्वपूर्ण है कि दोनों शिकार और शिकारियों स्वस्थ रूप में जोर दिया या घायल शिकारियों कुशलता से मार नहीं होगा रहे हैं। इसके अलावा, नए सिरे से परख प्लेटें पुराने प्लेटों बाहर सूख जो प्रतिकूल गलत करने के लिए अग्रणी नेमाटोड के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हो के रूप में आवश्यक हैं assays। यह भी आशा व्यक्त की है कि इन हिंसक assays के भविष्य पुनरावृत्तियों क्रम में प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों का लाभ लेने के विश्लेषण के ज्यादा स्वचालित करने में सक्षम के रूप में कई व्यवहार सी में मनाया एलिगेंस 21, 22 की जांच के लिए पूरा किया गया है हो सकता है। वर्तमान में समस्याओं ऐसे पी pacificus के रूप में नेमाटोड में पैदा होने की संभावना हैं, क्योंकि वे बहुत अधिक संवेदनशील संपर्क करने के लिए दिखाई देते हैं, हिंसक खिला रद्द करने की संभावना microfluidic कक्षों में अलगाव और स्थिरीकरण कर रही है। इस चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, लेकिन अलग-अलग नेमाटोड सुविधा होगी पर काबू पाने सूक्ष्म हिंसक लिए जांच की जा करने के लिए व्यवहार।

अंत में, हम भी तरीके के लिए प्रदान की हैआर निमेटोड खिला तंत्र अपने आप में एक उच्च गति कैमरा (प्रोटोकॉल 4) का उपयोग दांत और ग्रसनी पंप कैनेटीक्स बढ़ाता द्वारा हिंसक और बैक्टीरियल खिला मोड के बीच तुलना की सुविधा की जांच। सी में ग्रसनी पंप दरों की मात्रा का ठहराव एलिगेंस सी कई वर्षों के लिए 23 खिला की निगरानी के लिए उपयोग किया गया है, हालांकि, एलिगेंस मुंह दंतिका के किसी भी रूप का अभाव है और भी हिंसक व्यवहार का अभाव है। ग्रसनी दांत गतिविधि के उस के साथ पम्पिंग की मात्रा का ठहराव के संयोजन के माध्यम से, दांत शिकार करने के लिए विशेष के किसी भी तंत्रिका वितरण भी देखा जा सकता है। बढ़ाई दांत आंदोलन पशु अक्सर फोकल हवाई जहाज़ से बाहर ले जाने के लिए निरीक्षण करने की आवश्यकता के कारण, इस प्रकार यह आमतौर पर ही संभव कम समय खिड़कियों के लिए दांत का निरीक्षण करने के लिए है। इसके अतिरिक्त, सी के विपरीत एलिगेंस, पी के ग्रसनी pacificus लगातार पंप नहीं है, बल्कि यह पंप और खिलाने के मंत्र में संलग्न है। इसलिए, सटीक ग्रसनी पम के लिएपिंग दरों जबकि खिला निर्धारित किया जाना है, यह निरंतर खिलाने के 15 सेकंड के रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यहाँ प्रस्तुत इन विधियों इसलिए निमेटोड प्रणालियों में हिंसक व्यवहार की जांच के लिए पहले ढांचा प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे भी सूक्ष्मजीवों, कवक और कण सहित शिकार पर अतिरिक्त पारिस्थितिकी प्रासंगिक जीवों के प्रभाव सहित निमेटोड पारिस्थितिकी तंत्र के भीतर अन्य बातचीत की जांच में उपयोग के लिए अनुकूल हो सकता है । इस प्रकार वे टुकड़े करना है कि कैसे इन हिंसक व्यवहार नियंत्रित कर रहे हैं, वे कैसे विकसित हो सकता है और यह भी उनके पारिस्थितिक महत्व एक साधन प्रदान करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nylon net filters (20 µm) Merck Millipore Ltd NY2004700 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
PP Funnel for filter (54 mm) Duran 292215003 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
Small petri dish (35/10 mm) Greiner Bio-One  627102 For imaging on High speed camera
Zeiss SteREO Discovery V12 For mouth form identificaton
Axio-Imager A1 For mouth form identificaton
Glass Slides Roth H869
Cover Slips Roth 657
Motion Scope M3 Highspeed camera IDT High speed camera
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X Zeis 452984-0000-000 High speed camera zoom
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:
Agar Roth 5210.2 CAS-Nr. 9002-18-0
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5
Bacto Tryptone BD 211699 Lot 4316614
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C3306 CAS-Nr. 10035-04-8
Cholesterol from lanolin Sigma-Aldrich F 26732 00050 CAS-Nr. 57-88-5
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 CAS-Nr. 10034-99-8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
6 cm petri dish Greiner Bio-One 628102
3.5 cm petri dish Greiner Bio-One 627102
M9 ingredients:
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) Sigma-Aldrich S9390-500G-D CAS-Nr. 7782-85-6
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5

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References

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