브릴 루앙 분광학에 대한 세포 외 기질 단백질 섬유의 제조

1School of Physics and Astronomy, University of Exeter, 2Department of Physics and Geology, University of Perugia, 3Istituto Officina dei Materiali del CNR, Unità di Perugia
Published 9/15/2016
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Bioengineering
 

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Edginton, R. S., Mattana, S., Caponi, S., Fioretto, D., Green, E., Winlove, C. P., et al. Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy. J. Vis. Exp. (115), e54648, doi:10.3791/54648 (2016).

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Abstract

Introduction

브릴 루앙 광 산란 (BLS) 효과는 그것은 재료의 열적으로 활성화 음향 포논에 의해 가시 광선의 비탄성 산란으로 구성되어 1922 년 1 레옹 브릴 리언에 의해 발견됐다. 고체 물리학에서, 음향 포논은 격자의 모든 원자의 일관된 진동이다. 격자 내의 원자 개의 교번 종류의 일차원 체인 IR 흡수 및 라만 산란 (도 1)에 의해 프로브 BLS 계시 음향 포논, 광학 포논의 차이를 나타내는 단순 모델이다. 광학 포논은 원자의 반대 위상 운동이다 동안 음향 포논는 (길이 음향 포논) 또는 전파 방향 (횡 음향 포논)에 수직 전파 방향을 따라 변위 사슬 원자의 위상 이동되어 진동 전기 쌍극자 모멘트를 생산하는 (세로 또는 가로 모드).

BLS의 분광SCOPY은 1920 년대 이후 분석 과학 분야에서 사용되어왔다; 하지만, 1980 년대 이후에만 높은 콘트라스트 측정은 탠덤 멀티 패브리 페롯 분광계를 사용하여 수 있었다. 그 이후로, 2-4 및 자성 재료 (광자-인 Magnon의 상호 작용을 통해) (광자 - 포논 상호 작용이 이용된다) 응집 물질의 분석 애플리케이션을위한 BLS의 발전의 증가 (5)가 초래되고있다. 생물 의학 응용 6-8에 정액 작품 여기서 적용된 하나의 탄성 텐서의 완전한 설명을 달성하기 위해 혈소판 형으로 반사 기판을 사용하여 이전에 9 기재된 것을 포함하여, 다양한 방법의 발전 경로를 마련했다 샘플.

본 연구에서, 우리는 섬유 단백질 엘라스틴 결합 조직의 세포 외 기질의 기본 구성 요소에 BLS 분광법을 적용하고 I-콜라겐을 입력합니다. 티I 콜라겐 YPE하는 등의 힘줄과 같은 조직에서 기본적으로 단단한 섬유를 형성하기 위해 광범위한 교차 연결 측 방향 및 세로 방향으로 조립 강성, 삼중 나선 분자이다. 콜라겐 네트워크는 종종 엘라스틴의 네트워크와, 비정상적 엔트로피와 환경과의 소수성 상호 작용의 조합을 통해 장거리 탄성을 생성 및 폐 및 피부와 같은 조직의 기능에 필수적인 단백질을 공존. 모두 섬유가 현재 연구 육방 모델을 이용하여 모델링된다. (9) 1 부에서는, 동물 조직으로부터 섬유를 추출하고, 분광 측정을위한 샘플을 제조하는 프로토콜을 기술한다. Part 2에서는 브릴 루앙 장치를 설정하고 섬유로부터 스펙트럼을 획득하기위한 절차가 제공된다. 3 부 내부에 포함 된 관련 기계적 정보를 추출하는 브릴 루앙 스펙트럼에 적용된 데이터 분석의 상세를 제공한다. 그런 다음, 대표적인 결과 제시 및 discusse된다디.

Protocol

주의 : 생물 안전 프로토콜을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 실험에 사용 된 레이저 클래스 3B 레이저이다 시스템의 안전한 사용을위한 현지 법률 준수가 필요합니다. 개인 보호 장비 (안전 고글)의 사용을 포함 레이저 분광 측정을 수행 할 때 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오.

꼬리 힘줄은 EU 규정 2,009분의 1,099 따라와 동물의 복지 (도축 또는 살인) 1995 년 소 목덜미 인대가 로컬 도살장에서 얻었다 규정에 다른 목적을 위해 안락사 7~8주 된 위 스타 쥐에서 얻었다.

샘플 섬유의 제조 1

주 : 세포 외 기질 단백질 섬유는 다양한 방법을 사용하여, 다양한 조직으로부터 추출 될 수있다. 프로토콜은 널리 적용 절차에 따라 정제 하였다.

