Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

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Summary

Células madre procedentes de adiposo (ASCs) son fácilmente aisladas y extraídas de la grasa de las ratas normales. Hojas de ASC pueden crearse utilizando ingeniería hoja de la célula y pueden ser transplantadas en Zucker ratas diabéticas grasosas exhibiendo espesor total defectos con hueso expuesto de la piel y luego se cubrieron con una bicapa de piel artificial.

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Kato, Y., Iwata, T., Washio, K., Yoshida, T., Kuroda, H., Morikawa, S., Hamada, M., Ikura, K., Kaibuchi, N., Yamato, M., Okano, T., Uchigata, Y. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. J. Vis. Exp. (126), e54539, doi:10.3791/54539 (2017).

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Abstract

Piel artificial ha logrado considerables resultados terapéuticos en la práctica clínica. Sin embargo, tratamientos de piel artificial para las heridas en pacientes diabéticos con flujo sanguíneo impedida o con heridas grandes podrían ser prolongados. Terapias basadas en células han aparecido como una nueva técnica para el tratamiento de las úlceras diabéticas, y hoja de la célula Ingeniería ha mejorado la eficacia del trasplante de la célula. Varios informes han sugerido que células madre procedentes de adiposo (ASCs), un tipo de células mesenquimales estromales (MSC), exhiben potencial terapéutico debido a su relativa abundancia en el tejido adiposo y su accesibilidad para la recolección en comparación con MSCs de otros tejidos. Por lo tanto, ASCs parecen ser una buena fuente de células madre para uso terapéutico. En este estudio, hojas ASC de la grasa adiposa Epididimal de las ratas de Lewis normales fueron creadas con éxito utilizando platos de cultivo temperatura sensible y normal medio de cultivo que contiene ácido ascórbico. Las hojas ASC fueron transplantadas en ratas diabéticas grasos (ZDF) de Zucker, un modelo de diabetes tipo 2 y obesidad, que muestran disminución de ratas la cicatrización de heridas. Una herida fue creada en la superficie craneal posterior, hojas ASC se trasplantaron en la herida y la piel de una bicapa artificial fue utilizada para cubrir las hojas. Las ratas ZDF que recibieron hojas ASC habían mejor cicatrización que las ratas ZDF sin el trasplante de las hojas de la ASC. Este enfoque fue limitado porque las hojas de ASC son sensibles a las condiciones secas, requiriendo el mantenimiento de un entorno húmedo de la herida. Por lo tanto, la piel artificial fue utilizada para cubrir la hoja de la ASC para evitar que se sequen. El trasplante alógeno de hojas ASC en combinación con piel artificial también podría ser aplicable a otras úlceras intratables o quemaduras, como los observados con la enfermedad arterial periférica y enfermedad del colágeno y puede ser administrado a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Así, este tratamiento podría ser el primer paso hacia la mejora de las opciones terapéuticas para el diabético herida curativo.

Introduction

La población de pacientes diabéticos está aumentando en todo el mundo y llegó a 400 millones en el 20151; aproximadamente 15-25% de pacientes con diabetes están en riesgo de la progresión de una úlcera diabética de extremidades inferiores2. Las úlceras diabéticas de la extremidad inferior son insuperables y podrían requerir un período terapéutico prolongado con entrenamiento de rehabilitación después de una recuperación completa. Un período largo de la terapia a menudo resulta en una reducción significativa en la paciente calidad de vida. Así, hay que desarrollar nuevas terapias que disminuirán o impedir la agravación para el tratamiento de las heridas diabéticas. Para evaluar la cicatrización de la herida diabética, hemos optimizado una úlcera diabética cicatrización modelo en ratas, que imita las condiciones clínicas prácticas, y evaluó si el transplante de células madre derivadas de adiposo (ASC) hojas utilizando ingeniería hoja de la célula acelerado la cicatrización de heridas.

