测定掠夺取食行为 * These authors contributed equally

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Lightfoot, J. W., Wilecki, M., Okumura, M., Sommer, R. J. Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes. J. Vis. Exp. (115), e54404, doi:10.3791/54404 (2016).

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Abstract

Introduction

与他们的小而复杂的神经系统线虫已经证明了强大的工具,对于理解神经生物学的许多方面,包括行为。这类研究的大部分都集中在模式生物线虫在其中一个丰富 ​​不同的行为已经被成功地解剖和分析。这些措施包括mechanosensory 3,4趋化,thermotactic 5,67磁感影响交配8,9,学习10和取食行为11。然而,其他更远亲线虫物种显示哪些没有在rhabditid C.观察到的行为线虫或交替显示的复杂性,这引起了有关其发展和监管相关问题的其他级别。这方面的一个这样的实例可以在远亲diplogastrid线虫Pristionchus pacificus,其中显示更复杂的馈送是被观察haviors和节奏比C.观察线虫1。尽管这是两个物种同源共享咽神经元12。这些额外的供给行为,巧合的P. pacificus还显示扩展的饮食范围,因为他们是狂热的食肉动物,能够通过喂养也是在其他线虫幼虫补充他们的饮食细菌的。幸运的是,P。 pacificus已发展为进行比较和综合进化生物学模型,因此许多分子和遗传工具现已上市。这些措施包括一个完全测序和基因组注释13,分子和基因工具,包括转基因14和CRISPR / Cas9 15,16以及一个详细和系统发育注释17,拥有超过25密切相关的物种,包括其新发现的物种的姐妹。此外,众多的Pristionchus物种的生态,包括P. pacificus是我们现在有被描述了许多种定义LL与共享金龟子一个necromenic协会,他们经常与其他线虫种类18共享一台主机。P.因此pacificus提供与剖析小说行为的演变及其生态意义的优秀模型系统。

为了分析在线虫物种如铜绿掠夺取食行为pacificus我们开发,便于观察和掠夺行为的量化几种新的行为检测。为P. pacificus显示二形口结构,它强烈地影响掠夺行为,正确的形态类型的识别是必不可少的1,2。窄口stenostomatous变形包含一个钝齿背在任何掠夺性喂养不参与。可替代地,广口eurystomatous变形包括大得多的爪形背齿和一个额外的相对亚腹侧齿,它们一起工作以有效地打开他们的猎物的角质层。掠夺eurystomatous到非掠夺stenostomatous形式的比率Pristionchus物种的不同而不同,也内P. pacificus然而 ,eurystomatous口的百分比变形在P. pacificus野生型菌株(PS312)通常是70 - 90%2。此外,嘴形比可能出现波动取决于不同的环境因素(包括已知的,包括饥饿和一些小分子信号以及未知因素)掠夺eurystomatous口形式,从而正确识别和隔离是成功的掠夺性检测是必不可少的。

除了掠夺口形式的描述中,我们制定了“啃法”的直接观察和掠夺性的行为,包括咬,杀害和饲养活动的定量。这里猎物线虫是通过过滤器隔离ING新饿死文化并暴露在掠夺成人P. pacificus,这是在很短的时间跨度观察在一起。此外,我们还开发了高通量“尸实验”,通过掠夺性事件的间接观测便于掠夺行为快速筛选。这需要幼虫尸体的存在优势,筛选捕食的工具。这两个实验提供了方便和高度可重复的观察和线虫如铜绿测量掠夺行为的方法pacificus。