  1. 체중 나트륨 펜토 바르비 100 ㎎ / ㎏ 복강 내 주사에 의해 래트를 희생한다. 그리고 단일 에지 면도날로 아래로 눌러, 신체와의 접촉 지점에서 직접 꼬리를 절단. 집착 필름에 꼬리를 감싸 필요한 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관합니다.
  2. 냉동실에서 꼬리를 수집, 여전히 실온에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (PH 7.4)로 가득 페트리 접시에 해동두고 다음 냉동 동안 근위 끝에서 20 mm 길이 세그먼트를 잘라.
  3. 꼬리 해동되면 피부 분할 메스를 사용하여 세그먼트의 길이를 따라 절개를 만든다. 그리고 꼬리 척추 약 4 끼 우고 건 번들을 나타 내기 위해 다시 껍질.
  4. 미세 집게를 사용하고 사전에 변형을 가하지 않도록주의하면서 홍보, 부드럽게 칼집에서 각 섬유를 그릴 및 v 나트륨 아 지드 승 / 0.01 %로 증류수가 들어있는 유리 병에 비수 (NaN 3)에 그것을 배치이벤트 세균의 성장 및 저장 냉장. 하나의 꼬리는 약 삼십 건 섬유를 얻을 수 있습니다.
  5. I 콜라겐 순수한 섬유 유형을 얻으려면 프로테오글리칸 및 기타 모든 noncollagenous 물질을 제거 힘줄 섬유에 세 부분 효소 분해 공정 (10)을 적용합니다.
    1. 먼저, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 pH가 8.0에서 0.05 M 트리스 완충액 및 0.06 M 소듐 아세테이트 (CH 3 COOH를) 0.125 U / ㎖ chondroitinase ABC에서 섬유 젖어.
    2. 그 후, pH가 6.0에서 0.05 M 트리스 완충액 및 0.15 M 염화나트륨 1 U / ml의 스트렙토 히알루의 섬유를 담그고, 37 ℃에서 24 시간 동안 진탕 인큐베이터로 복귀.
    3. 마지막으로, 37 ° C에서 진탕 인큐베이터에서 16 시간 동안 pH가 7.2에서 0.05 M 인산 나트륨 (NaHPO 4), 0.15 M NaCl을 트립신으로 1 ㎎ / ㎖의 섬유 젖어.
  6. 증류수를 포함하는 유리 병에 냉장 정제 된 섬유를 저장, 위스콘신측정을 위해 요구 될 때까지 일 0.01 % NaN3가은 박테리아 성장을 방지 할 수있다.
  • 소 목덜미 인대에서 엘라스틴 섬유의 추출
    1. , 도살장에서 소 목덜미 인대를 확보 집착 필름에 포장하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관합니다.
    2. 순수한 엘라스틴을 생성하기 위해 냉동실에서 인대를 수집하여 다음과 같이은 랜싱 절차에 따라 끓는 수욕 중에서 11 인대를 실온에서 해동 메스를 사용하여 탈지하고 소화 할 수있다.
      1. 증류수에 수산화 나트륨 (NaOH) 0.1 M 용액을 제조하고, 조직을 피복하는 삼각 플라스크에 탈지 인대에 추가.
      2. 45 분 동안 95 ℃의 물을 용기에 플라스크를 끓인다.
      3. 소화 플라스크 인대를 제거하고 pH가 7.0 (pH 미터를 사용하여 모니터)가 얻어 질 때까지 증류수로 반복하여 불용성 조직 블록을 씻는다.
      4. 최종에서 조직을 제거용액을 세척하고, 밀폐 용기 (박테리아 성장을 방지하기 위해 0.01 % NaN3가 혼합)과 냉장 보관 증류수에 담근.
    3. 냉장고에서 조직을 수집하고, 더 큰 블록에서 (길이 20 ~ 50 mm, 2mm 두께) 거리에 부드럽게 작은 엘라스틴 세그먼트를 당겨 너무 많은 힘과 사전 변형, 사용 핀셋을 적용하지 않도록주의하고 배치 PBS 용액 (pH를 7.4)와 페트리 접시입니다.
    4. 미세 핀셋을 이용하여 조심스럽게 두께 1mm 주위에 작은 섬유 다발을 애타게 메스를 사용하여 몇 mm의 길이로 자른다.
    5. (세균의 성장을 방지하기 위해 0.01 % NaN의 3) 및 측정에 필요한 때까지 냉장 보관 증류수를 포함하는 유리 병에 섬유를 전송합니다.
  • 반사성 기판 상 섬유를 설치
    1. 다이아몬드 커터를 사용하여, 반사 실리콘 슬라이드의 일부를 잘라.
    2. 수화 compartme를 만들려면NT (섬유에 맞게 충분히 큰) 중앙에 중공 컷 실리콘 슬라이드를 통해 적합하고, 실리콘 기판 상에 배치하는 파라 필름의 스트립을 잘라.
      참고 : 단계 1.3.4에 밀봉 할 때 네 가지 측면 중 하나는 공기가 열려 있도록 건조 섬유 측정을 위해 U 자형으로 파라 필름을 잘라.
    3. 스토리지 솔루션에서 단일 섬유를 수집하고 샘플을 씻어 5 분 동안 실온에서 순수한 물이 가득 작은 배양 접시에 배치하는 미세 집게 한 켤레를 사용, 냉장고에서 섬유를 제거합니다. 그 후, 섬유를 수집하고, 실리콘 기판 위에 파라 필름의 중공의 중심에 옮긴다.
      주의 :이 작업 중에 스트레칭하여 섬유의 손상을 방지하고,이 기계적 특성의 변화를 일으킬 수 있으므로 기판 상에 샘플을 재 방향 마십시오.
    4. 섬유 위에 얇은 유리 커버 슬립을 놓고 아래 파라 필름을 용융 유리 표면에 부드럽게 가열 납땜 인두를 통과하여 챔버를 밀봉유리.
      주의 : 너무 가까이 인두 팁을 가져 또는 과도하게 기판을 가열하지 않음으로써 섬유의 손상을 방지.
    5. 작은 무게로 평평한 표면에 밀봉 된 챔버를 놓고 시편의 손상을 피하면서 샘플과 실리콘 기판 사이 좋은 접촉을 달성하기 위해 약 12​​ 시간 동안 그대로 두십시오.
    6. 나사를 이용하여 무게를 제거하고 상기 기판의 위치에 챔버를 고정.
  • 2. 브릴 루앙 실험 설정 및 섬유 스펙트럼 획득