Las células estromales mesenquimales (MSCs) presentan un excelente potencial para acelerar la cicatrización de heridas por su capacidad de auto renovación, por sus efectos inmunomoduladores y su capacidad de diferenciarse en varios linajes de células3. ASCs son un tipo de MSC derivada de tejido adiposo, y presentan varias ventajas sobre los MSCs derivadas de otros tejidos, incluyendo su potencial angiogénico y paracrina actividad4,5. Tejido adiposo es relativamente abundante en el cuerpo humano, y su accesibilidad permite colección mediante procedimientos mínimamente invasivos. Por lo tanto, se han utilizado experimentalmente ASCs para cicatrización aplicaciones6,7.

Informes anteriores han demostrado que la inyección directa de suspensiones MSC unicelular en áreas alrededor de las heridas puede acelerar la cicatrización en8,9. Sin embargo, a pesar de informes de la aceleración de la cicatrización de heridas en los modelos de úlcera diabética después de la inyección de suspensiones celulares solo, no está claro el tiempo de supervivencia de las células trasplantadas en el sitio de la herida.

En este estudio, aplicamos ingeniería hoja de la célula usando platos de cultura sensible a la temperatura. Estos platos tienen la temperatura sensible polímero N- isopropylacrylamide covalentemente a su superficie10. La capa de polímero injertado permite la adhesión celular con control de temperatura a o desprendimiento de la superficie de la placa de cultivo. La superficie del plato se vuelve hidrofóbica a 37 ° C, permitiendo que las células para adherirse y proliferar, mientras que las células suelte espontáneamente de la superficie cuando se vuelve hidrófilo a temperaturas por debajo de 32 ° C. Las células cultivadas se pueden cosechar como una hoja de celdas contiguas con uniones célula a célula intactas y matrices extracelulares (ECMs) simplemente mediante la reducción de la temperatura; así, las enzimas proteolíticas que dañan el ECM, como la tripsina, no son necesarios11. Por lo tanto, ingeniería hoja de la célula puede preservar las conexiones de la célula a célula y mejorar la eficacia del trasplante de la célula.

Además, trasplante de la hoja de la célula aumenta las tasas de supervivencia de la célula en comparación con la célula de inyección12. En este protocolo, Zucker ratas diabéticas de (ZDF) grasosas fueron seleccionadas como un modelo de obesidad y diabetes tipo 2 con retraso de la cicatrización de heridas. Las ratas ZDF espontáneamente desarrollan obesidad en aproximadamente 4 semanas. Luego desarrollan diabetes tipo 2 con obesidad entre 8 y 12 semanas de edad, momento en el que exhiben hiperglucemia asociada con insulina resistencia, dislipemia e hipertrigliceridemia13. Retraso herida que cura, reducción del flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos periféricos y la nefropatía diabética también se observan14,15,16. Además, las ratas ZDF podrían ser un modelo apropiado para el estudio de la curación de las úlceras cutáneas intratables, como las úlceras diabéticas.

Las diferencias entre los seres humanos y roedores en los mecanismos de cicatrización se asocian a las diferencias anatómicas en la piel. Herida que cura en ratas normales se basa en la contracción de la herida, mientras que la cicatrización de heridas en seres humanos se basa en la formación de tejido de granulación y reepitelización. Por lo general, herida ferulización utilizado en modelos de roedores ayuda a minimizar la contracción de la herida y permite la formación gradual de tejido de granulación17, aunque las heridas en diabéticos ratas son casi completamente cerradas por contracción. Sin embargo, el diabético herida contracción en ZDF ratas se deteriora, y cicatrizantes sobre todo se produce a través de reepitelización y formación de tejido de granulación; así, este proceso es más similar a la cicatrización humana14.

Diabéticas heridas con hueso expuesto después de desbridamiento se encuentran a menudo clínicamente. Estudios previos han examinado las heridas de piel de espesor total de 12 mm de diámetro sobre las espaldas de athymic mice desnudas18,19 y heridas de la piel de espesor total de 10 mm de diámetro sobre las espaldas de los ratones normales20. Para desarrollar un modelo clínico para heridas diabéticas severas, defectos más grandes de piel de espesor total (15 x 10 mm2) con exponen hueso y sin el periostio se crearon, como se describió anteriormente21, en ratas con diabetes tipo 2 y obesidad.

