En ny teknik för att generera och observera Chemiluminescence i en biologisk inställning

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Under de senaste decennierna har avbildningstekniker revolutionerat sättet att läkare diagnostisera och övervaka sjukdomar. Dessa avbildningstekniker har dock varit i stort sett begränsade till hela kroppen bildsystem, såsom positronemissionstomografi (PET), enkelfotonemission datortomografi (SPECT), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRT). Särskild uppmärksamhet har ägnats åt cancer, och tekniska avbildnings genombrott har förbättrats avsevärt det sätt som denna sjukdom diagnostiseras och behandlas. Trots dessa framsteg finns det ett ställe där dessa avbildningstekniker bara inte passar: operationssalen. Medan hela kroppen avbildningstekniker kan bidra till kirurgisk planering, de vanligtvis saknar upplösningar tillräckligt hög för att hjälpa läkare avgöra i realtid om alla tumörvävnaden har tagits bort eller kvarvarande tumörvävnad förblir gömd vid kirurgiska marginaler 1. Att se till att ingen infiltrativtumör marginaler kvar är en av de viktigaste kirurgiska mål och kirurger måste gå en lina mellan strikt och försiktig vävnads resektion. Om för mycket tas bort, är oönskade biverkningar för patienten förvärras; Om för lite är borttagna, är återfallsfrekvens ökade 2, 3. Därför är det viktigt att beskriva exakt tumör marginaler, och vi tror att kemiluminiscent intraoperativ avbildning kan bidra till att förbättra noggrannheten hos identifieringen av tumör marginaler genom att hjälpa kirurger att visualisera malign vävnad som annars skulle kunna förbli oupptäckta med etablerade tekniker.

Det finns många avbildningstekniker för närvarande utreds för deras möjliga användbarhet som intraoperativ bildsystem. Dessa inkluderar P- och γ-strålningsutsändande prober 4, optisk fluorescens 5, Ramanspektroskopi 6 >, 7, och Cherenkov luminiscens 8, 9. Hittills har dock ingen av dessa har etablerat sig som standard kliniska verktyg. Optisk fluorescens avbildning har hittills visat sig vara den mest lovande av dessa tekniker och är därför den mest utforskade. Även om det har redan visat sig vara ett värdefullt verktyg för många tillämpningar, är det inte utan sina begränsningar. I själva verket är dess främsta nackdelen bakgrundsfluorescens som alstras av inneboende autofluorescerande biologisk vävnad. Denna bakgrunds autofluorescerande signalen är en produkt av excitering av den omgivande vävnaden, förutom fluoroforen, av den externa ljuskällan krävs för genereringen av en fluorescerande signal. Ur ett praktiskt perspektiv kan denna autofluorescens potentiellt leda till låga signal-till-brusförhållanden, vilka kan begränsa användbarheten av denna teknologi i operationssalen.

Rektornnytta av kemiluminescens avbildning över fluorescens avbildning är att ingen excitationsljuset är nödvändigt. Som ett resultat finns det ingen bakgrund autofluorescens. I kemiluminescens avbildning, är exciteringsenergin istället genereras kemiskt. Denna process producerar ingen oavsiktlig bakgrundssignal och kan därför resultera i högre signal-till-brusförhållanden. Detta kan i slutändan leda till att mer exakt och korrekt diagnos av kirurgiska marginaler. Något överraskande har användbarheten av denna metod som en intraoperativ bildteknik förblivit outforskad 10. Faktum är att den närmaste exemplet på denna teknik är oxidationen av luminol genom myeloperoxidas hos möss 11, 12, 13. Kemiluminiscenta biomedicinsk avbildning är därför ett ganska outforskat område av forskning som kunde erbjuda följande fördelar: (1) minimal autofluorescens vilket resulterar i en låg bakgrundssignal med hiGher signal-brusförhållanden; (2) avstämbara våglängder av kemiluminiscenta utsläpp som sträcker sig från det synliga till det nära infraröda; och (3) funktionaliserbara kemiluminiscerande komplex som, i kombination med länkteknik och riktade biomolekyler som redan finns, ger tillgång till hela bibliotek av riktade molecular imaging sonder 14.