Protocol

1.口形式表型

  1. 嘴形鉴定琼脂糖片
    注意:为了形象化线虫口摇身一变,用固定在琼脂糖垫温和的麻醉剂治疗的蠕虫和观察如下。
    1. 成长和维护线虫文化,如P. pacificus 6厘米标准线虫生长介质(NGM)板和大肠杆菌的细菌草坪饲料大肠杆菌 OP50 19。
    2. 通过在一个15毫升管第一加法0.06克琼脂糖至3ml H 2 O操作制作3个×2%琼脂糖溶液使琼脂糖垫。这可以在4°C被存储长达一年
    3. 混合并在微波炉彻底融化琼脂糖或选择使用加热块设置为> 88°C。
    4. 一旦完全熔化,加入10微升10%的叠氮化钠溶液的琼脂糖调匀。注意:干叠氮化钠是被动的和一切形式是有毒的。
    5. 用1毫升微量,放置不小于300微升液体琼脂糖叠氮化物混合物一滴到一个标准的玻璃显微镜载片的中间。
    6. 琼脂冷却之前,迅速地放置在滴的顶部的第二载玻片以弄平其在冷却时形成一个垫的琼脂糖。如需要重复尽可能多垫。
    7. 只需通过滑动关闭它们彼此使用,果皮分开显微镜玻片之前。注意:如果琼脂糖焊盘提前太多制备它们可以是过于干燥,并可能损坏线虫。
    8. 蠕虫转移到麻醉剂琼脂糖垫,放置的M9缓冲一滴(2 - 3微升)到垫上的中心位置。选择2 - 3年轻的P. pacificus大人到M9的在焊盘精心放置盖玻片前下降。该P. pacificus线虫会在琼脂糖固定化并准备进行可视化。
    9. 传送含有麻醉蠕虫显微镜载玻片到适当的显微镜第二下63X光学诺马斯基观察。分类基于以下特征变形标识:一个附加的子腹侧齿,放大背侧齿和广口开口的存在标示着eurystomatous口变形动物的,而一个单一的背齿和窄口开口的存在指示stenostomatous动物( 图1)。
      注意:为了维持动物的健康,蠕虫应保持在不超过5分钟的琼脂垫。
    10. 口变身经过鉴定,恢复的要求通过轻轻滑动它关闭琼脂糖垫取出盖玻片要么eurystomatous或stenostomatous线虫。仔细挑选从琼脂糖垫所选动物( 大肠杆菌 OP50可以在拾取被用于帮助使它粘)到新鲜NGM板。允许从麻醉恢复正常之前,能动的行为已经恢复赖以动物准备作进一步化验掠夺。
  2. <李> 快速口表型
    注意:可替换地,具有更多的经验,口腔形式类型可以,而不需要通过以高倍率(150X)立体显微镜任何麻醉剂治疗测定。
    1. 标准NGM板的地方线虫具有E的细菌草坪大肠杆菌 OP50到显微镜的视野。
    2. 检测口尺寸和宽度的差异。注:在此放大状结构无齿是可观测因此口变形识别是完全基于宽口窄与嘴巴。

2.咬分析

注:咬测定允许一个详细的掠夺行为分析。

  1. 发展和维护标准NGM板(6厘米)线虫文化和大肠杆菌的细菌草坪饲料大肠杆菌 OP50 19。
  2. 通过生长选定猎物线虫幼虫大量如C使测定平板线虫或人替换地适当的生态相关的猎物。注:成人C.线虫过大,是合适的猎物所以它使用幼虫阶段是重要的。
    1. C.维护线虫大肠杆菌的细菌草坪上标准NGM板和进给其他潜在的猎物大肠杆菌 OP50,直到人口新鲜饿死,造成丰盈的年轻L1幼虫。
      注意:时间饥饿是依赖于许多环境和实验因素,包括用于启动培养线虫数, 大肠杆菌的量大肠杆菌 OP50,并将环境温度。
  3. 洗四个或更多的新鲜饥饿猎物板与M9和通过两个20微米的过滤器通过蜗杆溶液收集之前,除去所有大的动物和任何剩余的卵在一个15毫升管。只有小幼虫应保持在溶液中。
  4. 为了形成一个幼虫粒料离心过滤猎物在377 xg离心1分钟。
  5. E.将6cm NGM板大肠杆菌 OP50目前并等待至少30分钟的幼虫传播出去,足以产生一个检测板。
    注:纯虫丸3微升的标准检测板含有> 3000捕食幼虫。这是足以产生捕食者和猎物之间的频繁接触。
  6. 屏幕掠夺线虫为所需嘴变形(方案1)。
  7. 使用标准的蠕虫采摘技术和光立体显微镜19,到测定板转移正确分类捕食者。照顾以减少细菌污染转印天敌时尽可能少OP50细菌尽可能转移到测定板。等待15分钟,以允许蜗杆从被传送的应力恢复并检查野生型能动行为,以确保蠕虫没有被从转印损坏。
    注:无需挨饿P. PACificus,因为它们是其他线虫幼虫高效大鳄在细菌甚至在吃得饱饱的。
  8. 恢复后,使用光体视显微镜10分钟观察捕食者。有了这个设备,观察和描述不同的喂养活动,如 ,其特点是捕食者限制猎物的运动; 杀害 ,其中由猎物角质层被检测的开口;和馈送 ,由猎物内脏( 2A,B电影1)的可观察到的消耗分类。
  9. 通过筛选和观察至少10个人掠夺性线虫,以确保准确性重复检测。