Hojas ASC (rASC) rata de ASCs de ratas Lewis normales fueron creadas por el trasplante alógeno de hojas ASC. En la práctica clínica, el trasplante autólogo es inviable porque los pacientes diabéticos con úlceras a menudo exhiben graves complicaciones diabéticas, como niveles de glucosa sanguínea alta sin control, índices de masa corporal alta y estos complicaciones causa cicatrización los trastornos que aumentan la dificultad de obtención de tejido adiposo de estos pacientes. Además, ASCs de animales con exposición de diabetes alteración propiedades y deterioraron función22. Por lo tanto, el protocolo que presentamos describe el trasplante alógeno de rASC hojas de ratas normales y la aplicación de piel artificial a ratas diabéticas.

La piel artificial de dos capas usada en este protocolo evita la contracción espontánea de las heridas, promueve la síntesis de una nueva matriz de tejido conectivo y se asemeja a la verdadera dermis23. En el presente Protocolo, la piel artificial se coloca en una hoja de rASC y fijo con hilos de nylon para evitar la contracción de la herida o ampliación resultante de piel de rata suelta. Además, la piel artificial proporciona un marco tridimensional para las hojas de la ASC, mantiene un ambiente húmedo para el trasplantado hojas ASC y heridas y protege las heridas de la infección y las fuerzas externas. Finalmente, se coloca un apósito no adhesivo sobre la herida para protegerla del impacto externo, mantener un ambiente húmedo de la herida y absorber el exudado.

Una hoja de rASC es fina, flexible y deformable y puede adherir a sitios receptores, como un latido corazón24en movimiento. Ingeniería de la hoja de la célula se ha utilizado para la reconstrucción de varios tejidos y puede generar efectos curativos25,26. Hojas ASC que exhiben potencial clínico terapéutico podrían acelerar la curación de muchos tipos de heridas. Además, el trasplante alogénico de las hojas de la ASC, combinado con el uso de piel artificial, podría ser aplicable al tratamiento de las úlceras intratables o quemaduras, como los observados en la enfermedad arterial periférica o enfermedad del colágeno, o puedan ser administrados a pacientes que están desnutridos o que están usando esteroides. Este enfoque aumenta la eficacia del trasplante ASC. El modelo de rata ZDF cicatrización produce una condición de la herida grave que se asemeja el proceso de cicatrización humana y simula las condiciones clínicas en un animal experimental pequeño.

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Representative Results

Este protocolo intentó establecer una nueva terapia celular para las heridas diabéticas insuperables. Brevemente (como se ilustra en la figura 1), hojas de allogeneic rASC fueron creadas de las ratas normales utilizando ingeniería hoja de la célula y luego fueron trasplantadas con una bicapa de piel artificial a un defecto de piel de espesor total en una rata diabética. Imágenes de microscopio de luz de un buen ejemplo de una hoja de rASC (figura 2A) y un mal ejemplo de una hoja de rASC (figura 2B) se muestran en la figura 2. Cuando ASCs son plateados sobre un nuevo plato de la cultura, el plato debe ser lentamente hacia adelante y hacia atrás sacudieron e izquierda y derecha en una incubadora para lograr la siembra de rASC uniforme y una hoja de rASC uniformemente gruesa (figura 2A). Si el rASCs no se coloca uniformemente y cultivadas en la superficie de la placa de cultivo, la hoja no puede recogerse como una hoja ASC contigua (figura 2B). La figura 3 muestra las hojas de ASC que cosechadas como una hoja de células contiguas a temperatura ambiente porque el ASCs unieron uniformemente a la superficie del plato. Generalmente, rASC hojas pueden ser manejadas con un par de pinzas. Si es necesario, que puede utilizarse una membrana de transferencia para transferir una hoja de células de la placa de cultivo en el sitio de la herida, tal como si la hoja de la célula es frágil y quebradizo.
Figura 4 muestra las ratas ZDF utilizadas como un modelo de curación de herida diabético y el trasplante allogeneic rASC hojas combinada con piel artificial. Una hoja de rASC es suave y flexible, ajustable en tamaño y capaz de ser extendido a todos los rincones del sitio de la herida con un par de fórceps (Figura 4A-F). El defecto cubierto por la hoja de rASC también fue cubierto con piel artificial (15 x 10 mm2) y se sutura con aproximadamente 10 puntos de sutura con una sutura de nylon 5-0 (figura 4). Para proteger la herida, se mantuvo un ambiente húmedo de la herida y exudados fueron absorbidos, se colocó un apósito no adhesivo (20 x 15 mm2) sobre la piel artificial, y se aplicaron suturas de nylon 5-0 (figura 4I). El apósito no adhesivo se elimina a menudo por las ratas ZDF dentro de varios días de aplicación. Por lo tanto, las ratas deben ser vigiladas después del trasplante. Por lo general, el apósito no adhesivo es reemplazado cada 2 días bajo anestesia general. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las fotografías macroscópicas en la figura 5 son los resultados representativos del trasplante de una hoja de rASC. En nuestro estudio anterior, el área de la herida de media en el grupo de trasplante rASC hoja (figura 5B) fue significativamente menor en el grupo control (figura 5A). Para los controles, sólo piel artificial fue utilizada para cubrir la herida, sin el trasplante de una hoja de rASC. Estas imágenes fueron tomadasel día 14 después de la creación de la herida (n = 6 en cada grupo)31.