Detta proof-of-principle studie belyser den potentiella nyttan av kemiluminescent avbildning inom det biomedicinska inställningen med en rutenium-baserad bildanalysmedel. De kemiluminiscenta egenskaperna hos denna förening är väl studerade, med undersökningar som går tillbaka till mitten av 1960-talet 15. Vid kemisk aktivering, producerar agenten ljus vid omkring 600 nm 16, som är väl lämpad för medicinska avbildningsändamål. Aktiveringsenergin tillhandahålls av en redoxreaktion som leder till ett exciterat tillstånd-som har en livslängd på 650 ns i vatten 17 -follskyldig genom alstring av fotoner vid relaxation av detta exciterade tillstånd. Genom att använda en speciellt utformad fjärr nebulisator, kunde vi upptäcka föreningen både ex vivo och in vivo. Resultaten av initiala experiment är mycket lovande, vilket tyder på ytterligare utredning av denna teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Alla in vivo djurförsök beskrivna utfördes enligt ett godkänt protokoll och enligt de etiska riktlinjer Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Konstruktion av en dimmun Device

  1. Bifoga trä del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) upprätt i centrum av del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) med två skruvar (4 x 25 mm 2). Bifoga trä del C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) till mitten av del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) med hjälp av en skruv, så att en del C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) kan fortfarande förflyttas. Se figur 1.
  2. Borra två hål genom den nedre spetsen på sprayflaskan avtryckaren på en plast 3 oz mini spruta (D) och trycka på en stav av rostfritt stål (10 cm 1/16 "stål) (E) genom att bilda två slingor, en på vardera sidan av avtryckaren. Wrap den nedre delen av sprayflaskan med silvertejp (F) för att förhindra de buntband från att glida av. Fäst sprayflaska till trä del C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) med användning av de två plast buntband (28 cm) (G).
  3. Skär av 011 servomotor (I) och anslut den med lösa kablar servostyrning (H). Sedan fäster servomotorn till toppen av trä del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) med hjälp av tejp.
  4. Bifoga en penna (J) till servomotorn spaken med hjälp av gem (K). Tätt ansluta de yttersta delarna av pennan till stången loopar som använder plastöverdragna twist trådar (L) och säkra ändarna på pennan med silvertejp.
  5. Skär av servomotorstyrenhet magnetiska kabelkontakt (M) och sätt tillbaka den till högtalarkabeln (N). Sedan, tejpa servomotorn styrenheten trä del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Skär en w1 kabel med magnetiska kontakter i halv och bifoga en del den lösa änden av koppar speaker kabel (1 m). Anslut (magnetisk) i2 vippströmbrytare och p1 strömmen till tillgängliga w1 kabel och en 9V batteri.

