निर्माण और एक मधुमेह घाव मॉडल में एक वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASC) शीट के ट्रांसप्लांटेशन

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Summary

वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs) आसानी से अलग कर रहे हैं और सामान्य चूहों की चर्बी से काटा जाता है। ए एस सी चादरें इंजीनियरिंग सेल शीट का उपयोग करके बनाया जा सकता है और मधुमेह फैटी चूहों पूर्ण-मोटाई का प्रदर्शन दोष उजागर हड्डी के साथ त्वचा और फिर कृत्रिम त्वचा की एक bilayer के साथ कवर किया Zucker में प्रत्यारोपित किया जा कर सकते हैं।

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Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

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Abstract

कृत्रिम त्वचा नैदानिक अभ्यास में काफी चिकित्सीय परिणाम हासिल किया है। हालांकि, कृत्रिम त्वचा उपचार अवस्र्द्ध रक्त प्रवाह के साथ या बड़े घाव के साथ मधुमेह रोगियों में घाव के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है। सेल आधारित चिकित्सा मधुमेह अल्सर के उपचार के लिए एक नई तकनीक के रूप में दिखाई देते हैं, और सेल-पत्रक इंजीनियरिंग सेल ट्रांसप्लांटेशन की प्रभावकारिता में सुधार हुआ है। रिपोर्टों की एक संख्या का सुझाव दिया है कि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ASCs), एक प्रकारको mesenchymal stromal सेल (एमएससी), वसा ऊतकों और अन्य ऊतकों से MSCs के लिए की तुलना में जब संग्रह के लिए उनकी पहुंच में उनके रिश्तेदार बहुतायत के कारण चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शन है। इसलिए, ASCs चिकित्सकीय प्रयोग के लिए स्टेम कोशिकाओं का एक अच्छा स्रोत होना दिखाई देते हैं। इस अध्ययन में, ए एस सी पत्रक सामान्य लुईस चूहों की epididymal वसा वसा से सफलतापूर्वक तापमान उत्तरदायी संस्कृति व्यंजन और सामान्य संस्कृति ascorbic एसिड युक्त माध्यम का उपयोग कर बनाया गया था। ए एस सी चादर Zucker मधुमेह फैटी (ZDF) चूहों में प्रत्यारोपित किया गया, एक चूहा मॉडल टाइप 2 मधुमेह और मोटापा, कि कम प्रदर्शन के घाव। एक घाव पोस्टीरियर कपाल सतह पर बनाया गया था, ए एस सी चादरें घाव में प्रत्यारोपित किया गया, और एक bilayer कृत्रिम त्वचा पत्रकों को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ए एस सी चादरें प्राप्त ZDF चूहों बेहतर ASC पत्रकों का ट्रांसप्लांटेशन बिना ZDF चूहों से घाव था। ए एस सी चादरें एक नम घाव पर्यावरण के रखरखाव की आवश्यकता के शुष्क परिस्थितियों के प्रति संवेदनशील होते हैं, क्योंकि इस दृष्टिकोण तक ही सीमित था। इसलिए, कृत्रिम त्वचा सुखाने को रोकने के लिए ए एस सी चादर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कृत्रिम त्वचा के साथ संयोजन में ए एस सी पत्रकों की निर्वाचित प्रत्यारोपण भी अन्य असभ्य अल्सर या जलता है, उन परिधीय धमनी रोग और कोलेजन रोग, के साथ मनाया के रूप में लागू किया जा सकता है और जो कुपोषित हैं या स्टेरॉयड का उपयोग कर रहे हैं रोगियों के लिए प्रशासित किया जा सकता है। इस प्रकार, इस उपचार घाव मधुमेह उपचार के लिए चिकित्सीय विकल्प में सुधार की दिशा में पहला कदम हो सकता है।