    1. 샘플 구획의 제조
      1. 볼륨 위치 산란 (도 SI-1, 2 참조 Φ = 90 °) 일정한 산란 각도를 유지하면서 샘플의 면내 회전 가능하도록 각도계가 장착 된 수직 홀더에 부 1.3으로 조제한 시료를 탑재.
      2. 르 통해 샘플에 레이저 광을 정확하게 포커스 조정을 수행NS. 9
        조심 : 레이저 출력이 너무 높게하여 샘플 화상을 생성 할 수있다. 이 샘플의 손상을 방지하기 위해 너무 높은 좋은 감도를 제공하기 위해 충분히 높게 설정하지만되어 있는지 확인합니다. 여기에서 우리는 샘플에 76 mW에의 전력을 사용했다. 이것은 또한이 얇은 레이저 조사에 의해 발생 된 열을 방산하는 데 도움이되는 기판과 접촉하는 것을 고려하면, 샘플을 연소없이 양호한 감도를 얻기에 충분했다.
      3. 버니어 스케일을 이용하여 입사하는 레이저 빔에 대해 45 ° 각도 (Φ)에 시료를 놓고. 측정을 실행하고 (아래 참조)의 스펙트럼 피크의 세기를 최대화하여 최적의 위치 결정을 달성한다.
    2. 분광계 설정
      1. 수집 및 데이터의 조작에 소프트웨어를 열고 샘플 (12)의 브릴 리언 스펙트럼의 인수를 설정합니다. 여기에 설명 된 절차는 MU 적용ltipass 탠덤 간섭계 (그림 SI-1A).
      2. 독립적으로 제어 유닛에 의해 피에조인가 전압을 변화 두 페 브리 - 페로 (FP) 간섭계 정렬. 이 사전 정렬 순서는, 각 FP에 의해 반사 된 광을 관찰한다. 두 FPS 반사 강도가 제로 경향 경우 정확한 정렬에 도달한다.
      3. 스펙트럼 보정 : 액세스 가능한 주파수 범위, 또는 자유 스펙트럼 범위 (FSR)를 두 개의 제 FP 공동의 거울, L, FSR = C / 2 L, C는 빛의 속도이다 통해 사이의 거리에 의존 L은 다이얼 게이지에 의해 측정된다.
      4. 두 FP 간섭계의 스캔을 동기화하고 탠덤 멀티 구성에 광학 시스템을 전환합니다. 전송 레이저 광 강도의 피드백 제어를 자동으로 측정하는 동안 두 FPS의 정렬을 유지한다.
    3. 측정 오F 브릴 루앙 스펙트럼
      주의 : 브릴 루앙 스펙트럼은 시료와 이러한 매개 변수 때문에 조심 제어의 온도와 수분에 크게 의존 재현 스펙트럼을 얻는 열쇠입니다.
      1. 샘플의 브릴 리언 스펙트럼의 획득을 시작 양호한 신호 대 잡음비가 얻어 질 때까지 실행. 이 샘플의 산란 단면적, 농도와 두께에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
        참고가 신호 대 잡음비를위한 경험칙은 아니지만 스펙트럼 품질 분석 특정 샘플에 기초 실험자에 의해 확인된다. 스펙트럼 품질 측정 시간 사이의 트레이드 오프 따라서 실험 파라미터들은 특정 어플리케이션에 따라 선택 될 필요가있다.
      2. 건조 시료의 측정을 위해, 연속적인 스펙트럼을 취하지 - 이들 각 단계 2.3.1 다음 - 피크의 위치까지 변경을 난의 관찰. 샘플 방 분위기와 평형 상태에 있고, 더 건조 스펙트럼에 영향을 미치지 않을 것이다 때 달성된다.
      3. (; V는 산란 평면 광 편광에 대하여 수평 방향에 대한 수직 및 H 약자 VV 또는 VH) 및 섬유 축 각각의 각도 스펙트럼을 획득 광의 편광을 선택 (θ;도 SI-1) 샘플을 회전시켜 손으로 비행기.
      4. 후속 처리를 위해 파일로 브릴 루앙 스펙트럼을 저장합니다.