2. Känslighet Fastställande av metod

  1. I en 1,5 ml mikrocentrifugrör, förbereda lösningar av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i omvänd osmos vatten (100 | il) i mängder av 260 ^ g (347 nmol), 52 pg (69 nmol), 26 pg (34 nmol) , 5 mikrogram (6,9 nmol), 3 pg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), och 3 ng (3,5 pmol).
  2. Blanda 100 | il av varje [Ru (bpy) 3] Cl2-lösning med 100 mikroliter av en vattenlösning av ammonium-ceriumnitrat ((NH4) 2 Ce (NO 3) 6) i vatten (25 mM) på ett objektglas.
  3. Ställ upp förvärvet i mareld läsaren genom att initiera bildprogram.
    1. Logga in på användarprofilen och leta efter tagsningskontrollpanelen. Klicka på "Initiera" och vänta tills instrumentet är redo.
    2. Leta efter "Imaging Mode" och se till att "Självlysande" och "fotograferar" kontrolleras och att "Fluorescent" är markerad.
    3. Förändring "Exposure Time" inställning för "Självlysande" till 20 sekunder. Ställ in resterande inställningar för "Självlysande" enligt följande: "Binning": Medium; "F / stop": en; och "Emission Filter": Öppna.
      OBS: exponeringstider kan behöva anpassas till instrumenteringen och experimentell inställning användas om skiljer sig från den presenterade installationen.
    4. För "fotograferar," använda följande inställningar: "Exposure Time": Auto; "Binning": Medium; och "F / stop": 8. Justera "Subject höjd" enligt avbildning target.Look för "Field of View" rullgardinsmenyn. Grundinställningen är "C." Ändra till "B" (14 cm avstånd mellan cAmera och provstadiet).
  4. Inrättat nebulisatorn genom att placera ett objektglas på ett ark av svart konstruktion papper på golvet av avbildningskammaren för att skydda den från oxidationsmedlet. Blanda en 100 μLdroplet av [Ru (bpy) 3] Cl2-lösning med 100 mikroliter av en vattenlösning av (NH4) 2 Ce (NO 3) 6. Observera den gröna rutan hårkorset.
    1. Placera bild föremål på den svarta konstruktion papper, så att området av intresse är i mitten av den gröna ljuslåda hårkors visas på provstadiet. Förbered nebulisatorn genom att ta loss plast sprayflaska från trä stöd. Fyll en lösning av trietylamin (1: 3 i vatten / etanol) in i dess plastiska reservoar och sätta tillbaka den till trä stöd.
    2. Placera nebulisatorn inuti mareld läsaren och se till att strömkabeln är bortkopplad från nebulisatorn sladden. Se till att strömbrytarenär på, är den vippströmbrytare bort, och den röda lysdioden är tänd Placera nebulisatorn så att sprayflödet är riktat mot området av intresse på bild ämne, och samtidigt minimera utsikten obstruktion från kameran mot avbildnings ämnet genom spray munstyckshuvudet.
    3. Placera små, svarta bitar av konstruktion papper över eventuella hot spots (t.ex. vita märken på mikroskopiska diabilder eller injektionsställen) för att skydda dem från spray. Placera minst 40 cm nebulisatorn fjärr sladd inuti avbildning kammaren, så att den inte stör bild ämne, nebulisatorn, eller magnetiska dörrlås. Stäng bildsystem dörren.
      OBS: hårkors kommer att ändra storlek baseras på "Field of View" -inställningen i "Living Image;" se till att detta är satt till "B".
  5. Förvärva en bild genom att initiera bildsekvensen. Klicka på "Hämta" i "Förvärv Kontrollpanelen". På den första avbildnings SEQUhet, aktivera spara automatiskt om så önskas (rekommenderas) och välj en datamapp. Ignorera "Redigera Imaging etiketter" dialog fram till slutet av sekvensen.
    OBS: Styr programvara visar instrumentets agerande steg-för-steg i realtid. Efter beredning av mätning och förflyttning av provstadiet till rätt position, öppnar den kamerans slutare och räknar mättiden. Slutar öppning kan också höras av ett klickljud som genereras av maskinen.
  6. Som slutaren öppnas, spraya tre skurar av en lösning av trietylamin (1: 3 i vatten / etanol, 0,24 ± 0,04 ml per sprej burst) genom att växla vippkontakten tre gånger för att generera kemiluminescens.
    OBS: Prov skede kommer att flytta under mätningen. Lämna tillräckligt (minst 40 cm) kabel inuti instrumentet för att möjliggöra detta. Se till att den lösning som skall sprutas av nebulisatorn kan strävat av stigande röret och att det inte finns några luftbubblor i röret. Har flera reserv batteries för nebulisator redo ifall det behövs.

3. In vivo Imaging efter systemisk intravenös injektion

  1. I en 1,5 ml mikrocentrifugrör, förbereda 100 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning innehållande mellan 8 och 33 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl2. Framställa en vattenhaltig lösning av (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i vatten (25 mM) vid samma tidpunkt.
  2. Intravenöst injicera 100 | il av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i svansvenen hos friska möss (n = 5).
  3. Euthanize möss 10 min efter injektion via CO 2 kvävning.
    1. Ta bort huden med en Y-snitt från bålen, sedan bort kust båge i en U-form för att exponera hjärtat och lungorna. BEGJUTA mössen genom att skära ett utlopp i det högra förmaket och att injicera 20 ml av PBS genom en 24 gauge nål i den vänstra ventrikeln 18. Skär försiktigt genom magenhuden och exponera njuren och levern. Skär i längdled genom organen för att skapa en synlig snitt.
  4. Ställ in förvärvet som beskrivs i steg 2,3-2,6, med följande ändringar.
    1. Efter noggrann tvättning nebulisatorn plastbehållaren, fyll den med en lösning av (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 i vatten (25 mM) i stället för trietylamin.
      OBS: Det är viktigt att noggrant skölja nebulisatorn munstycket efter varje användning, eftersom kristallise (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kan förstöra sprutmunstycket efter flera användningsområden.
  5. Använd hela djuret eller organprov för avbildning.
    1. För hela buken bildbehandling, placera musen stommen med öppen buk är vänd mot kameran och huvudet pekar på baksidan av instrumentet. Centrera den kroppsdel som skall avbildas (t.ex. lever eller njure) i den gröna ljuslåda hårkors.
    2. Feller enskilt organ avbildning och kvantifiering, ta bort musen från bild instrument och stift ner. Utgående från den redan öppnade kroppshålighet, skära ut de inre organen (t ex njure, lever, lunga, muskel, mjälte, hjärna och hjärta). Skär genom bakbenet huden att skära muskelvävnad. Öppna försiktigt skallen med en skalpell för att skära hjärnan.
      1. Om orgeln av intresse är lever, njure eller mjälte, klippa alla organ i halv längdled, placera varje organ på en petriskål eller bit svart konstruktion papper.
    3. Följ anvisningarna i steg 2,3-2,6 för att fastställa den relativa utsläppen av kemiluminiscenten spårämne för enskilda organ.