Introduction

मधुमेह के रोगियों की आबादी दुनिया भर में बढ़ रही है और 20151में 400 मिलियन तक पहुँच गया; एक अनुमान के अनुसार 15-25% मधुमेह के रोगियों के एक निचले-किनारा मधुमेह अल्सर2की प्रगति से खतरे में हैं। निचले-किनारा मधुमेह अल्सर असभ्य हैं और पूरी वसूली के बाद पुनर्वास प्रशिक्षण के साथ एक लंबे समय तक चिकित्सीय अवधि की आवश्यकता हो सकती है। एक लंबे उपचार की अवधि अक्सर रोगी जीवन की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम है। इस प्रकार, नई चिकित्सा कि कमी या उत्तेजना रोकने मधुमेह घाव के उपचार के लिए विकसित किया जाना चाहिए। मधुमेह घाव भरने का मूल्यांकन करने के लिए, हम अनुकूलित जो व्यावहारिक नैदानिक स्थिति mimics, मधुमेह अल्सर घाव भरने में एक मॉडल चूहों, और चिकित्सा घाव चाहे वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASC) शीट्स सेल शीट इंजीनियरिंग का प्रयोग रोपाई त्वरित मूल्यांकन किया।

उनके आत्म-नवीकरण क्षमता, उनके प्रतिरक्षण निश्चायक प्रभाव और उनके विभिन्न सेल प्रजातियों3में अंतर करने की क्षमता के कारण घाव भरने में तेजी के लिए एक उत्कृष्ट क्षमता mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) दर्शाते हैं। ASCs वसा ऊतकों से ली गई एमएससी का एक प्रकार हैं, और वे उनके संभावित angiogenic और paracrine गतिविधि4,5सहित अन्य ऊतकों से व्युत्पन्न MSCs पर कई लाभ दिखा रहे। वसा ऊतकों में मानव शरीर अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में है, और इसकी पहुंच न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं का उपयोग कर संग्रह के लिए अनुमति देता है। इसलिए, ASCs प्रयोगात्मक घाव अनुप्रयोगों6,7के लिए इस्तेमाल किया गया है।

पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि एकल-कक्ष एमएससी निलंबन का डायरेक्ट इंजेक्शन घाव आसपास के क्षेत्रों में8,9घाव में तेजी लाने कर सकते हैं। हालांकि, एकल-कक्ष निलंबन के इंजेक्शन के बाद मधुमेह अल्सर मॉडल में घाव भरने की गति का रिपोर्ट के बावजूद, घाव स्थल पर प्रतिरोपित कोशिकाओं के अस्तित्व के समय स्पष्ट नहीं है।

इस अध्ययन में, हम सेल शीट इंजीनियरिंग तापमान उत्तरदायी संस्कृति बर्तन का उपयोग कर लागू किया गया। ये व्यंजन तापमान उत्तरदायी बहुलक N- isopropylacrylamide covalently पर उनकी सतह10से बाउंड है। Grafted बहुलक परत करने के लिए कक्ष के तापमान नियंत्रित आसंजन या संस्कृति डिश की सतह से अलगाव के लिए अनुमति देता है। पकवान की सतह 37 ° C, कोशिकाओं अनायास अलग सतह से जब यह कम तापमान 32 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोफिलिक हो जाता है, जबकि कोशिकाओं का पालन और पैदा करना, करने के लिए अनुमति देने पर hydrophobic हो जाता है सुसंस्कृत कोशिकाओं बरकरार करने के लिए-सेल के जंक्शनों और extracellular मैट्रिक्स (ECMs) के साथ एक निरंतर सेल शीट के रूप में बस के तापमान को कम करने के द्वारा काटा जा सकता है; इस प्रकार, proteolytic एंजाइमों कि ECM, trypsin, जैसे नुकसान आवश्यक11नहीं हैं। इसलिए, सेल-पत्रक इंजीनियरिंग सेल करने के लिए कनेक्शन की रक्षा और सेल प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता में सुधार कर सकते हैं।