    브릴 루앙 스펙트럼 3. 분석

    주 : 루앙 피크 맞는 다양한 기능 분석을 사용하여 수행 될 수있다. 이 점탄성 미디어 감쇠 음향 모드에서 발생하는 피크에 대한 유효한 모델이 같이 감쇠 조화 진동자 (DHO) 함수 4,13가 선정되었다.

    1. 브릴 루앙 피크의 맞춤 분석
      1. 일에 대한 관심의 피크의 스펙트럼 범위를 선택전자 브릴 리언 스펙트럼.
      2. 배경 스펙트럼은 0보다 더 큰 경우에 적합 기준을 사용.
        주 : 기준은 스펙트럼에 따라 다를 수 있습니다. 보정이 체계적이고 재생 가능한 방식으로 적용되어 있는지 확인합니다.
      3. 수렴이 달성과 최고의 피팅 곡선이 얻어 반복적으로까지 관심의 브릴 루앙 피크에 DHO 기능 4,13를 사용하여 피팅에 대한 자세한 최소 제곱 법을 적용합니다. 그런 다음 파일로 맞는 결과를 저장합니다.
      4. 각 브릴 루앙 이중의 두 봉우리의 맞춤 매개 변수의 평균값을 구하십시오.
      5. 피크 주파수에서 음향 파의 속도를 계산한다 (아래의 식을 사용하여).
      6. θ 그래프, 예를 들어 섬유 축에 대한 각도 대 음속 통해 피팅 결과를 플롯 , 및 탄성 텐서 계수 등의 기계적 수량을 추출 (9 음향 이방성 시스템, 예를 들면) 관련 모델을 적용 할 수 있습니다.

    Representative Results

    이러한 실험 (도 SI-1A)에 사용되는 브릴 루앙 분광 장치는 이전에 설명 하였다.도 9는 단일 모드 샘플 76 mW의 출력 전력과 532 nm의 고체 레이저를 사용한다. 20cm 색지움 렌즈 시료에 레이저 광을 집중 및 산란 형상의 샘플로부터 산란 광을 수집한다. 탠덤 멀티 패브리 - 페로 간섭 현상은 저잡음 광 다이오드 검출기에 의해 검출되는 산란 광을 필터링하기 위해 사용된다. 이 방법은 매우 탈론의 자기 정렬 압전 스캐닝을 통해 높은 콘트라스트 (약 120dB)과 안정성을 제공합니다. 편광판 및 분석기는 입사와 산란광의 편광을 선택하기 위해 도입된다. 스펙트럼은 일반적으로 O 편광자는 입사광의 편광을 수직 (V) 방향으로 선택적으로 수직 (V)을 선택 분석기를 선택 상태로 유지 고정하여 얻어진산란 된 빛의 편광의 연구 수평 (H) 방향. 이 구성에서, 종 방향 및 횡 방향의 음향 모드가 각각 검출된다.