3.尸分析

注:尸体化验便于掠夺行为更快速的定量分析。

  1. 发展和维护标准的NGM板线虫文化和在细菌L饲料E.芒的大肠杆菌 OP50 19。生成前面提到的测定板(协议2.1 - 2.5)的一式三份。
  2. 为所需的口变形屏幕掠夺性线虫协议1所描述的使用标准蠕虫采摘技术和必要的口腔变形,以每块测定板轻体视显微镜转移5掠夺性线虫。与猎物2小时离开大鳄在一起。
  3. 2小时后屏幕的测定板为空尸体( 图2BC)的存在。由于缺乏运动与明显的形态缺陷,包括内脏泄漏或丢失的蠕虫病毒片段一起找出尸体。

4.咽牙齿移动的分析

  1. 发展和维护标准的NGM板线虫文化和大肠杆菌的细菌草坪饲料大肠杆菌 OP50 19。生成检测板如以前(协议2.1 - 2.5)提及。如果标准6厘米NGM板不物镜和显微镜载物台之间适合,可使用的含2ml NGM作为合适的替代小35毫米培养皿盖。
  2. 为所需的口变形屏幕捕食性线虫如方案1中所述使用标准蜗杆采摘技术和光立体显微镜,对到测定板中传输单个正确分类捕食者。等待15分钟,使蠕虫,从被转移的压力中恢复。
  3. 观察显微镜食肉动物在40 - 63X Normaski,用高速摄像机( 电影23)。记录咽抽水,在15秒内牙移动,​​在至少20个动物50赫兹,以保证精确的定量。重播记录在所需速度的电影,以计算单个泵和牙齿的事件。
    注意:泵送在语料库,位于咽的中间观察到的,而牙齿移动是在口开口可检测,仅作业从背齿服务。

Representative Results

P.适当的口变形的识别成功pacificus,eurystomatous和stenostomatous动物之间明显的差异可以被检测( 图3)仅与eurystomatous动物杀死行为接合。在stenostomatous动物这种行为似乎完全被抑制。此外,在eurystomatous动物对细菌和猎物齿活性和咽泵送差异( 图4影23)也很明显。而掠夺馈送,泵送速率降低低于在一比一的比例与咽泵送检测细菌馈送和牙齿移动过程中观察到。这是潜在的指示调节到不同的饮食行为反应的关键调节机制。

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图1. P. pacificus 有嘴异形从而影响摄食行为。 (一)eurystomatous口形态能捕食,并与大爪形背齿(假色红色)和(B)的大型对方钩形亚腹侧齿(假色蓝色)宽口的开口。 (三)stenostomatous口形式只能对细菌饲料,并与火石形背齿(假色红色)和(D)没有子腹齿(*)较窄张口。 Normaski图像63X和比例尺条为10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
捕食检测。(A)P. pacificus咬伤并杀死其他线虫,如C.幼虫线虫。(B)对于咬测定,可以使用光立体显微镜和成功的杀伤和喂食事件还记录观察bitesby食肉 ​​动物(*)的数量。尸体也清晰可见(圆圈)。(C)对于尸体实验,幼虫尸体(箭头)很容易识别相比,活幼虫。比例尺代表B中为1mm,150微米C. 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 咬尸体化验对C.结果线虫猎物。 (A)咬行为仅仅是显而易见的与这种行为eurystomatous口形式stenostomatous动物不显示。错误条代表的10个重复的标准差。(B),没有咬行为从stenostomatous动物明显之际,尸体实验也表明只对eurystomatous动物实验板尸体。错误条代表5次重复的标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
而eurystomatous动物从事掠夺性喂养图4 Eurystomatous掠夺饲养过程中抽气速率和牙齿移动,牙移动只观察到。这也与咽抽下降一致。错误条代表的10个重复的标准偏差。 HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

电影1
电影1 杀害了使用轻体视显微镜测定撕咬行为的观察。(右键点击下载)。

电影2
P.的电影2.高速摄像机电影pacificusC.线虫幼虫。(右键点击下载)。

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电影3.放大牙齿移动过程中捕食的高速摄像机。(右键点击下载)。

Discussion

线虫理解神经生物学和行为与C提供了一个功能强大的系统线虫迄今作为主要工具。然而,众多的线虫种类包括P. pacificus显示的行为,这是缺席或从模式生物C.复杂变化线虫 ,因此提高对这些行为的演变与调控引人入胜的问题。在许多其他线虫种类包括P.发现一个这样的附加 ​​行为pacificus是掠夺性喂养1,20从事以补充他们的饮食细菌的能力。因此,我们已开发出并描述了详细的协议线虫这些以前未经分析的掠夺行为,容易和快速鉴定。