इसके अलावा, सेल-पत्रक ट्रांसप्लांटेशन सेल इंजेक्शन12करने के लिए की तुलना में जब कक्ष से बचने की दर बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल में, Zucker मधुमेह वसायुक्त (ZDF) चूहों विलंबित घाव भरने के साथ एक टाइप 2 मधुमेह और मोटापे के मॉडल के रूप में चयन किया गया था। ZDF चूहों अनायास मोटापा लगभग 4 सप्ताह में विकसित। वे तब उम्र, पर जो बात वे hyperglycemia इंसुलिन प्रतिरोध, dyslipidemia और hypertriglyceridemia13के साथ जुड़े प्रदर्शन के 8 और 12 सप्ताह के बीच मोटापे के साथ टाइप 2 मधुमेह विकसित। विलंबित घाव चिकित्सा, रक्त का प्रवाह कम परिधीय रक्त वाहिकाओं, और मधुमेही नेफ्रोपैथी में14,15,16मनाया भी कर रहे हैं। इसके अलावा, ZDF चूहों का अध्ययन असभ्य त्वचीय अल्सर, मधुमेह अल्सर जैसे की चिकित्सा के लिए एक उपयुक्त मॉडल हो सकता है।

मनुष्य और कृन्तकों के बीच मतभेद घाव तंत्र में त्वचा में संरचनात्मक अंतर के साथ जुड़े रहे हैं। घाव भरने में मनुष्य पुनः epithelialization और कणिकायन ऊतक के गठन पर आधारित है, जबकि सामान्य चूहों में घाव पर घाव संकुचन, आधारित है। सामान्यतया, घाव कृंतक मॉडल में इस्तेमाल किया splinting घाव संकुचन को कम करने में मदद करता है और nondiabetic चूहों में घाव लगभग पूरी तरह से संकुचन द्वारा बंद हो जाती हैं, हालांकि कणिकायन ऊतक17, क्रमिक संरचना के लिए अनुमति देता है। हालांकि, मधुमेह संकुचन घाव ZDF में चूहों बिगड़ा हुआ है, और मुख्य रूप से घाव होता है के माध्यम से फिर से epithelialization और कणिकायन ऊतक के गठन; इस प्रकार, इस प्रक्रिया14मानव घाव करने के लिए और अधिक समान है।

मधुमेह घाव debridement अक्सर का सामना कर रहे हैं करने के बाद चिकित्सकीय उजागर हड्डी के साथ। पिछले अध्ययनों 12 मिमी व्यास पूर्ण-मोटाई त्वचा के घाव athymic नग्न चूहों18,19 की पीठ पर और सामान्य चूहों20की पीठ पर 10 मिमी व्यास पूर्ण-मोटाई त्वचा के घाव की जांच की है। गंभीर मधुमेह घाव के लिए एक नैदानिक मॉडल विकसित करने के लिए, बड़े 15 x 10 मिमी (2) पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष के साथ हड्डी से अवगत कराया और बिना पेरियोस्टेयम बनाए गए थे, पहले वर्णित किए गए21, टाइप 2 मधुमेह और मोटापे के साथ चूहों में के रूप में।

सामान्य लुईस चूहों के ASCs से चूहा ASC (rASC) शीट्स ASC पत्रकों के निर्वाचित प्रत्यारोपण के माध्यम से बनाए गए थे। क्योंकि मधुमेह के रोगियों के अल्सर के साथ अक्सर गंभीर मधुमेह की जटिलताओं, अनियंत्रित उच्च रक्त शर्करा का स्तर और उच्च शरीर द्रव्यमान सूचकांक है, और कि इन रोगियों से वसा ऊतक प्राप्त करने की कठिनाई में वृद्धि इन जटिलताओं के कारण घाव विकारों जैसे प्रदर्शन नैदानिक अभ्यास में, autologous प्रत्यारोपण unfeasible है। इसके अलावा, मधुमेह प्रदर्शनी के साथ पशुओं से ASCs और गुण बदल दिया समारोह22बिगड़ा। इसलिए, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल rASC पत्रक सामान्य चूहों से निर्वाचित प्रत्यारोपण और कृत्रिम त्वचा के आवेदन मधुमेह चूहों के लिए का वर्णन करता है।