    전형적인 브릴 리언 스펙트럼 인해 탄성 산란 샘플의 역학 특성이다 동등 피크 시프트 또는 브릴 루앙 이중선, 하나 이상의 세트에 강한 중심 피크를 갖는다. 이러한 측정에서는, 산란광은 표면 (PS 모드)에 평행하게 이동하는 벌크 포논로부터 샘플 - 기판 계면에서의 입사광의 반사 후, 샘플을 준 직교 주행 벌크 포논에서 모두 기인 할 수있다. (9)

    도 2는 30 GHz의 자유 스펙트럼 범위, 0.2 GHz의 해상도 VV 편광 얻어진 건조한 수화 된 트립신 분해 콜라겐 섬유의 BLS 스펙트럼을 나타내고, 약 10 분 콜렉션 시간스펙트럼 당. 각 스펙트럼을 θ 회전의 특정 각도에 대응 (그림 SI-1C). 의 PS 모드 (9.85 ± 0.03) GHz의 (그림 2A)에있을 동안 θ = 0 °에서 건조 콜라겐 섬유에서, 세로 모드 (18.92 ± 0.02) GHz에서 벌크 피크에 상승을 제공합니다. 같은 범위에서 θ 변경에 따라 낮은 주파수에 PS 피크 이동 θ가 90 ° (포논 반경 방향을 프로빙) 0 ° (섬유의 축 방향을 프로빙 포논)에서 간다, 벌크 피크 반면 약간 붉은 변화 (포논은 회전에 걸쳐 준 반경 방향을 프로빙). 젖은 콜라겐 섬유에 의한 종 방향 포논에 두 개의 피크는 10.5 GHz에서 대량 최대 4.9 GHz의 (그림 2B)에서 PS 피크와 실험을 통해 본질적으로 변경되지 않습니다. 이것은 18.92의 데이터에 대해 첨두 주파수의 80 내지 100 % 감소 (나타내고및 9.85 GHz의 각각), 따라서 수화에 의한 재료의 강성의. 수화 콜라겐의 벌크 및 PS 모드는 탄성 정수 물에 의해 연주 지배적 인 역할과, 물과 섬유 공헌의 조합 것을 제안, 순수의 모드에 주파수에 가까운 거짓말을합니다.

    도 3은 θ = VH 편광을 30 °에서 측정 된 드라이 트립신 분해 콜라겐 섬유의 스펙트럼을 도시; VV 편광의 누설은 PS 및 대량 피크가 여전히 관찰 할 수 있습니다. 가로 모드 (4.1 ± 0.2) GHz의 = 0 °) 0 ° ~ 90 °에서 θ 변화에 따라 약간 블루 변화에서 피크를 차지하고있다. 가로와 PS 봉우리 모두를위한 맞춤 결과도 표시됩니다. 피크 파라미터 추출 및 탄성파 속도는 V의 L = V의 λ / √2로 도출 된 Q, S = 2 K (Φ) 죄도 SI-1B, c), 따라서 이 방법은 특히 유리하게.

    도 4는 각도 θ의 함수로서 종횡 모드로부터 획득 된 음향 파의 속도 (PS 및 T 피크)의 플롯이다 . 아래의 식 A1 및 A2 - - 육각형 대칭 탄성체 (7)의 모델에 맞추기 분석은 건조 트립신 소화 타입의 탄성 텐서의 다섯 가지 구성 요소 나 섬유 (표 1) 콜라겐을 제공합니다.

    9 주어진다 =

    식 (1) (A1)

    식 (2) (A2)

    ρ는 물질의 밀도, C 11, C 33, 44 C와 C (13)이고 육각형 대칭으로 시스템의 특성을 다섯 탄성 상수의 네 가지입니다. 다섯 번째 정수는 12 C를 12 ~ C 11 C 근사 관계로부터 유도 될 수있다 -. C 2 44 7

    계수는 이전에 정제되지 않은 콜라겐 fibe에서 얻은 것과 유사하다RS. 9 두드러진 차이점은 탄성 계수의 E ǁ와 E의 유사한 값으로 반영 13 C 계수 발생 수직 정제 된 콜라겐 (약 7.2 및 7.7 GPA).

    도 5는 습윤 대 θ 콜라겐 길이 음속의 플롯 . 이 경우, 주파수의주기적인 변화는 오차 내 등속주는 관찰되지 않는다. (6)는 θ = 0 °에서 측정하고 건조한 수화 엘라스틴 섬유의 스펙트럼을 나타낸다. 가로 모드는 이러한 샘플 검출되지 않았다. 건조 엘라스틴에서 벌크 피크가 8.2 기가 헤르쯔 (9) (13 건조 콜라겐의 대응하는 피크보다도 낮은 20 %)의 PS 모드 동안 16.8 GHz에서 일어난다. 젖은 엘라스틴 섬유 벌크 P 제시eak에서 (12.30 ± 0.01) GHz의 (건조 엘라스틴의 대부분 피크 이상의 주파수에서 37 % 이하). 습식 엘라스틴의 PS 모드가 있기 때문에 그 주파수에서의 탄성 피크의 강렬한 꼬리의 스펙트럼에서 명백하지 않다. 한편, 7.5 GHz에서 피크가 대량의 물에 기인한다.