Figure 1
Figura 1: esquema del procedimiento de trasplante Experimental de. Esquema del procedimiento de trasplante experimental realizada con una hoja de células madre derivadas de adiposo (rASC) rata allogeneic y piel artificial en un modelo de cicatrización de la rata de diabetes tipo 2 y obesidad. (A) rata tejido adiposo fue suprimido quirúrgico de ratas Lewis normales. rASCs fueron aislados y sembradas en una placa de cultivo de 60 cm2 y se cultivan a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 para 7-8 días. (B) rASCs fueron subcultivados cada 2-3 días, y paso 3 rASCs fueron sembradas en un plato de cultura sensible a la temperatura de 35 mm de diámetro. Las células fueron cultivadas en medio completo que contiene fosfato ácido L-ascórbico magnesio sal n-hydrate (AA) de 16,4 μg/mL a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 para 7-8 días. El rASCs cosecharon como una hoja de rASC contiguas reduciendo la temperatura a 20 ° C. (C) hojas de rASC trasplantadas en un defecto de piel de espesor total de 15 x 10 mm2 con hueso expuesto en las cabezas de las ratas que diabetes y obesidad (Zucker grasa (ZDF) las ratas diabéticas) utilizado como un modelo de cicatrización. (D) una hoja de rASC fue colocado en el cráneo directamente sobre el defecto y cubiertos) con un 15 x 10 mm2 lámina de piel artificial de dos capas, que fue suturada en lugar con nylon 10 suturas (5-0). Diabetes 2015; 64: 2723-2734; con el permiso. Diabetes (c) copyright (2015) por la American Diabetes Association. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Luz microscopio imágenes de ASCs. Imágenes de microscopio de luz de la proliferación de la ASC en el borde de platos de la cultura, sin huecos entre la ASC. (A) un rASC hoja con un espesor uniforme en todas direcciones 7 días después del comienzo del cultivo (A). (B) una hoja de rASC sin siembra uniforme. Una hoja de rASC contiguos no puede obtenerse en el día 7 después del comienzo del cultivo (B). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Time-lapse imágenes de rASC estatuas de hoja a temperatura ambiente. Imágenes de Time-lapse del estado de una hoja de rASC a temperatura ambiente. rASCs en una placa de cultivo sensibles a la temperatura de diámetro 35 mm de forma espontánea y poco a poco desprendidas de la superficie del plato a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ° C) y se cosecharon como hoja contigua. (A) aproximadamente 5 minutos después de mover la placa de cultivo temperatura sensible a la temperatura ambiente. (B) aproximadamente 10 minutos después de mover la placa de cultivo sensibles a la temperatura de diámetro de 35 mm a temperatura ambiente. (C) unos 20-30 min después de mover la placa de cultivo temperatura sensible a la temperatura ambiente. Se trata de una hoja de buena calidad rASC (C). Estado de hoja de rASC (D-E) aproximadamente 20-30 min después de mover la placa de cultivo temperatura sensible a la temperatura ambiente. Esta hoja de rASC es de calidad media (D). (F-G) rASC hojas generalmente se manejan con un par de pinzas. Si la hoja de la célula es frágil y quebradizo, una membrana se puede utilizar como un andamio para la transferencia de la capa celular de la placa de cultivo en el sitio de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de series de tiempo de la herida la creación y rASC hoja de trasplante con piel Artificial y un vendaje no adhesivo