Bilayer कृत्रिम त्वचा में इस प्रोटोकॉल का उपयोग घाव के सहज संकुचन से बचाता है, संयोजी ऊतक के एक नए मैट्रिक्स के संश्लेषण को बढ़ावा देता है, और सच dermis23के जैसा। इस प्रोटोकॉल में, कृत्रिम त्वचा एक rASC पत्रक पर नहीं रखे और घाव संकुचन या ढीले चूहा त्वचा से जिसके परिणामस्वरूप इज़ाफ़ा को रोकने के लिए नायलॉन धागे के साथ ठीक किया गया है। इसके अलावा, कृत्रिम त्वचा ASC पत्रक के लिए एक तीन आयामी रूपरेखा प्रदान करता है, प्रतिरोपित ए एस सी चादरें और घावों के लिए एक नम वातावरण बनाए रखता है, और घाव संक्रमण और बाहरी ताकतों से रक्षा करता है। अंत में, एक गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग घाव पर यह बाहरी प्रभाव से बचाने के लिए, एक नम घाव वातावरण बनाए रखने और exudate को अवशोषित करने के लिए रखा गया है।

एक rASC पत्रक पतली, लचीली, और आकार के अनुसार स्थिर है, और प्राप्तकर्ता साइटों, एक धड़कन दिल24जैसे चलती करने के लिए पालन कर सकते हैं। सेल-पत्रक इंजीनियरिंग विभिन्न ऊतकों के पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है और उपचारात्मक प्रभाव25,26. उत्पन्न कर सकते हैं ए एस सी चादरें कि नैदानिक चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शन घाव के कई प्रकार के उपचार में तेजी लाने सकता है। इसके अलावा, ए एस सी चादरें उपयोग कृत्रिम त्वचा, के साथ संयुक्त, allogeneic ट्रांसप्लांटेशन असभ्य अल्सर या जलता है, जैसे उन परिधीय धमनी रोग या कोलेजन रोग, में मनाया के उपचार के लिए लागू किया जा सकता है या वे रोगियों जो कुपोषित हैं या स्टेरॉयड का उपयोग कर रहे हैं करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण ASCs रोपाई की क्षमता बढ़ जाती है। घाव ZDF मूषक मॉडल जो मानव घाव घाव भरने की प्रक्रिया के जैसा होता है और एक छोटे आकार प्रायोगिक पशुओं में नैदानिक स्थिति mimics एक गंभीर घाव की स्थिति पैदा करता है।