    그림 7은 θ에 건조 엘라스틴 섬유의 탄성파 속도의 의존성을 보여줍니다. 이들 데이터로부터, 탄성 텐서 성분 (기계적 계수)는 습식 콜라겐으로서 (표 1). (9)을 수득하고, 수화 엘라스틴 섬유의 기계적 모듈러스 등방성의 증거가있다. 이러한 결과는 브릴 루앙 분광법은 강성, 구성 및 재료의 구조적 측면에 대한 관련 정보를 제공하는 방법을 나타냅니다.

    그림 1
    인터넷gure 1. 음향 및 원자 일차원 체인 광학 포논. 일차원 이원자 체인 음향 광학 진동 개략도. 원자 질량 m (1)과 m (2)를 가지고 교대. 화살표는 원자의 변위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    트립신 정제 형태의 그림 2 브릴 루앙 스펙트럼 나는 쥐의 꼬리 건에서 섬유 콜라겐. (A) 건조 섬유와 (B)의 스펙트럼은도에서, 섬유 축 θ에 다른 각도에서 VV 측정에서 섬유를 수화. 순수한 증류수의 스펙트럼도 도시되어있다. 스펙트럼은 벌크 피크의 강도 (높이)로 표준화 하였다. 라벨 B 및 PS 각각 벌크 및 병렬 - 표면 형태에 관련된 피크를 나타낸다. 오차 막대는 표준 오류 (카운트 수의 제곱근)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    건조 트립신 정제 형태의 그림 3. 브릴 리언 스펙트럼 나는 쥐의 꼬리 건에서 섬유 콜라겐. 스펙트럼을 θ에서 VH 측정에서 = 30 °. 라벨 T, PS 및 B는 각각, 병렬로 표면 및 벌크 모드를 횡단 관련 피크를 나타낸다. 모두 T와 PS 모드에 대한 감쇠 조화 진동자 (DHO) 모델을 사용하여 착용감 분석 결과도 표시됩니다. 오차 막대는 표준 오류 (카운트 수의 제곱근)를 나타냅니다./54648fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    섬유 축 각도 대 건조 트립신 정제 콜라겐 탄성파 속도 4. 플롯. 브릴 루앙 피크 적합 분석으로부터 유도 건조 콜라겐 섬유의 종 방향 및 횡 탄성파 속도. 데이터는 육각형 대칭 탄성체의 모델에 장착되어 있습니다. 레드 라인 : 식 A1 (R 2 = 0.99); 블루 라인 : 식 A2 (R = 0.36 2). 오차 막대는 브릴 루앙 스펙트럼의 끼움 개의 Levenberg-마르카토 비선형 최소 제곱 후 공분산 행렬의 대각선 요소의 제곱근에서 얻은 표준 오차를 나타냅니다. 더 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의에.

    그림 5
    섬유 축 각도 VS 습식 트립신 정제 콜라겐 길이 음속도 5의 플롯. 브릴 루앙 피크 적합 분석으로부터 유도 수화 된 콜라겐 섬유의 종 음속. 도시 된 라인은 눈에 대한 가이드는이 범위에서 음속의 평균 값을 제공한다. 오차 막대는 브릴 루앙 스펙트럼의 끼움 개의 Levenberg-마르카토 비선형 최소 제곱 후 공분산 행렬의 대각선 요소의 제곱근에서 얻은 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    소 목덜미 인대에서 엘라스틴 섬유의 그림 6. 브릴 루앙 스펙트럼. θ에서 건조하고 수화 섬유의 스펙트럼 = 0 °. 스펙트럼은 벌크 피크의 강도 (높이)로 표준화 하였다. 라벨 B 및 PS 각각 벌크 및 병렬 - 표면 형태에 관련된 피크를 나타낸다. B F와 B W는 각각 섬유와 물을 대량 봉우리를 참조하십시오. 오차 막대는 표준 오류 (카운트 수의 제곱근)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 7
    섬유 축 각도 대 건조 엘라스틴의 길이 탄성파 속도도 7 플롯. 건조 엘라스틴 FIB의 종 음속어 브릴 루앙 피크의 맞춤 분석에서 파생. 데이터는 육각형 대칭 탄성체의 모델에 장착되어 있습니다. 레드 라인 : 식 A1 9 (R = 0.74 2). 오차 막대는 브릴 루앙 스펙트럼의 끼움 개의 Levenberg-마르카토 비선형 최소 제곱 후 공분산 행렬의 대각선 요소의 제곱근에서 얻은 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    보충 그림 1