首先,我们提供的方法中的线虫内口馈送装置用于筛选变体。正确口型的鉴定是必不可少的头sTEP成功捕食测定法,至少在该Pristionchus只属动物eurystomatous能够掠夺性喂养。最好是,以确定口腔中的协议1.2作为此方法中描述的“快速嘴表型”协议摇身一变是侵入性的要少得多,因此,它是不太可能掠夺行为可以被扰动。但是,建议首先成为通过识别与在琼脂焊盘麻醉动物(协议1.1)熟悉不同口结构。

以下所需口变形的鉴定,我们已经描述了两种测定用于定量掠夺馈送。这些是一种快速,高通量“尸测定”(协议3)和一个更费时,但更深入的通过“咬合测定”行为分析(方案2)。这两种协议是高度灵活的,允许若干修改,以优化取决于experimen测定法TAL要求。对于使用P.咬测定在C. pacificus大鳄线虫猎物,对于10分钟的时间窗掠夺行为相互作用的观测是足以与其他馈送事件沿量化叮咬的显著量。对于“尸实验”再利用P.C. pacificus大鳄线虫猎物,5大鳄2小时制作容易量化和一致的尸体数允许快速的行为分析。但是,应该以不同的速度指出,掠夺性线虫的举动不同的物种,吃的速度不同,一般展示其他行为1大的多样性。此外,不同的猎物物种也可以在类似的原因不同速率吃掉。因此,建议以优化基于测试既作为天敌和猎物的线虫物种的测定法,也可用于在环境条件下的任何差异。在这两次“咬”和“军团E“试验是至关重要的捕食与被捕食者是健康的,因为压力或受伤的大鳄将不能有效地杀灭。此外,新鲜的检测板是较旧的板块可以成为干出该线虫导致错误的健康造成不利影响至关重要测定,它也希望这些掠夺性试验的未来迭代将能够采取技术最新进展的优势,以自动执行大部分的分析作为已经完成调查22 C.观察到的许多行为线虫 21,目前如出现敏感得多接触它们,使得在可能废除掠夺馈送的微流体腔室的隔离和固定化的问题有可能在线虫如铜绿pacificus出现。克服此可能被证明具有挑战性的,但会促进个体线虫被筛选为微妙掠夺的行为。

最后,我们还提供了FO方法ř检查通过使用高速摄像机(协议4)定量齿和咽泵送动力学促进捕食性和细菌馈送模式之间的比较的线虫馈送装置本身。在C.咽抽水率的量化线虫已用于监测摄食多年23,但是,C。线虫没有任何形式的口锯齿和也没啥掠夺性的行为。通过结合咽与牙齿活动的泵送的量化,具体到捕食牙齿的任何神经支配也可以观察到。由于观察牙齿移动的动物经常移出焦平面所需的倍率,因此,它通常只能观察为很短的时间窗的齿。此外,不同于C.线虫 ,P的咽pacificus不连续泵,而是在抽水和饲养的法术啮合。因此,对于准确咽PUM的而喂养平速率确定,它记录15秒的连续馈送的是重要的。

这里提出这些方法,因此在线虫系统调查掠夺行为提供第一框架此外,它们也可以是适于用在调查线虫的生态系统,包括附加生态相关生物体上捕食包括微生物,真菌和螨虫的影响范围内的其他交互。因此,他们提供了剖析这些掠夺行为是如何调节的,他们怎么可能已经进化以及它们的生态意义的手段。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nylon net filters (20 µm) Merck Millipore Ltd NY2004700 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
PP Funnel for filter (54 mm) Duran 292215003 Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.
Small petri dish (35/10 mm) Greiner Bio-One  627102 For imaging on High speed camera
Zeiss SteREO Discovery V12 For mouth form identificaton
Axio-Imager A1 For mouth form identificaton
Glass Slides Roth H869
Cover Slips Roth 657
Motion Scope M3 Highspeed camera IDT High speed camera
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X Zeis 452984-0000-000 High speed camera zoom
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:
Agar Roth 5210.2 CAS-Nr. 9002-18-0
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5
Bacto Tryptone BD 211699 Lot 4316614
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C3306 CAS-Nr. 10035-04-8
Cholesterol from lanolin Sigma-Aldrich F 26732 00050 CAS-Nr. 57-88-5
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) Merck 1,058,861,000 CAS-Nr. 10034-99-8
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
6 cm petri dish Greiner Bio-One 628102
3.5 cm petri dish Greiner Bio-One 627102
M9 ingredients:
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ACROS organics 271080025 CAS-Nr. 7778-77-0
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) Sigma-Aldrich S9390-500G-D CAS-Nr. 7782-85-6
Sodium chloride (NaCl) Roth 3957 CAS-Nr. 7647-14-5

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References

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