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Representative Results

एक नया सेल आधारित चिकित्सा असभ्य मधुमेह घाव के लिए स्थापित करने के लिए इस प्रोटोकॉल का प्रयास किया। संक्षेप में (के रूप में सचित्र चित्र 1में), allogeneic rASC पत्रक सामान्य चूहों से इंजीनियरिंग सेल शीट का उपयोग करके बनाए गए थे और उसके प्रत्यारोपित किया गया है एक पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष पर कृत्रिम त्वचा के एक bilayer पर एक मधुमेह चूहा का उपयोग। प्रकाश माइक्रोस्कोप छवियों एक rASC पत्रक (चित्र 2A) का एक अच्छा उदाहरण और एक rASC पत्रक (चित्र 2B) के एक बुरा उदाहरण के चित्र 2में दिखाए जाते हैं। जब ASCs एक नई संस्कृति डिश पर चढ़ाया हैं, पकवान धीरे धीरे आगे पीछे हिल और बाएँ और दाएँ वर्दी rASC बोने और एक समान रूप से मोटी rASC पत्रक (चित्र 2A) को प्राप्त करने के लिए एक मशीन में होना चाहिए। यदि rASCs नहीं कर सकता हो, समान रूप से संलग्न और सभ्य संस्कृति डिश की सतह पर, पत्रक एक निरंतर ए एस सी पत्रक (चित्र 2B) के रूप में एकत्र किया जा सकता। चित्र 3 से पता चलता है ए एस सी चादरें कि कमरे के तापमान पर एक निरंतर सेल शीट के रूप में काटा गया है, क्योंकि ASCs पकवान सतह पर समान रूप से जुड़े थे। आमतौर पर, एक जोड़ी संदंश के साथ rASC पत्रक नियंत्रित किया जा सकता। यदि आवश्यक हो, एक स्थानांतरण झिल्ली एक सेल शीट संस्कृति डिश से घाव साइट करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जा कर सकते हैं, जैसे कि अगर सेल शीट भंगुर और नाजुक है।
चित्रा 4 ZDF चूहों एक मधुमेह घाव मॉडल और कृत्रिम त्वचा के साथ संयुक्त allogeneic rASC पत्रकों का ट्रांसप्लांटेशन के रूप में दर्शाया गया है। एक rASC पत्रक नरम और लचीला, आकार में समायोज्य, और घाव साइट के हर कोने को संदंश (आंकड़ा 4A-एफ) की एक जोड़ी के साथ विस्तारित किया जा रहा में सक्षम है। चादर से ढके rASC दोष भी कृत्रिम त्वचा 15 x 10 मिमी (2) के साथ कवर किया गया था और एक 5-0 नायलॉन सिवनी (आंकड़ा 4G) का उपयोग लगभग 10 टांके के साथ sutured. घाव की रक्षा करने के लिए, एक नम घाव वातावरण बनाए रखा था और exudates लीन थे, एक गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग 20 x 15 मिमी (2) कृत्रिम त्वचा पर रखा गया था, और 5-0 नायलॉन टांके लागू किया गया था (चित्रा 4I)। गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग अक्सर कई दिनों आवेदन के भीतर ZDF चूहों द्वारा निकाल दिया जाता है। इसलिए, चूहों ट्रांसप्लांटेशन के बाद निगरानी की जानी चाहिए। आमतौर पर, गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग हर 2 दिन सामान्य संज्ञाहरण के तहत बदला गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5 में macroscopic तस्वीरें एक rASC शीट की ट्रांसप्लांटेशन के प्रतिनिधि परिणाम हैं। हमारे पिछले अध्ययन में, औसत घाव क्षेत्र rASC पत्रक ट्रांसप्लांटेशन समूह में (चित्रा 5B) नियंत्रण समूह में (चित्रा 5A) से काफी छोटा था। नियंत्रण के लिए, केवल कृत्रिम त्वचा प्रत्यारोपण एक rASC पत्रक के बिना, घाव को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इन छवियों के निर्माण घाव के बाद 14वें दिन ले जाया गया (n = प्रत्येक समूह में 6)31