    그림 SI-1. 브릴 루앙 설정 및 BLS 산란 기하학의 회로도. (A)가 고체 레이저에 의해 방출되는 입사광 아크로매틱 렌즈를 통해 샘플로 전송된다. 벌크 음향 포논에 의해 REFL의 결과들에 의해 산란 된 빛샘플과 접촉하는 기판 표면에서, 광 ection는 광전자 증 배관에 의해 탠덤 멀티 패브리 - 페로 간섭 현상에 의해 여과하고, 검출 렌즈에 의해 수집된다. FP1과 FP2는 탠덤 설정을 구성하는 두 개의 간섭계를 나타냅니다. 편광자는 입사광의 편광을 선택하고, 분석기가 산란되는 빛의 편광을 선택하는 데 사용된다. 반사 형 실리콘 기판의 표면과 접촉하는 시험편 (B) BLS 형상. 유리 슬라이드 (도시하지 않음)를 밀봉 함 시험편 위에 위치되고 부드럽게 압력은 상기 기판의 모서리에 패드를 통해인가된다. 입사광 (케이 i)는 렌즈를 통해 공기 샘플 인터페이스 (K 'I)에서 굴절되고, 샘플 기판 계면에 집중 전달한다. 같은 렌즈에 의해 수집 된 산란광 대량 포논 모두와의 상호 작용의 결과 (Q (의 케이)b) 시료 (Q (S)의 해당 이동 PS). . 빛의 방향 및 표면에 대한 법선 사이의 각도 ΦΦ '로 표시되는 (C) 샘플 및 채택 된 좌표 시스템의 개략도; Z는 섬유의 방향에 대해 특별한 평행 한 축선을 정의한다. 각도 θα는 z는 각각시킴으로써 행한다에 B 포논의 Q의 방향 및 q 사이의 것들이다의 'K, K, S, 난'을, 케이 케이 :. 사건의 파수와 빛 산란, Q의 B, Q 각각 벌크 및 PS 모드의 웨이브 벡터. (심판 9.에서 재판) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    표 탄성파 속도의 맞춤 분석에서 파생 1. 탄성 텐서 계수 나는 섬유 콜라겐 건조 트립신 정제 형태의 탄성 텐서 계수 (. 이 작업)과 엘라스틴 섬유 (REF 9).

    견본 탄성 계수 (GPA)
    트립신 분해 콜라겐 C (33) 18.7 ± 0.1
    C (11) 14.4 ± 0.2
    C (44) 3.4 ± 0.1
    C (12) 7.2 ± 0.2
    C (13) 11.2 ± 0.3
    엘라스틴 C (33) 11.5 ± 0.2
    C (11) 10.4 ± 0.1
    C (44) 1.9 ± 0.2
    C (12) 6.6 ± 0.2
    C (13) 6.8 ± 0.3

    Discussion

    브릴 루앙 산란 분광법 단백질 섬유의 탄성 텐서의 각 구성 요소가 상세히 전례 특징으로 할 수있는 유일한 수단이다. 또한, 측정은 미세 규모에 이루어질 수함으로써 복잡성의 중요성 기계적, 아마도 기능을 이해하기 처음 우릴 수 생물학적 구조의 마이크로 스케일 역학에 신규 한 통찰력을 우리에게 제공 할 매트릭스 구조와 생화학에 최근 공개 된.

    이 기술은 GHz 주파수 범위에서, 기계적 성질을 측정한다. 이 도메인 구조 생체 고분자에 대한 이전 탐험 적이 그것은 모두 상승 탄력의 분자 메커니즘에 대한 근본적인 질문에 대답 할 수있는 수단을 제공한다.

    우리는 동물 조직에서 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 추출 및 브릴 루앙 scatteri를 측정하는 단계를 설명광 역학의 완전한 설명을 달성하기 위해 반사성 기판을 사용 NG 스펙트럼. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 정제 된 섬유가 얻어진다 적절한 실험 조건은 섬유 성 단백질의 재현성 측정 장소에 있는지 확인 것들이다. 그러나, 추출 절차는 섬유의 기계적 특성을 수정할 수 유념해야한다.