Imágenes de series de tiempo de herida creación y rASC trasplante de la hoja con la piel artificial y un vendaje no adhesivo. Ratas (A) los jefes de ZDF se afeitaron con una afeitadora eléctrica. Después de afeitar el pelo del cuerpo, marcas de verificación (15 x 10 mm2) fueron dibujadas con un lápiz hidrofóbico aceitoso. Defecto de espesor total de la piel (B) A (15 x 10 mm2) fue creado en la cabeza de una rata ZDF anestesiado mediante la eliminación de tejido cutáneo de la epidermis al periostio. La piel y tejido cutáneo fueron suprimidas con un bisturí, y el periostio fue quitado con un Periostótomo Raspatories. Con una gasa humedecida con solución salina estéril, se aplica presión para detener el sangrado después de la supresión. (C) trasplante de la hoja de rASC. Una hoja de rASC se colocó sobre el defecto inmediatamente sobre el cráneo de la rata usando un par de pinzas. (D G) Extensión de hoja rASC ajuste para que coincida con el tamaño de la herida. La hoja de rASC es flexible, ajustable y puede ser extendida a todos los rincones del sitio de la herida utilizando un par de pinzas. Para heridas más amplia, se pueden apiladas dos o tres hojas flexibles rASC. (H) sutura de la piel artificial que cubre la hoja de rASC. El defecto y la hoja de rASC trasplantado se cubrieron con piel artificial (15 x 10 mm2), que fue suturada con 10 puntos de sutura con sutura de nylon 5-0. () Sutura del no-adhesivo apósito (20 x 15 mm2) para el sitio de la herida cubierta con piel artificial. Para proteger la herida, el apósito no adhesivo (20 x 15 mm2) se colocó sobre la piel artificial con suturas de nylon 5-0. Diabetes 2015; 64: 2723-2734; con el permiso. Diabetes (c) copyright (2015) por la American Diabetes Association. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: defectos de la piel de imágenes macroscópicas de espesor completo. Fotografías macroscópicas de piel de grosor total defectos sin el trasplante de una hoja de rASC (A) y con el trasplante de una hoja de rASC (B) 14 días después de la creación de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los pasos más críticos para el cultivo con éxito de una hoja de rASC son los siguientes: 1) la temperatura debe mantenerse a unos 37 ° C durante el cultivo en los platos de la cultura sensible a la temperatura. Durante la creación de una hoja de rASC, cada procedimiento fue realizado en una placa térmica de 37 ° C, y cada reactivo fue calentado a 37 ° C para evitar que las células espontáneamente extracción desde el plato31. 2) las ratas ZDF destinatarias deben controlarse para evitar la remoción del apósito no adhesivo, que es fundamental para el exitoso trasplante de rASC hojas. Si se retira el apósito, debe aplicarse un nuevo apósito no adhesivo para evitar que las hojas ASC trasplantadas de extracción desde el sitio de la herida.