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण प्रक्रिया के. प्रयोगात्मक प्रत्यारोपण प्रक्रिया के योजनाबद्ध एक allogeneic चूहा वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (rASC) पत्रक और टाइप 2 मधुमेह और मोटापे की एक चूहा घाव मॉडल में कृत्रिम त्वचा के साथ की गई। (A) वसा ऊतक सामान्य लुईस चूहों से शल्य चिकित्सा द्वारा excised था चूहा। rASCs अलग और एक 60 सेमी2 संस्कृति डिश पर वरीयता प्राप्त थे और 7-8 दिनों के लिए एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 ° C पर सुसंस्कृत। हर 2-3 दिन (B) rASCs subcultured थे, और मार्ग 3 rASCs एक 35 मिमी व्यास तापमान उत्तरदायी संस्कृति डिश पर वरीयता प्राप्त थे। कक्षों में पूर्ण माध्यम 16.4 µ g/mL L-ascorbic एसिड फॉस्फेट मैग्नीशियम नमक n-हाइड्रेट (AA) एक 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 ° C पर 7-8 दिनों के लिए युक्त सुसंस्कृत थे। RASCs 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने के द्वारा एक निरंतर rASC पत्रक के रूप में काटा था (C) rASC पत्रक का प्रदर्शन मधुमेह और मोटापा एक घाव मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया (Zucker मधुमेह वसायुक्त (ZDF) चूहों) चूहों के सिर पर उजागर हड्डी के साथ एक 15 x 10 मिमी2 पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष पर प्रतिरोपित। (D) एक rASC पत्रक दोष पर सीधे खोपड़ी पर रखा और कवर किया गया था) एक 15 x 10 के साथ मिमी2 पत्रक bilayer कृत्रिम त्वचा, जो में sutured था की जगह 10 नायलॉन के साथ (5-0) टांके। मधुमेह 2015; 64: 2723-2734; अनुमति के साथ। मधुमेह (सी) कॉपीराइट (2015) अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन द्वारा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लाइट माइक्रोस्कोप छवियों ASCs के. ए एस सी प्रसार की माइक्रोस्कोप छवियों संस्कृति व्यंजन, बिना ASCs के बीच अंतराल के किनारे करने के लिए प्रकाश। (A) एक rASC पत्रक संवर्धन (A) के सभी दिशाओं 7 दिनों के बाद शुरू में एक समान मोटाई के साथ। (B) वर्दी बोने के बिना एक rASC पत्रक। संवर्धन (B) की शुरुआत के बाद 7 दिन पर एक निरंतर rASC शीट प्राप्त नहीं कर सकता। सलाखों के पैमाने पर 100 माइक्रोन. = कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Time-lapse छवियों rASC कमरे के तापमान पर पत्रक प्रतिमाओं के. कमरे के तापमान पर एक rASC पत्रक की स्थिति के समय चूक छवियाँ। rASCs एक 35 मिमी व्यास तापमान उत्तरदायी संस्कृति डिश पर सहज होते हैं और धीरे-धीरे कमरे के तापमान (लगभग 20 ° C) पर पकवान सतह से अलग और एक सन्निकट पत्रक के रूप में काटा था। (A) तापमान-उत्तरदायी संस्कृति डिश कमरे के तापमान को ले जाने के बाद लगभग 5 मिनट। (B) 35 मिमी व्यास तापमान उत्तरदायी संस्कृति डिश कमरे के तापमान को ले जाने के बाद लगभग 10 मिनट। (C) तापमान-उत्तरदायी संस्कृति डिश कमरे के तापमान को ले जाने के बाद लगभग 20-30 मिनट। यह एक अच्छी गुणवत्ता rASC पत्रक (C) है। (D-E) rASC पत्रक की स्थिति लगभग 20-30 मिनट बाद तापमान उत्तरदायी संस्कृति डिश कमरे के तापमान के लिए चलती। इस rASC शीट की औसत गुणवत्ता (D) है। (F-G) rASC चादरें आम तौर पर एक जोड़ी संदंश के साथ नियंत्रित किया जाता है। अगर सेल शीट भंगुर और नाजुक है, एक झिल्ली के रूप में एक पाड़ संस्कृति डिश से घाव साइट करने के लिए सेल शीट स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: घाव निर्माण के समय सीरीज छवियाँ और rASC पत्रक ट्रांसप्लांटेशन कृत्रिम त्वचा और एक गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग के साथ
समय सीरीज छवियाँ घाव निर्माण और rASC पत्रक ट्रांसप्लांटेशन कृत्रिम त्वचा और एक गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग के साथ की। (A) ZDF के सिर चूहों के साथ एक इलेक्ट्रिक रेजर के बाल काटे थे। शरीर बाल शेविंग करने के बाद, चेकमार्क 15 x 10 मिमी (2) एक तेल hydrophobic पेन का उपयोग कर तैयार किया गया। (B) A पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष (15 x 10 मिमी2) त्वचीय ऊतकों को पेरियोस्टेयम epidermis से निकालकर एक ले ली anesthetized ZDF चूहे के सिर पर बनाया गया था। त्वचा और त्वचीय ऊतकों एक स्केलपेल के साथ excised थे, और periosteum एक periosteal के साथ हटा दिया गया था raspatory. बाँझ नमकीन के साथ सिक्त महीन तार की जाली का उपयोग कर, दबाव के बाद छांटना रक्तस्राव को रोकने के लिए लागू किया गया था। (C) rASC पत्रक ट्रांसप्लांटेशन। एक rASC पत्रक तुरंत संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर चूहे की खोपड़ी के ऊपर दोष पर रखा गया था। (डी-जी) घाव आकार से मेल करने के लिए समायोजित rASC पत्रक एक्सटेंशन। RASC पत्रक है लचीला, समायोज्य, और घाव संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर साइट के हर कोने करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। व्यापक घावों के लिए, दो या तीन लचीला rASC पत्रक खड़ी जा सकता है। (H) Suturing कृत्रिम त्वचा rASC पत्रक को कवर। दोष और प्रतिरोपित rASC पत्रक कृत्रिम त्वचा 15 x 10 मिमी (2), जो 5-0 नायलॉन टांके का उपयोग 10 टांके के साथ sutured किया गया था के साथ कवर किया गया। (मैं) कृत्रिम त्वचा के साथ Suturing गैर-ड्रेसिंग चिपकने के 20 x 15 मिमी (2) घाव साइट को कवर किया। घाव की रक्षा करने के लिए, गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग 20 x 15 मिमी (2) 5-0 नायलॉन टांके के साथ कृत्रिम त्वचा पर रखा गया था। मधुमेह 2015; 64: 2723-2734; अनुमति के साथ। मधुमेह (सी) कॉपीराइट (2015) अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन द्वारा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पूर्ण-मोटाई के Macroscopic छवियों त्वचा दोषों. Macroscopic तस्वीरें पूर्ण-मोटाई त्वचा के घाव के निर्माण के बाद 14 दिन प्रत्यारोपण प्रत्यारोपण एक rASC पत्रक (B) के साथ और एक rASC पत्रक (A) के बिना दोष। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सफलतापूर्वक एक rASC पत्रक संवर्धन के सबसे महत्वपूर्ण चरण निम्नानुसार हैं: 1) तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान उत्तरदायी संस्कृति व्यंजन पर संवर्धन के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए। एक rASC शीट का निर्माण, के दौरान हर प्रक्रिया एक 37 ° C थर्मो-प्लेट पर की गई थी, और हर अभिकर्मक सहज से पकवान31अलग से कक्षों को रोकने के लिए 37 ° C पर गरम था। 2) प्राप्तकर्ता ZDF चूहों को हटाने के गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग, जो rASC पत्रकों का सफल प्रत्यारोपण के लिए महत्वपूर्ण है को रोकने के लिए निगरानी की जानी चाहिए। ड्रेसिंग निकाल दिया जाता है, तो एक नया गैर-चिपकने वाला ड्रेसिंग घाव साइट से अलग से प्रतिरोपित ASC पत्रकों को रोकने के लिए लागू किया जाना चाहिए।