    기술의 수정은 microfocused 브릴 루앙 산란 및 매핑을위한 광학 현미경과 함께 커플 링 (13)에 접근 포함 보완 기술로 가능한 조합 (예를 들어, 라만 산란). 기술의 현재 응용 프로그램은 주로 적출 생물학적 물질에 초점을 맞추고있다,하지만 중요한 발전은, 예를 들면, 여러 VIPA 탈론 (14)에 따라 사람들은 이미 응용 프로그램의 범위 악마와 함께 침대 옆에 벤치 탑에서이 기술의 번역을 가능하게하는생체 내 응용 프로그램에서 잠재력을 포함하여 15, 16 strated. VIPA 접근 방식은 우리가 무엇을 설명에 대한 대안이다 이것은 빠른 획득 시간을 가지고 있지만, 이러한 여기 분석 것과 반드시​​ 불투명 한 시료의 경우에는 적절하지 않다. 그 콘트라스트 준 탄성 광을 거부하기에 충분하지 않기 때문에 또한, 반사성 기재의 사용은 VIPA에 탈론을 사용하여 셋업에서 실용적이지 않다. 스펙트럼 데이터 집합 및 재료의 본래 약한 산란 단면적의 인수 속도와 관련된 제한 동적 생물학적 시스템과 깊은 조직 내에서 데이터의 취득 프로그램을 제한 할 수 있지만, 기술적 인 개선은 현재의 성능이 개선 될 수있다.

    BLS는 세포 외 기질에 기초 생물 물리학 연구에 중요한 도구가 될 것을 약속함으로써 새로운 매트릭스 성장하는 동안 기계적 특성의 진화에 대한 통찰력과 병리학에서의 손실을 생산하는퇴화. 그러나, 측정은 비 침습적이며, 따라서 생체 내에서 수행 될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 실제로, 이것은 이미 각막 (16)에 달성 된 그러한 작업은 결합 조직 장애의 다양한 새로운 진단 도구의 개발을위한 플랫폼을 제공 할 수있다.

    초음파 탄성 영상 및 원자 힘 현미경 (AFM)는 마이크로 기계식 측정 대체 방법 있지만 BLS 기술은 AFM 달리, 전자 및 이상 (a 세포 내 규모)보다 공간 해상도를 제공 시험편에 기계적인 힘을 부과하지 않고 한정되지 않는다 오직 표면 특징의 분석. 거시적 인 균주에서 영의 계수는 MPa의 순서 (자세한 내용은 다른 곳에서보고됩니다)의 수 있습니다 동안 콜라겐과 엘라스틴의 브릴 루앙 계수는 GPa의 범위에 있습니다. 이 결과에 의해, 여기 주파수에 강한 의존성 차동 탄성률을 나타낸다섬유의 점탄성 거동. BLS는 의치 과학 문제 광범위한 물질에 적용 할 수있다. 그것은 생리학 및 생물 학적 조직의 병리에 대한 질문에 대답하는 데 도움이뿐만 아니라 분자 수준에서 물질과의 상호 작용의 기본적인 이해를위한 물리적 도구를 제공 할 수 있습니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C2905
    Tris Buffer Fluka 93358
    Sodium Acetate Fisher Scientific S608-500
    PBS Sigma-Aldrich P4417
    Sodium Azide Fisher Scientific S2002
    Streptomyces Hyaluronidase  Sigma-Aldrich H1136-1AMP
    Sodium Chloride Fisher Scientific S7653
    Trypsin Sigma-Aldrich T4665
    Sodium Phosphate Sigma-Aldrich S9638
    Sodium Hydroxide Fisher Scientific S320-500
    Pure Water Millipore ZRQS0P3WW Produced in-house
    Distilled Water Bibby Scientific Limited D4000 Produced in-house from water still
    Euthatal Merial  J01601A 
    Tandem Interferometer TFP-1 JRS Scientific Instruments
    Freezer Lec TU55144
    Refrigerator Zanussi ZBA15021SA
    Hot Plate Fisher Scientific SP88857206
    Clamps VWR 241-7311 & 241-7201
    Clamp Stand VWR  241-0093
    Thermometer Fisher Scientific 13-201-401
    Cling Film Sainsbury's 7650540
    Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
    Silicone IDB Technologies N/A No catalogue number. Order upon request.
    Cover Glass VWR 631-1571
    Conical Flask VWR 214-1175
    Beaker VWR 213-0469
    Measuring Cylinder VWR 612-3838
    Vial VWR 548-0051 & 548-0863
    Petri Dish VWR 391-0441
    Scalpel Swann Morton Ltd  0914 & 0308
    Diamond Scribe RS Instruments 394-217
    Soldering Iron RS Instruments 231-5332
    Fine Forceps VWR 232-0188
    Double Micro-Spatula VWR Various Sizes
    pH Meter Hanna Instruments HI-2210-02
    Orbital Shaker IKA  0002819000

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    References

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