Mediante este procedimiento, rASC hojas generalmente se obtuvieron dentro de 5-7 días de la siembra paso 3 células en platos de cultivo temperatura sensible. El tiempo de la cultura necesario para generar una hoja de rASC puede ajustarse según la densidad celular inicial y el tiempo en que se aplica el medio de cultivo completo con AA. Si una hoja de rASC se desprende del plato durante el cultivo de la célula, debe rehacer la hoja rASC y platos adicionales deben estar preparados en caso de separación de la célula.

Las limitaciones de este protocolo son los siguientes: 1) gestión de la temperatura terminante debe ser aplicado para mantener una temperatura aproximada de 37 ° C durante todo el proceso al usar platos de cultura sensible a la temperatura. 2) después de obtener una hoja de rASC, aparatos médicos especiales se deben usar para mantener condiciones de humedad, porque la rASC hoja es sensible a las condiciones secas. 3) gestión postoperatoria, incluyendo la observación diaria de la condición de la rata receptora, es necesario.

Las heridas más grandes con hueso expuesto a menudo se observan clínicamente. Por ejemplo, pueden desarrollar trauma de accidentes de tráfico, quemaduras, heridas infectadas y heridas necróticas o dañadas después de desbridamiento en heridas grandes con hueso expuesto. Aquí, se desarrolló un modelo clínico de heridas severas con un defecto grande de piel de espesor total con hueso expuesto en ratas con diabetes tipo 2 y obesidad. Este modelo tiene el potencial para ser utilizado como un modelo estándar para la evaluación de la cicatrización de heridas en ratas diabéticas.

La piel artificial es un dispositivo médico disponible comercialmente para defectos de piel de grosor total después del desbridamiento, y factor de crecimiento recombinante básico del fibroblasto (bFGF) ha sido ampliamente utilizado para la cicatrización de la herida para promover la angiogénesis y la granulación. Estos dos tratamientos se han utilizado para conseguir resultados terapéuticos considerables, incluso para las heridas crónicas, como las heridas de diabéticas. Se ha reportado que las ASCs secretan angiogeneic factores de crecimiento28, como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), bFGF, que podría contribuir a neovascularización29,30 y acelerar la cicatrización de heridas. Nuestro estudio anterior confirmó que ASC continuamente secreta estos factores de crecimiento31. Por lo tanto, ASC hojas, combinadas con piel artificial, tienen el potencial para ser utilizado como una nueva opción terapéutica para acelerar la vascularización y cicatrización31, y estas hojas podrían ser aplicables al tratamiento de muchos tipos de úlceras intratables o quemaduras en ajustes clínicos humanos en el futuro.

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Disclosures

Los siguientes autores revelen relaciones financieras relevantes para esta publicación: Teruo Okano es fundador y director de la Junta de la célula semilla Inc., que licencias de tecnología y patentes de la Universidad de medicina de la mujer de Tokio, y Teruo Okano y Masayuki Yamato son partes interesadas en la Universidad de medicina de la célula semilla Inc. Tokyo mujeres recibe fondos de la investigación de la célula semilla Inc. Otros autores declaran que no tienen relaciones financieras relevantes para esta publicación.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Dr. Yukiko Koga del Departamento de plástica y reconstructiva, Juntendo University School of Medicine, para proporcionar consejos prácticos. También agradecemos al Sr. Hidekazu Murata del centro de Tokio diabéticas de médica Facultad de Medicina Universidad excelente soporte técnico. Este estudio fue apoyado por la creación de centros de innovación de avanzada programa interdisciplinario de investigación áreas del proyecto para los sistemas de innovación en desarrollo "celda hoja de tejido ingeniería centro (CSTEC)" desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) de Japón.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM glutamax Invitrogen 32571-036 Carlsbad, CA
Fetal bovine serum (FBS) Japan Bioserum Co Ltd. S1650-500
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-122
Collagenase A Roche Diagnostics 10 103 578 001 Mannheim, Germany
60 cm2 Primaria tissue culture dish BD Biosciences 353803 Franklin Lakes, NJ
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) Life Technologies 1490-144
0.25% Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Life Technologies 25200-056
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate Wako 013-19641
35-mm temperature-responsive culture dish (UpcellTM) CellSeed NUNC-174904 Tokyo, Japan
Microwarm plate (MP-1000) Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Rodent mechanical ventilator Stoelting #50206 Wood Dale, IL
4% isoflurane Pfizer Japan 114-13340-3 Tokyo, Japan
Artificial skin (Pelnac®) Smith & Nephew PN-R40060  Tokyo, Japan
Non-adhesive dressing (Hydrosite plus®) Smith & Nephew 66800679 Known as Allevyn non-adhessing® in the United State
5-0 nylon suture Alfresa EP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TUBES greiner bio-one 227 261
15 mL Centrifuge Tube Corning Incorporated 430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEAL Hu-Friedy P14 Chicago, IL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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