4. In vivo-avbildning av lymfkörtlar

  1. Förbered 10 mikroliter av en PBS-lösning innehållande 80 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl2. Framställa en vattenhaltig lösning av (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i water (25 mM) vid samma tidpunkt.
  2. Injicera 10 mikroliter av lösningen subdermalt i baktassen hos friska möss (n = 5). Som en negativ kontroll, injicera den kontralaterala tassen med 10 mikroliter av ren PBS. Offra mössen via CO 2 kvävning 15 min efter injektionen. Ta bort huden på båda bakbenen för att exponera lymfkörtlar kanalerna upp till knävecken lymfkörtlar.
  3. Inrättat förvärvet såsom beskrivs i steg 3,4.
  4. Ta bort knävecken lymfkörtlar från båda bakbenen, halvera dem och spraya dem med oxidationsmedel i en petriskål, som beskrivits tidigare (steg 3.5.3), i syfte att kvantifiera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nebulisatorn system som beskrivs i protokollenheten 1 kan konstrueras från lätt tillgängliga material till en låg kostnad. Det är avsett att vara en infälld för fjärrutlöst sprutning av reduktions / oxidationsmedlet inuti en bioluminescent läsare (Figur 1). Vår design möjliggör säker drift av nebulisatorn i mareld läsaren 14 cm avstånd från linsen. Ingen imma eller suddig linsen observerades under operationen. Vi valde den kommersiellt tillgängliga kemiluminiscent medel [Ru (bpy) 3] Cl 2 för utvecklingen av vår metod baserad på det låga priset, stabilitet i vattenlösning, väl beskrivna redox beteende, och kemiluminiscenta egenskaper (Figur 2) 19. Den minimala detekterbara signalen kan bestämmas såsom beskrivs i protokollenheten 2 genom att oxidera en droppe av [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 | il, 6,9 pmol- 347 nmol i H2O) med (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 mikroliter, 25 mM) på ett objektglas. Sedan, genom att använda nebulisatorn och påsprutning av en lösning av trietylamin (1: 3 i vatten / etanol), är den kemiluminiscenta signalen utlöses. I vårt fall var det minsta detekterbar signal bestämdes till 6,9 pmol / cm 2 (Figur 3). Det är tänkbart, men att en optimerad reaktionsförhållanden, kamera känslighet, slutartider, volymer och reagenskoncentrationer kan leda till ännu lägre detekteringströsklar. Dessa reaktionsbetingelser kan också användas för att utforska och testa kemiluminescensen hos varje given kombination av metallkomplex, oxidationsmedel och reduktionsmedel.

Att flytta till in vivo experiment i i protokoll avsnitten 3 och 4, kvinnliga naken (utavlat) möss 5-6 veckor gamla och NU / J-hanmöss 6-8 veckor gamla användes. För intravenösa injektioner, mängder av8-33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl2 i 100 mikroliter av PBS per mus (n = 5) valdes. Djuren avlivades 10 min efter injektion, och bukhålan exponerades. Mössen placerades i bioluminescent läsaren med nebulisatorn pekar mot vävnaden av intresse (Figur 4). För avbildning med intravenöst injicerad [Ru (bpy) 3] Cl 2, den kemiluminiscenta signalen detekterades huvudsakligen i njurarna, vilket starkt antyder renal elimination av den hydrofila liten molekyl (Figur 5). Signal-brus-förhållanden för möss injicerade med [Ru (bpy) 3] Cl 2 mot PBS var 27/1 för njuren och 21/1 för levern. För lymfkörtel avbildning, 80 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i 10 | il av PBS injicerades subdermalt i den bakre trampdynan hos möss (n = 5). Mössen avlivades 15 min efter injektion av CO2-kvävning. Huden som täcker både inre bakben was avlägsnas för att exponera muskler, lymfkörtlar och lymfkärl. Efterföljande kemiluminiscerande visualisering av popliteala lymfkörtlarna ledde till observationen att lymfkörtlar som innehåller [Ru (bpy) 3] 2+ visar en 10 ± 4,3 gånger högre radians än obehandlade (167000 p / (s x cm 2 × sr) och 17.000 p / (s x cm 2 × sr), P <0,028) (Figur 6).