इस कार्यविधि का उपयोग, rASC चादरें आम तौर पर बोने के पारित होने के 5-7 दिनों के भीतर 3 कोशिकाओं तापमान उत्तरदायी संस्कृति व्यंजन पर प्राप्त किया गया। संस्कृति एक rASC पत्रक जनरेट करने के लिए आवश्यक समय प्रारंभिक कक्ष घनत्व और जिस पर पूरी संस्कृति मध्यम AA युक्त लागू है समय के अनुसार समायोजित किया जा सकता। यदि एक rASC शीट से पकवान संवर्धन सेल के दौरान detaches, rASC पत्रक पुनर्निर्माण किया जाना चाहिए, और अतिरिक्त व्यंजन सेल अलगाव की स्थिति में तैयार किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएँ निम्नानुसार हैं: 1) सख्त तापमान प्रबंधन एक अनुमानित तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान उत्तरदायी संस्कृति बर्तन का उपयोग करते समय पूरी प्रक्रिया के दौरान बनाए रखने के लिए लागू किया जाना चाहिए। 2) rASC पत्रक शुष्क परिस्थितियों के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि एक rASC शीट प्राप्त करने के बाद, विशेष चिकित्सा उपकरणों नम स्थितियों, बनाए रखने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। 3) पोस्ट ऑपरेटिव प्रबंधन प्राप्तकर्ता चूहे की स्थिति की दैनिक निगरानी सहित, की आवश्यकता है।

उजागर हड्डी के साथ बड़ा घाव अक्सर नैदानिक मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, यातायात दुर्घटना आघात, जलता है, संक्रमित घावों, और debridement के बाद क्षतिग्रस्त या परिगलित घाव उजागर हड्डी के साथ बड़े घाव में विकसित कर सकते हैं। यहाँ, गंभीर घाव का एक नैदानिक मॉडल एक बड़े, पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष टाइप 2 मधुमेह और मोटापे के साथ चूहों में उजागर हड्डी के साथ का उपयोग कर विकसित किया गया था। यह मॉडल एक मानक मॉडल के रूप में घाव भरने में मधुमेह चूहों के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए की क्षमता है।

कृत्रिम त्वचा debridement करने के बाद पूर्ण-मोटाई त्वचा दोष के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मेडिकल डिवाइस है, और रिकॉमबिनेंट बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) व्यापक रूप से घाव भरने के लिए angiogenesis और कणिकायन को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन दो उपचार मधुमेह घाव जैसे पुराने घावों के लिए भी काफी चिकित्सीय परिणाम, को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह बताया गया है कि ASCs angiogeneic वृद्धि कारक28, संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), hepatocyte वृद्धि कारक (HGF), और bFGF, जो neovascularization29,30 करने के लिए योगदान कर सकते हैं और घाव भरने में तेजी लाने जैसे छिपाना। हमारे पिछले अध्ययन की पुष्टि की कि ASCs लगातार इन वृद्धि कारक31छिपाना। इसलिए, ए एस सी चादरें, कृत्रिम त्वचा के साथ, संयुक्त vascularization और31घाव में तेजी के लिए एक नया चिकित्सीय विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए की क्षमता है, और इन चादरों भविष्य में असभ्य अल्सर या मानव नैदानिक सेटिंग में जल के कई प्रकार के उपचार करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

निम्न लेखक इस प्रकाशन के लिए प्रासंगिक वित्तीय संबंधों का खुलासा: Teruo Okano है एक संस्थापक और निदेशक मंडल के सेल बीज इंक है, जो प्रौद्योगिकी और टोक्यो महिला मेडिकल विश्वविद्यालय से पेटेंट लाइसेंस, और Teruo Okano और Masayuki यमातों हैं हितधारकों सेल बीज इंक टोक्यो महिला मेडिकल विश्वविद्यालय में अनुसंधान कोष कक्ष बीज इंक से प्राप्त करता है अन्य लेखकों की घोषणा कि वे वित्तीय संबंधों का इस प्रकाशन के लिए प्रासंगिक नहीं है।

Acknowledgments

लेखक डॉ Yukiko Koga विभाग के प्लास्टिक और पुनर्निर्माण सर्जरी, Juntendo यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, व्यावहारिक सलाह प्रदान करने के लिए धन्यवाद। हम भी श्री Hidekazu Murata मधुमेह केंद्र के टोक्यो महिलाओं की चिकित्सा यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद। इस अध्ययन के नवाचार केन्द्रों के निर्माण द्वारा प्रोग्राम के लिए उन्नत अंतःविषय अनुसंधान क्षेत्रों विकासशील नवाचार प्रणाली "सेल शीट ऊतक इंजीनियरिंग केंद्र (CSTEC)" के लिए परियोजना के शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEXT) जापान के से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

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References

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