Figur 1
Figur 1: Fotografera av nebulisator. Delar som används: trästruktur delar (A, B, C), sprayflaska (D), böjda stålstav (E), tejp (F), plast buntband (G), 011 servoanslutningsdelen (H), servomotor (I), penna ( J) som innehas av böjt gem (K), plastöverdragna metallklämmor (L) w1 tråd kontakten (M) och högtalarkabeln (N) som leder till batteriet. Denna siffra är baserad på forskning publicerades ursprungligen i refrens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Egenskaper hos [Ru (bpy) 3] 2+. Struktur (A) och excitations- och emissionsspektra (B) av [Ru (bpy) 3] 2+. Oxidation / reduktion baserad kemiluminiscent katalytisk cykel (C). Denna siffra är baserad på forskning publicerades ursprungligen i referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3: Detektions Threshold av [Ru (bpy) 3] 2+. Representativa signalintensiteterna vid olika koncentrationer av [Ru (bpy) 3] 2+ på ett objektglas (A). Avbildningssignalen kvantifiering med tröskeldetektering (röd streckad linje) och bakgrund (svart streckad linje) (B). Denna siffra är baserad på forskning publicerades ursprungligen i referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: kemiluminescens Imaging. Schematisk ritning av en mus och en nebulisator placerad i bioluminescens läsaren (A g>) och schematisk ritning (B) av nebulisatorn sprutning på en mus. Denna siffra är baserad på forskning publicerades ursprungligen i referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Detektion av [Ru (bpy) 3] 2+ efter systemisk administrering. Vitt ljus, kemiluminescens, och overlay (från vänster till höger). Bilder av en mus kroppshålighet som injicerats med 33 nmol av [Ru (bpy) 3] 2+ och sprayades med (NH4) 2 Ce (NO 3) 6. De vita pilen pekar mot höger njure. Denna siffra är baserad på forskning publicerades ursprungligen i referens 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Detektion av [Ru (bpy) 3] 2+ efter subdermal administration. Poplietallymfknutor lymfkörtel avbildning som visar vitt ljus, kemiluminescens och sammansatta bilder för möss injicerade med [Ru (bpy) 3] 2+ (överst) och PBS (botten) i bakbenen; 80 nmol i 10 | il av PBS, avbildas 15 min efter injektion (A). Vitt ljus och sammansatta bilder för [Ru (bpy) 3] 2+ (överst) och PBS (botten) -behandlade skars knävecken lymfkörtlar (B). Kvantifiering av kemiluminiscenta signaler för PBS och [Ru (bpy) 3] 2+-behandlade lymfkörtlar (C) .Den data representerar medelvärdet ± SD. Denna siffra är baserad på forskning som från börjanpublicerad inreference 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här har vi presenterat en teknik som är i stånd att optiskt delineating vävnad via emission av fotoner som skapats av en kemiluminescent reporter. I motsats till andra, mer etablerade, teknik 4, 5, 6, 7, 8, 9, här kemiluminescerande reportersystem utnyttjar en avbildningssonden som är icke-radioaktiv och underlättar detektering vid mycket höga känslighetsnivåer. Kanske ännu viktigare, inte kemiluminiscens avbildning kräver inte en infallande ljuskällan (som i optisk fluorescens avbildning) 20, ett drag som minimerar autofluorescens och drastiskt minskar bakgrundssignaler.

Rutenium reporter [Ru (bpy) 3] Cl 2 har en in vivo toxicitet tolereras för avbildningsändamål (intraperitoneal mus LD 50: 20 mg / kg) 21, är vattenlösliga (upp till 8 mm), och är stabil i blodet. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos metallkomplex är väl karaktäriserade och har redan undersökts för den fotodynamiska terapin av cancer 22, 23. Oxidationsmedlet (NH4) 2 Ce (NO3) 6 har rapporterats ha mycket låg toxicitet (oral råtta LD50 1600-3200 mg / kg) 24 och är löslig i vatten vid koncentrationer av upp till 2,57 M vid 20 ° C 25. I den här artikeln, är en visuell demonstration samt textbaserad vägledning för byggandet av en fjärrmanövrerad finfördelning enhet presenteras. Dessutom ger vi robusta protokoll för att utföra kemiluminiscens avbildning i en standard mareld avbildningsanordning. Vi illustrerar användningen av [Ru (bpy) 3] Cl 2 för visualizatipå av vävnader efter både intravenös och subdermala injektioner i möss.

Men som med alla andra begynnande bildteknik, det finns utrymme för förbättringar av våra protokoll. Vi tror att denna proof-of-principle studie kan sporra utvecklingen av flera kemiluminescens ansökningar om levande system. Följande punkter skulle kunna åtgärdas för att ytterligare förbättra tekniken och utvidga dess omfattning.

En mindre andra generation av fjärrigångsprutanordningar skulle tillåta provet att komma närmare till kameran, därmed förbättra spatial upplösning. Förbättrad optisk utrustning kan ytterligare förbättra gränserna för metoden detektions. Protokollet kan också utökas till avbildning levande djur. Exakt styrning av vridmomentet (genom ström och spänning) skulle tillåta en mer exakt styrning av volymen av reagens släpps med varje spray. Det är viktigt att hålla nebulisatorn väl underhållna. Inte skölja nebulisatorn kan förstöra nozzle. En färsk batteri är avgörande för ett korrekt utförande av nebulisatorn. Men alla de material som används för nebulisatorn är billiga och lätt kommersiellt tillgängliga. Efter etablerade syntetiska protokoll, den [Ru (bpy) 3] 2+ komplex kan enkelt modifieras med olika linkers, inklusive maleimider 26, aminer 27 och NHS-estrar 28, 29. Detta skulle göra det möjligt biokonjugering till små molekyler, peptider eller antikroppar, och skulle därmed underlätta specifik molekylär inriktning 30, 31, 32, 33. I slutändan kan riktad sond leverans möjliggöra för kirurgen att identifiera små skador och att noggrant beskriva kirurgiska marginaler i operationssalen med mycket hög specificitet. Också, inkapsling av den mycket vattenlösliga [Ru (bpy) 3] 2+ i nanomaterial, både riktade och oriktade-kan också möjliggöra visualisering av lesioner medan de tas bort kirurgiskt 34, 35, 36. Slutligen, modifiera koordinationssfären av metallkomplexet reporter och / eller ändra övergångsmetallcentret själv representerar attraktiva vägar att modulera och finjustera emissionsvåglängder inom det synliga och NIR varierar 37, 38.

Intraoperativ kemiluminescens avbildning behöver en kemiluminiscent reporter och i vårt fall, ett oxidationsmedel, som endast kan användas inom ramen för deras giftighet och löslighet. Vävnadsmembran kan representera en barriär för diffusion av oxidationsmedlet in i vävnaden, och därmed signalgenerering. Eftersom den kemiluminescerande reportern är bara genererar en foton per cykel, är den genererade signalen ganska svag.Omgivande ljus i operationssalen måste därför hindras från att komma in i kameran medan tekniken används. Detta skulle kunna göras ICI särskilt intressant för utveckling av laparoskopiska tillämpningar, där omgivande ljus är naturligtvis uteslutna.

Vi hoppas att denna metod kan bli ett värdefullt verktyg för kirurger i operationssalen. Frånvaron av radioaktivitet är till nytta för patienten och operationsteamet både och gör färre säkerhetsåtgärder som krävs, eventuellt göra denna teknik i ett mer attraktivt alternativ.

En väl fungerande nebulisatorn och dess placering spelar en avgörande roll för att få goda resultat. Suboptimala vinklar och områden kan bidra till signal varians. Styrkabeln måste sättas in genom dörren med omsorg, och tillräckligt med kabel måste förbli inuti mareld läsaren så att det inte är trångt eller rivs av.

Ytterst chemiluminescence avbildning är en mycket attraktiv ny metod för molekylär avbildning. Den är baserad på en grund av väletablerade kemi, sysselsätter billiga och lättillgängliga material, och undviker både strålning och exciteringsljuskällor. Som ett resultat, vi är både hoppfulla och övertygade om att i framtiden kan kemiluminescens avbildning ha en stor inverkan på den kirurgiska behandlingen av sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics