에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여 * These authors contributed equally

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Cancer Research

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Summary

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

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Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

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Abstract

약물 내성은 혈액 학적 악성 종양 및 고형 종양 모두 암의 치료에서 주요 문제로 남아있다. 극한 후천적 내성이 증가 된 약제를 포함 제거 메커니즘들에 의해 야기 될 수 있고, 약물 흡수, 불 활성화 약물 및 약물 표적의 변경을 감소시켰다. 최근 데이터는 다른 이상이 잘 알려진 유전자 (돌연변이, 증폭) 및 후생 유전 학적 (DNA 메틸화, 히스톤 번역 후 변형) 개조로, 약제 내성 메커니즘도 스 플라이 싱 수차에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 계획하기 위해 미래의 관심을받을 자격이 조사 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사 대상으로합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열 및 설정을 통해 체외 모델에서 여러 가지의 transcriptomic 프로필을 분석에드 QRT-PCR 기반의 방법은 후보 유전자의 유효성을 검사합니다. 특히, 우리는 DDX5와 PKM 성적 증명서의 차동 스 플라이 싱을 평가 하였다. 계산 도구 매트에 의해 검출 된 비정상적인 스 플라이 싱은 다른 DDX5 스플 라이스 변종은 부모의 대 내성 세포에서 발현되는 것을 보여주는, 백혈병 세포에서 확인되었다. 이러한 세포에서는,도 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 메커니즘을 제안 부모 Panc-1 세포에 비해 Panc-1 타빈 강한 상대 검출되지 않았다 높은 PKM2 / PKM1 비를 관찰 하였다.

Introduction

암 치료, 화학 요법에 대한 종양 세포의 내성 중 진성 또는 장기간 약물 노출시 획득 상당한 발전에도 불구하고, 백혈병 및 고형 종양 1 광범위한 치료 실패의 주요 원인이다.

시험관 세포주 모델 약물 내성의 기초가되는 메커니즘을 묘사하기 위해 화학 요법 제에 내성 암세포의 선택에 의해 단계적으로 개발된다. 이 절차는 임상에서 사용 된 체제를 모방하고, 따라서 적절한 저항 메커니즘 깊이 조사를 허용한다. 치료 후에도 내성 세포를 세포 생존력 / 세포 독성 분석 (2)를 사용하여 부모 감수성 세포와 구별된다. 일차 세포의 시험 관내 약물 내성 프로파일 화학 요법에 대한 임상 적 반응 (3)에 크게 관련이있는 것으로 밝혀졌다.

높은 처리량 cytotoxicity 분석법은 시험관 내에서 약물의 감도를 결정하는 편리한 방법을 구성한다. 여기서, 세포의 생존 능력에 의해 평가되어 예를 들면, 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 - 특정 기판의 대사 전환 (에 기초 MTT 분석법 4, 따라서 세포의 미토콘드리아 활성을 반영 컬러 제품에 테트라 졸륨 염). 대안 적으로, 세포의 단백질 함량은에 sulforhodamine B (SRB) 검정을 이용하여 5 정량화 할 수있다. 여기서, 생존 세포의 수의 필요없이, 분광 광도계에 적합한 파장에서 측정 된 광학 밀도 (OD)에 비례 광범위하고 시간이 걸리는 셀 카운팅 절차. 소정의 화학 요법 약물에 의해 유도되는 성장 억제는 세포가 시험 제제로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하고있는 웰의 OD에 기초하여 계산 될 수있다. 용량 - 반응 곡선이다 obta세포를 제어 할 상대 생존 세포의 비율에 비해 약물 농도를 플로팅 리트에 의해. 마지막으로, 약물 감수성은 미처리 세포 (IC 50)에 비하여 세포 성장의 50 % 저해를 초래 농도로서보고 될 수있다.

약제 내성의 기초가되는 메카니즘은 약물 활성 및 세포 대사의 결정 인자의 유전자 발현에 영향을 미치는 변경 등 여러 가지 이상을 포함한다. 돌연변이, 수차 전사에서와 전사 후 수준뿐만 아니라 방해 후생 유전 학적 조절을 포함하여이 분자 병변은 종종 약물 대사 또는 세포 사멸 6 중 관련된 유전자에 영향을 미칩니다.

대체 사전 mRNA의 접합과 복잡한 규제는 최근 암 세포 (7)의 약물 내성을 지시 할 수있는 새로운 개체로 주목을 받았다. 인간 유전자의 95 %까지 이러한 대안의 수단에 의해 정상 세포에 접합되고동일한 유전자에서 다양한 단백질 이소 형을 생성 단단히 조절 방법. 대체 접합은 종종 암에 규제가 완화되고, 여러 종양은 약물 대사 (즉, 데 옥시 시티 딘 키나제, folylpolyglutamate 합성, 또는 다제 내성 단백질) 6,8에 관여하는 유전자의 증가의 변형 접합을 특징으로한다. 그러나, 약제 내성 세포의 접합 프로파일의 포괄적 인 분석을 고통스럽게 부족하다. 따라서, 대안적인 스 플라이 싱 분석을위한 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될.

지난 10 년간 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 급속한 발전은 유전자 발현의 조절 및 다양한 생물학적 과정 (9)에서 자신의 역할을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력과 생물 의학 연구를 강화하고있다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 강력한 서브 프로그램이고transcriptomics의 분야에서 NGS의. 그것은의 miRNA, siRNA를, 및 기타 소형 RNA를 (정량적)을 동시에 수천 개의 유전자의 발현 패턴의 게놈 전체의 프로파일 링을 허용하고도 새로운 코딩의 mRNA의 특성에 적합 아니라 긴 비 코딩 RNA이다 클래스 (예를 들어, snRNA와 피르) 10, 11.

RNA-SEQ 사체는 특성 (예를 들면, 생거 시퀀싱 및 발현 마이크로 어레이)에 대한 이전의 기술에 비해 많은 장점을 갖는다. 그것은 기존의 게놈 주석에 기초하지 않고, 그 해상도의 단일 뉴클레오티드 레벨을 가지며 그 발현 량 추정을위한 넓은 동적 범위를 갖는다. 간단히, RNA-SEQ 실험의 기본 실험 워크 플로우의 cDNA 라이브러리 건설 그리고 마지막으로, 대규모 병렬 깊은 시퀀싱 (12, 13)로 변환 한 다음 폴리아 데 닐화 성적 증명서 (mRNA를) 선택과 분열로 구성되어 있습니다. 때문에 sequencin의 급격한 하락지난 몇 년 동안, RNA-SEQ 위에 g 비용이 점차 다른 기술을 대체하고, 상당한 노력은 라이브러리 제조 프로토콜을 향상시키기 위해 이루어지고있다. 예를 들어, 옥시 우리 딘 트리 포스페이트 (dUTP를)하고, 이전의 PCR로 증폭, 우라실-DNA-glycosilase (UDG)로 표시 가닥을 소화와 두 번째 가닥 cDNA를 표시하여 mRNA의 성적 증명서의 가닥 정보를 유지하는 것이 가능하다. 이 프로세스는 발현 14,15 유전자 주석 및 추정의 정확도를 향상시킨다.

분석 및 RNA-서열 데이터의 해석은 생물 정보학 파이프 라인 16, 17 내에서 복잡하고 강력한 계산 소프트웨어 패키지 및 처리가 필요합니다. 우선, 원료는 엄격한 품질 기준에 도달하지 않는 서열을 기술 및 생물 인공물을 제거하고 폐기 (트리밍)에서 품질 관리를 거쳐 판독한다. 이어서,이 기준 게놈 맵핑 및 각 인덱싱 된 샘플 읽기유전자 수준, 엑손 수준, 또는 성적 증명서 수준에 순서대로 각 카테고리의 풍요 로움을 확인합니다. 애플리케이션에 따라, 정제 된 데이터는 대립 유전자 - 특이 적 발현, 대체 접합 유전자 융합체 및 단일 염기 다형성 (SNP가) (12)의 식별을위한 통계 모델을 통해 계산된다. 마지막으로, 선택된 레벨 (즉, 유전자 발현 또는 대체 스 플라이 싱) 차등 분석은 다양한 조건 하에서 얻어진 샘플과 비교하기 위해 사용될 수있다.

차동 접합 분석은 두 샘플 사이의 스플 라이스 사이트 사용의 차이를 설명합니다. 이 목적에 전념 소프트웨어 패키지의 증가는 다른 통계 모델, 성능 및 사용자 인터페이스 (18)에 따라 사용할 수 있습니다. 이 중, 매트 (성적 증명서 접합의 다변량 분석) 베이지안 통계 프레임 워크를 기반으로 자유롭게 사용할 수 있으며 정확한 계산 도구로 나온다과 diffe를 감지하도록 설계단일 또는 쌍으로 최종 RNA-서열 데이터 중 하나에서 rential 접합 이벤트. 정렬 (.bam) 파일에서 시작, 매트 대체 접합 이벤트의 모든 주요 유형을 검색 할 수 있습니다 (엑손 스키핑, 대안 3 '스플 라이스 사이트, 다른 5'스플 라이스 사이트, 상호 배타적 인 엑손과 인트론 보존 - 또한 그림 1 참조).

첫째, 소프트웨어 식별 인스턴스 엑손 스킵, 특정 스플 라이스 이벤트를 지원하는 판독하고, 두 종류로 분류한다. 조사 된 엑손 내에서지도 및 특정 엑손 두 업스트림 및 다운 스트림 측면 엑손 사이의 접합에 걸쳐 (정식 스플 라이스 이벤트) "에 포함될 읽습니다". 두 측면 엑손 간의 접합부에 걸쳐 (대체 접합 이벤트) "스킵 읽기". 그 후, 매트는 모두 정규 및 대체 이벤트에 대한 정규화 된 포함 수준을 반환하고 샘플 또는 조건 사이의 값을 비교합니다. 궁극적으로는 P-값 a를 계산ND 잘못된 탐색 비율 (FDR)은 두 상태 사이의 유전자 변형 비의 차이는 각각의 스 플라이 싱 19,34 이벤트에 대해 주어진 사용자 정의 임계 값을 초과한다고 가정.

RNA-SEQ와 함께 차동 플라이 싱 분석에 따라, 광범위한 실험적인 검증이 참 양성 유전자 후보 (18)를 식별하기 위해 보장된다. 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)은 RNA 서열 분석-20에서 얻은 후보 확인에 가장 일반적으로 사용되는 최적의 방법이다. 본 연구의 목적은 고형 종양과 혈액 악성 종양의 약물 내성 관련 접합 프로파일을 조사 할 수있는 강력한 방법을 제공하는 것이다. 우리의 방법은 약제 내성에 관여 후보 유전자의 확인을 위해 설립 QRT-PCR 방법과 조합하여 약제 내성 암 선택된 세포주 모델 RNA-SEQ 기반 사체 프로파일을 이용한다.

(21, 22)와 메토트렉세이트 (MTX) 모성 서브 라인 CEM / R30dm 23. GC를하고 MTX에 기초하여 현재 요법의 경우 약 90 %가 임상적인 이점을 수립했지만, GC 저항의 출현은 아직 불분명 분자 메커니즘 미해결 문제를 나타낸다. GC 강한 서브 클론을 분리, CEM-WT 세포는 2 ~ 3 주 동안 1 μM의 덱사메타손 (덱스)에서 배양 하였다. MTX 내성 서브 라인 CEM / R30dm 반복 단기 (24 시간) 임상 프로토콜의 모방으로 30 μM MTX에 CEM-WT 세포의 노출을 통해 개발되었다. 흥미롭게도,이 세포주는 또한기구가 완전히 이해되지 않은 덱스에 교차 내성 (미공개 결과)을 표시.

고체 다치또는 본 연구에서 조사 모델은 화학 요법과의 특별한 불응 악명 췌장 도관 선암이다. 이를 위해 Panc-1 세포주 및 약물 (24)의 1 μM 연속 배양에 의해 얻어진 그 타빈 내성 서브 클론 Panc-1R를 선택했다. 여기에서는 세 개의 프로토콜을 결합하여 체외 약물 내성 근본적인 새로운 메커니즘을 발견하는 방법을 설명합니다 비색 독성 분석법에 관련된 신규 스플 라이스 변이체를 식별 백혈병 세포 및 고형 종양, RNA-SEQ 기반 파이프 라인에서 암 세포에 약물 감수성을 평가 약물 감도 / 저항과 RT-PCR 및 QRT-PCR 분석은 잠재적 인 후보의 유효성을 검사합니다.

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Protocol

세포 독성 시험 법을 통해 약물 저항 프로필 1. 특성

  1. 백혈병 세포주 배양
    1. 부모의 T 세포를 포함하는 10 ml의 RPMI-1640 배지에서 25cm 2 ALL 세포주 CCRF-CEM (CEM-WT)과 CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3를 포함한 약제 내성 서브 라인을 유지 2.3 μM 엽산 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충.
    2. 배양을 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 가습 된 분위기에서 셀.
    3. 3 × 10 6 세포 / ㎖ - 2 사이의 농도로 세포 성장을 할 수 있습니다.
    4. 0.3 × 106 세포 / mL의 초기 농도로 일주일에 두 번 세포를 분할 (예를 들면, 세포 농도는 3 × 106 세포 / ㎖, 9 ㎖의에게 새로운 배지를 함유하는 새 플라스크에 전사 1 ml의 세포 현탁액을 경우). 20 연속 구절 후 문화를 폐기하십시오.
    췌장 암 세포 라인 문화
    참고 : 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 고 글루코스 및 L- 글루타민 10 mL의 DMEM 배지에서 75cm이 배양 플라스크에서 인간 췌장암 세포주 Panc-1을 유지 . 약물 내성 변종 Panc-1R은 멸균 수에 용해하고 1 μM 타빈을 함유하는 동일한 배지에서 배양한다. 더 자세한 사항은 (24)에 제공된다.
    1. 배양을 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포.
    2. 세포가 약 90 % 합류점에 도달 할 때 5 : 1의 비율로 3 일 - 각 2 셀을 분할.
    3. 세포 분열, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세척이 75cm 배양 플라스크 당 트립신 / EDTA 1 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    4. 9 ml의 매체를 추가하고 15 ML 튜브에서 분리 된 세포를 수확. 새로운 플라스크의 접점에서 씨앗이 ML의 세포 현탁액ining 8 ml의 매체. 20 연속 구절 후 문화를 폐기하십시오.
  2. 백혈병 세포에 대한 MTT 분석
    1. 사전에 MTT 솔루션을 준비 : 약 1 시간 동안 자석 교반기 500 10 ml의 PBS에서 MTT의 포르 마잔 mg의과 (빛으로부터 보호) 저어 녹인다. 0.22 μm의 필터 솔루션을 소독. 주 : 상기 용액을 -20 ℃에서 10 ml의 분취 량으로 저장 될 수있다. 해동 후 직접 빛으로부터 보호합니다.
    2. 사전에 산성화 이소프로판올을 준비 : 이소프로판올 2.5 L 2 M 염산 50 ㎖를 추가합니다. 주 : 사용 전 실온에서 1 개월 이상에 대한 해결책을 보관. 이소프로판올 올바르게 산성화되지 않는 경우, 상기 매체와 석출물을 형성하고, 분광 광도계 판독을 손상 것이다.
    3. 셀 라인 당 3 ~ 6 우물을 바치고 성장의 30 μl를 추가 별도의 96 웰 평평한 바닥 준비 "날 0"(제어) 판은 성장 억제의보다 정확한 추정을 보장하기 위해중간 공백 (NO 세포)에 해당하는 우물에 성장 매체의 각 웰에 150 μL 당 세포 현탁액 (8,000 세포)의 120 μL. 광학 밀도 (OD)를 측정하기 위해이 섹션의 1.3.13 단계로 단계 1.3.9에서 진행합니다. 참고 : 더 자세한 사항은 4 제공됩니다.
    4. (약물 농도 30 웰 (10 농도, 세중의 각), 세포를 제어하는 ​​10 우물과 세포 (공백)없이 매체를 제어하는 ​​10 우물을 할애하고 덱사메타손의 약물 희석 범위를 제조 : 96 웰 평평한 바닥 실험 판을 준비 용매로서 디메틸 설폭 사이드를 이용하여 덱스).
      주 : CEM-WT 전지용 덱스 희석 범위는 2 μM 및 0.97 nM의 사이이다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 세포의 경우 덱스 희석 범위는 640 μM 및 0.33 nm의 사이에있다.
    5. 96 웰 플레이트의 적절한 우물에 각 덱스 희석 30 μl를 추가합니다. 세중의 각 농도를 포함해야합니다.
    6. 성장 매체의 30 μL에 추가 잘세포들과 공백에 대응하는 웰 배양 배지 150 μl를 제어하기 위해 대응.
    7. 수확은 기하 급수적으로 최적의 시딩 농도에서 세포에 resuspend 성장.
      주 : 최적 출발 세포 농도를 결정하기 위하여, 여러 농도의 세포를 파종 및 적어도 4 일 동안 매일 측정하여 96- 웰 플레이트에서 각각의 세포주 세포주의 성장 프로파일을 평가하는 것을 권장한다. 이것은 OD 값을 포화하여 실험 영향 바와 같이, 72 시간 후에 세포의 과증식을 방지 시드 농도를 선택. CEM / R30dm 것이 / 웰의 세포를 5000 동안 CEM-WT, CEM-C5 및 CEM-R5에 대한 최적의 시딩 농도를 8,000 세포 / 웰이다.
    8. 각 웰을 함유하는 약액 있거나, 성장 배지에 세포 현탁액 120 μl를 추가 (웰 세포 제어에 상당). 접시에 좋은 습도를 보장하고 일을 배양 150 μl의 PBS와 함께 접시의 빈 외부 우물을 채우기세포 배양 인큐베이터에서 5 % CO 2와 37 ° C에서 72 시간 동안 전자 판.
    9. 각 웰에 MTT 용액 15 μl를 추가 / 분 900 쉐이크의 최대 판 흔드는 최대 5 분 동안 접시를 흔들.
    10. 세포 배양 인큐베이터에 다시 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 놓고 다른 4 부화 - 6 시간.
    11. 물론 각각에 산성화 이소프로판올 150 μl를 추가하고 철저하게 모든 포르 마잔 결정을 재현 탁하는 멀티 채널 피펫과 잘 섞는다. 빈 우물 시작하고 잘 접시의 다른 행에 진행하기 전에 팁을 씻어해야합니다.
    12. 10 분 동안 실온 (RT)에서 플레이트를 인큐베이션.
    13. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 배경 OD를 보정하여 정확한 측정을 보장하기 위해 540 및 720 nm에서의 OD를 결정한다. 그런 다음 스프레드 시트 파일에 데이터를 저장하고 4를 분석 할 수 있습니다.
  3. SRB 분석 췌장 암 세포에 대한
    1. 0.4 %의 최종 농도 1 % 아세트산에 SRB 시약을 용해 (W / V).
    2. 50 %의 최종 농도로 초순수에 트리클로로 아세트산 (TCA)을 용해시키고 (W / V).
    3. 10 mm의 최종 농도로 초순수에 트리스 (히드 록시 메틸) -aminomethane을 녹인다.
    4. 적절한 시드 농도로 100 ㎕의 매체에 지수 상에 성장하는 세포와 씨앗 (6) 우물 만 우물에 해당하는 100 ㎕의 매체를 추가 성장 억제의보다 정확한 추정을 보장하기 위해 별도의 96 웰 평평한 바닥 "0 일"제어 판을 준비 공백. 플레이트에 세포의 적절한 접착을 보장하기 위해, 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션. 모든 웰에 100 ㎕의 매체를 추가하고 단계 1.4.8로 진행 -이 절의 1.4.16.
    5. 96 웰 평평한 바닥 실험 판을 준비 : 종자 세포 나 100 ㎕에서 적절한 밀도로 96 웰 중으로 지수 단계에서 평평한 바닥 판을 성장멀티 채널 피펫을 사용하여 dium.
      주 : 최적 출발 세포 농도를 결정하기 위하여, 여러 농도의 세포를 파종 및 적어도 4 일 동안 매일 측정하여 96- 웰 플레이트에서 각각의 세포주 세포주의 성장 프로파일을 평가하는 것을 권장한다. 이것은 OD 값을 포화하여 실험 영향 바와 같이, 72 시간 후에 세포의 과증식을 방지 시드 농도를 선택. Panc-1 및 Panc-1R 세포 최적 시드 농도 / 웰 8000 세포이다.
    6. 중간 단 웰에 100 ㎕의 배지를 첨가하고, 플레이트에 대한 세포의 적절한 접착을 보장하기 위해, 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 배양한다.
    7. Panc-1 및 1 ㎜ 및 Panc-1R 세포 100 nm의 1 μm의 10 nm의 사이에 젬시 타빈의 약물 희석 범위를 준비합니다. 멀티 채널 피펫을 이용하여 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 희석 각 100 μL를 추가한다. 세중의 각 농도가 있는지 확인하십시오. 게다가,중간 단 우물 대조군 세포에 100 ㎕의 배지를 추가한다. 72 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션.
    8. 석출 웰의 바닥에 단백질을 고정하기 위해서 4 ℃에서 적어도 60 분 동안 플레이트를 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰에 25 ㎕의 냉 TCA 용액을 첨가하고 배양한다.
    9. 티슈의 중간 건조 간단히 제거함으로써 접시 비우기.
    10. 수돗물로 5 회 반복 후 접시를 비우고 실온에서 건조 할 수 있습니다.
    11. 실온에서 15 분 동안 반복 - 피펫 및 염색을 사용하여 웰 당 50 μL의 SRB 용액을 추가한다.
    12. SRB 얼룩을 제거하여 판을 비 웁니다.
    13. 1 % 아세트산 4 회 반복 후 접시를 비우고 실온에서이 건조 할 수 있습니다.
    14. 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 당 150 ㎕의 트리스 용액을 추가 / 분 900 쉐이크 최대 판 진탕까지 3 분 동안 혼합한다.
    15. 540 나노 미터 (또는 492 nm의 경우에서 광학 밀도를 읽어 t그는) 값이 너무 높은 OD.
    16. 데이터를 분석 할 수 있습니다.
  4. MTT 및 SRB 분석 실험을위한 데이터 분석
    1. 다음 식에 사용 "0 일"에서 세포의 OD 값을 계산 : OD 주 0 = OD 제어 셀 - 평균 OD 빈 우물
    2. 하기 식에 따라 각 약물 농도에 대한 생존 세포의 비율을 계산한다 : % 처리 한 세포 = 평균 [OD 처리 된 세포 - 평균 OD 블랭크 웰 - OD 주 0] / [OD 제어 셀 - 평균 OD 블랭크 웰 - OD Day0 * (100)
    3. 투여 량 - 반응 곡선 (%의 성장 억제 대 약물 농도)를 그린다.
    4. 용량 반응 곡선을 사용하여 50 %의 증식 억제 약물 (IC 50)의 농도를 계산한다.

RNA 시퀀싱 2. RNA 분리 및 라이브러리 준비

  1. 샘플 콜ection 및 RNA 분리
    1. CEM 세포 : 배양 배지로부터 106 개 세포를 수확.
    2. Panc-1 및 Panc-1R를 들어, 매체를 제거 PBS로 두 번 세포를 씻어 내고 트립신 EDTA를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하여 분리. 문화 매체를 추가하고 10 6 세포를 수확.
    3. 3 분 동안 300 XG에 샘플을 스핀 다운 뜨는을 제거하고 제조자의 프로토콜에 따라, 시판되는 실리카 막 스핀 열을 사용하여 총 mRNA의 압축을 풉니 다.
    4. 자외선 마주 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도와 순도를 결정합니다.
      주 : 260 ㎚ / 280 nm의 흡광도 비가 1.8 이상인 경우에는 RNA가 고순도 여겨진다. 80 ° C - 샘플이 저장 될 수있다.
    5. 에티 디움 브로마이드로 염색하여 1 % 아가 로스 겔상에서 샘플을 200 ng의 전기 영동에 의해 총 RNA의 무결성을 평가.
      참고 : 약 포유 동물의 28S와 18S rRNAs에 대응하는 2 개의 그대로 밴드의 검출2킬로바이트 좋은 총 RNA의 무결성을 나타내는 크기 1킬로바이트
  2. 시퀀싱 라이브러리 준비
    1. 각 샘플 당 총 mRNA의 2 μg의를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 라이브러리 준비 프로토콜을 따르십시오.
    2. bioanalyzer 시스템을 사용하여 각 라이브러리의 품질 및 농도를 결정한다. 10을 nmol / L의 최종 농도로 하나의 샘플까지의 라이브러리를 풀과 bioanalyzer로 측정한다.
    3. 단일 읽기 100 bp의 모드와 높은 처리량 시퀀싱 시스템을 사용합니다.
      참고 :> 80 BP의 읽기 길이가 전사 이성체를 식별하는 것이 필요하다.

차동 접합 3. 감지 시퀀싱 읽고에서

  1. 의 정렬 게놈 및 품질 확인을 참조하는 읽기
    1. UCSC 테이블 브라우저 (25963 유전자)를 사용하여 NCBI refGene 테이블에서 유전자 주석 (.gtf 파일)을 컴파일합니다.
    2. 행하다순서의 주석 인식 갭 정렬 STAR를 사용하여 참조 게놈 (GRCh37)을 읽습니다.
    3. 정렬 인덱스 피카 도구 결과 정렬 파일.
    4. RSeQC 및 samtools를 사용하여 포스트 매핑 품질 제어를 수행한다.
  2. 샘플 그룹 간의 차동 접합 검출
    1. 파이썬과 NumPy와 및 SciPy의 해당 버전을 설치합니다. 다운로드 samtools를 설치합니다. 다운로드 나비 넥타이와 tophat를 설치,
    2. 는 $ PATH 환경 변수에 파이썬, 나비 넥타이, tophat 및 samtools 디렉토리를 추가합니다. 다운로드 사전 구축 된 나비 넥타이 인덱스 (hg19). rMATS 버전 3.0.9을 다운로드합니다.
      참고 : rMATS에 대한 더 자세한 사항은 (19)(34)에 제공됩니다.
    3. 도 5a에 따라 실행됩니다 별도의 매트에 Panc-1R에 CEM-WT 및 Panc-1에 대한 각 덱스 내성 세포주를 비교하여 대안 접합 이벤트를 감지합니다.
    4. previo에서 차동 접합 이벤트를 검색하려면usly 정렬 순서는 (.bam 파일), Panc-하는 CEM-WT 대 CEM- C3, CEM-WT 대 CEM-R5, CEM-WT 대 CEM / R30dm 및 Panc1 그림 5B에서 명령을 사용하여 실행 매트를 읽고 1R 비교.
      참고 : 매트 분석 접합 이벤트의 유형에 따라 결과이 .txt 인 파일을 출력 폴더를 생성합니다 (SE - 엑손 스키핑, A5SS - 대체 5 '스플 라이스 사이트, A3SS - 대안 3'스플 라이스 사이트, MEX - 상호 배타적 인 엑손 및 RI - 인트론 유지) : 하나의 파일이 포함 접합 카운트 만 접합 카운트에 따라 결과가 두 번째 파일을 기반으로 결과와 목표에 읽습니다. 또한, 결과의 개요를 추가가 .txt 파일이 동일 폴더에 생성된다.
    5. SE, A5SS, A3SS 및 RI 가져 오기 접합 카운트에 따라이 .txt 파일을 스프레드 시트와 목표에 읽하기 위해. MEX를 들어 접합 카운트 만에 기초하여이 .txt 파일을 가져옵니다.
      참고 : 유전자 ID, 유전자 기호 : 매트 출력 파일이 P-값을 오름차순으로 정렬됩니다 몇 가지 매개 변수를 포함염색체와 가닥 위치는 선택적으로 접합 조각의 게놈 좌표는, 포함의 길이뿐만 아니라 계산과 (모두 분석 시료의 형태, 포함의 길이를 건너 뛰는 및 표준화, p 값이 거짓 검색 속도에 사용되는 양식을 건너 뛰는 FDR ), 정규화 수와 차동 포함 점수 (평균 (IncLevel1)에 따라 각 샘플의 포함 수준 - 평균 (IncLevel2)).
    6. FDR <더 검증 (예를 들어, DDX5 및 PKM2) 10 %로 통계적으로 유의 한 후보 유전자를 선택합니다.
    7. 통합적인 유전체학 뷰어 대체 접합 이벤트를 시각화 (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), 그림 5에보고.

RT-PCR 및 QRT-PCR 분석 실험에 의한 결과 4. 검증

  1. 프라이머 디자인
    주 : 생물 정보학 파이프, mRNA의 트랜스를 사용하여 얻어진 결과의 신뢰성있는 검증을 제공하기 위해서대안적인 스 플라이 싱 이벤트로 인한 cripts는 RT-PCR을 이용하여 증폭 된 PCR 산물의 아가로 스겔 전기 영동에 의해 가시화된다. 녹색 QRT-PCR 분석은 특정 스플 라이스를 정량화하는 데 사용되는 등 SYBR로 시아닌 녹색 염료는 하우스 키핑 유전자에 대해 변형. 도 7은 DDX5 유전자의 엑손 12 스킵 이벤트 시각화 및 PKM 유전자의 상호 배타적 인 엑손 9 엑손 10 정량화인가 전략을 도시한다.
    1. RT-PCR 분석을 위해, 상류에있는 구성 적 엑손 (엑손 (10)과 엑손 13)와 하류 대체 접합 부위 (그림 7A)에있는 어닐링 디자인 프라이머 쌍.
      주 : 앰플 리콘 크기가 아가 로스 겔에 예측 된 PCR 산물의 명확한 분리를 보장하기 위해 100 내지 800 염기쌍을 포함한다. 60 %를 초과하지 않아야 C와 GC 함량이 55 ° 내지 65의 프라이머 어닐링 온도가되어야한다.
    2. 시아닌 그린 분석 (그림 7B). 두 개의 상호 배타적 인 엑손과 각각 특별히 디자인 두 프라이머 쌍의 서열 상 동성을 확인만으로 만이 스플 라이스 변이체들 중 하나를 검출한다.
      참고 : 앞으로 프라이머 변형 별 및 어닐링 9 (PKM1를) 엑손하거나 엑손 10 (PKM2) 동안 PKM를 들어, 역방향 프라이머는 두 변종에 공통 11 엑손에 어닐링.
    3. DDX5 전장 유전자를 검출하기 위해 상기 스킵 된 엑손 (엑손 12) 내의 역방향 프라이머 어닐링.
      참고 : DDX5 ΔEx12 변형의 구체적인 검출을 위해, 역방향 프라이머는 exon11 / exon13 경계에 걸쳐있다. 모두 반응에 구성 적 엑손 (10)에 어닐링 같은 정방향 프라이머를 사용합니다.
      주 : 앰플 리콘 크기는 80, 200 bp의 사이에 있어야한다.
  • 첫 번째 가닥 cDNA를 합성
    1. 200 U 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스 / μL (M-MLV) 되돌리기를 사용하여 cDNA를에 고립 된 RNA 1 μg의의 역전사을 설정멸균 수로 5의 반응 완충액에서 셀레늄 효소 1 희석. DTT 1 μM, 랜덤 헥사 0.05 μg의, 데 옥시 뉴클레오티드 믹스 (의 dNTP) 1 ㎜, 및 리보 뉴 클레아 제 억제제의 40 U / μl를 추가합니다.
    2. 소용돌이 간략하고 2 시간 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 배양한다.
    3. 5 분, 역전사 효소를 불 활성화 얼음 믹스를 전송하고 미세 원심 분리를 이용하여 회전 속도가 70 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 샘플은 즉시 사용하거나 저장할 수 있습니다 - 20 ° C.
  • RT-PCR 반응 및 아가 로스 젤
    1. 배 12.5 μL를 혼합함으로써, 각 시료 당 PCR 튜브에 PCR 반응을 집합 PCR의 mastermix 10 μM 정방향 프라이머 및 멸균 수 25 ㎕의 최종 부피까지 역방향 프라이머에 대한 동일한 양의 1.25 μl를 농축시켰다.
    2. 믹스의 cDNA 1 μl를 추가하고 열 순환기에 튜브를 배치합니다. 다음과 같이 프로그램을 실행 : 초기 변성 : 2 분 95 ° C를.35 사이클에 대해 다음 단계를 반복 : 변성을 25 초 동안 95 ° C에서; 35 초 동안 52 ° C에서 어닐링; 1 분 72 ° C에서 확장. 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정합니다.
    3. TBE 버퍼 1X 100ml에 아가 1g을 용해시켜 1 % 아가 로스 겔을 제조. 이 용액에 에티 디움 브로마이드의 2.5 μl를 추가합니다. 주의 : 에티 디움 브로마이드가 암을 유발하는 화학 물질 흄 후드를 사용하여 취급에주의.
    4. 샘플을로드하고 전기 영동 시스템에서 약 30 분 동안 100 V에서 1X TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다.
    5. 디지털 UV 카메라로 젤을 공개하고 이미지를 저장합니다.
  • QRT-PCR 및 데이터 분석
    1. 최대 PCR 튜브에 멸균 수 15 μL의 최종 볼륨 배 녹색 PCR Mastermix의 12.5 μL, 5 μM 정방향 프라이머의 2 μL 및 역방향 프라이머 같은 양을 혼합하여 각 샘플 당 시아닌 녹색 PCR 반응을 설정 . 각각의 특정 스플 라이스의 믹스를 준비변형 (PKM1, PKM2, DDX5 전체 길이, DDX5 ΔEx12)과 하우스 키핑 유전자 (GUS)를 검출한다.
    2. 흰색 96 웰 플레이트에 mastermix을로드하고 각 샘플 당 중복을 준비합니다.
    3. 물에서 cDNA를 10 배 희석 각 믹스 5 μl를 추가하고 열 순환기에 접시를 놓습니다. 다음과 같이 프로그램을 실행 : 초기 변성 : 5 분 95 ° C를. 45 사이클에 대해 다음 단계를 반복 : 변성을 10 초 동안 95 ° C에서; 58 ° (DDX5 및 DDX5 ΔEx12 혼합) C 또는 20 초 (PKM1와 PKM2에 대한 혼합) 60 ° C에서 어닐링. 20 초 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정합니다. 65에서 97 ° C에 그라데이션을 적용하여 곡선을 용융 설정합니다.
    4. 타겟으로 프라이머 세트의 특이성을 평가하기 위해, 용융 곡선을 확인하고 단일 피크 각 프라이머 세트에 따라 형성되어있는 것을 확인.
    5. 증폭 곡선 차 미분 값을 계산하고, 사이클 역치 (CT)을 내보낼.
    6. Calculat전자 mRNA의 스플 라이스의 상대적 발현 수준 (REL)는 "델타 코네티컷 (ΔCT)"방법을 사용하여 각 샘플의 GUS 하우스 키핑 (참조) 유전자에 비해 변형. 수식은 다음과 같습니다 REL = 2 - ΔCT, ΔCT = 코네티컷 대상 스플 라이스 변형 - 코네티컷 참조 유전자
    7. 비율 REL 비 = REL 스플 라이스 변이체 1 / REL 스플 라이스 변이체 2, 스플 라이스 변이체의 상대적인 풍부함을 정량 식을 이용하여 REL 비율을 계산하기 위해.
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    Representative Results

    프로토콜에 기술 된 세포 독성 분석법은 시험관 내에서 화학 요법 제에 암세포의 내성을 평가하기위한 안정적이고 강력한 방법을 제공한다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 다음 MTT 분석에 의해, 덱스에 감도는 덱스에 민감한 부모의 CEM-WT 세포를 포함하여 4 개의 T-ALL 세포주, 3 덱스 강한 서브 라인에서 산출 된 것입니다. 및 덱스 내성 세포주 (640 μM - 0.33 ㎚) - 두 개의 다른 농도 범위는 CEM-WT 사이의 감도에 큰 차이 (0.97 nM 내지 2 μM)로 인해 사용할 수 있었다. MTT 분석 명확 CEM-에 비해 CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 μM), CEM-R5 (IC 50> 640 μM) 및 CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 μM)에서 덱스 저항을 보였다 WT 세포 (IC (50) = 0.028 ± 0.003 μM). 마찬가지로, SRB 분석은 (IC에게 = 3 50 Panc-1R 세포주 타빈 높은 저항을 보여 주었다.부모 Panc-1 세포에 비해 16 ± 0.01 μM) (그림 2 켰을 때, IC (50) = 0.077 ± 0.03 μM).

    모든 고려 세포주에서 약물 내성의 확인에 따라, 우리는 다음의 mRNA 분리, 도서관 준비와 RNA 시퀀싱을 진행했다. 이 페놀 및 단백질 오염을 방지하고 잘 1.8 이상 260 나노 미터 / 280 nm의 흡광도 비율로 샘플의 높은 순도를 제공하기 때문에 실리카 막 스핀 열을 사용하여 총 mRNA의 추출은 다른 방법에 비해 선호하는 선택입니다. 이것은 깊은 시퀀싱 같은 복잡한 다운 스트림 애플리케이션을위한 중요한 요구 사항입니다. 아가로 1 % RNA 샘플의 무결성을 확인하기 위해 사용 된 방법은 갓 고립 셀 (도 3)에 특히 적합하다. 이 프로토콜의 목적은 비정상적 약제 내성 세포주에서 발현 대안적인 스플 라이스 변이체를 검출하기 때문에, 우리는 양 selectio 선택할시퀀싱 라이브러리 제조 mRNA의 폴리아 데 닐화의 N, 가닥 mRNA의 키트를 이용하여. 단일 및 풀링 라이브러리 Electropherograms 시퀀싱 시스템 요구 사항과 일치 약 300 bp의 평균 조각의 크기를 보여주는,도 4에 도시된다. 조제한 라이브러리이어서 단일 읽기 100 BP 모드 칩을 사용하여 서열화 하였다. 100 염기쌍 하류 생물 정보학적인 파이프 라인을 통해 대안적인 스 플라이 싱을 검출 할 필요가 시퀀싱의 선택은 판독한다.

    초기 처리 단계 및 품질 관리 한 후, 깨끗한 인간 게놈 (hg19) 정렬 판독 MATS 접합을 이용하여 분석을 차동 하였다. 이 분석에서 우리는 저항하는 서브 라인 별도로 약물에 민감한 부모 세포주와 약물의 각 사이의 비교했다 (즉, CEM / R30dm, CEM-C3 CEM WT CEM WT). 매트는 유연하고 정확한 통계 모델에 의존샘플 간의 차이 접합을 검출하도록 사용된다. 기본 분석 옵션과 FDR 값 <(도 5b에 도시 된) 차단과 같은 10 %를 사용함으로써 가장 안타 대체 접합 이벤트의 유형별로 정렬 비교 당 38 ± 12 상당한 차등 접합 유전자 후보들을 확인할 수 있었다 엑손 스키핑으로 분류. 그림 6은 Panc-1R 대 비교 Panc-1의 일반적인 분석 출력을 보여줍니다.

    엑손 스키핑 아래에 설명 범주 당 대표 후보와 상호 배타적 인 엑손 이벤트 : 우리는 다른 대안 접합 이벤트의 가장 일반적인 두 가지 유형에 연구를 집중했다. DDX5 (DEAD 박스 헬리 5) 비교 CEM-WT CEM-C3 및 CEM-R5에서 통계적으로 유의으로 매트 분석에 의해 감지하지만, 비교 CEM-WT CEM / R30dm에서 중요하지되었습니다. 우리는, 백혈병 25, 26 년 추정 역할을 감안할 때더 검증이 후보를 선택합니다. 매우 게놈 브라우저와 같은 도구에서 RNA-서열 데이터를 시각화하는 것이 좋습니다. 유전자 후보 DDX5 대한도 7에 도시 된 바와 같이, IGV,이 목적을 위해 다양하고 사용하기 쉬운 인터페이스를 제공한다. PKM (피루브산 키나아제 근육 이소 자임)를 비교하여 통계적으로 유의 한 상호 배타적 엑손 이벤트 CEM-WT 모든 덱스 내성 서브 라인 아니지만 Panc-1R 비교 Panc-1인치 고형 종양 대사 27, 28에서이 효소의 관련성과 T-ALL (29)의 글루코 코르티코이드 저항의 세포 대사의 새로운 역할을 감안할 때, 우리는 RT-PCR을 사용하여 추가 검증이 후보를 선택합니다.

    프라이머 디자인은 프라이머 어닐링 엑손 - 엑손 데 특히 경계하거나 t를 (역방향 DDX5 ΔEx12 변형을 검출하는 프라이머의 경우), 올바른 앰플 리콘을 증폭하기 위해 각별한주의하여 수행해야헤이 어닐링 높은 서열 상 동성 (엑손 9 엑손 PKM 10)와 상호 배타적 인 엑손합니다. 도 9는 DDX5 유전자 후보에 대한 RT-PCR의 결과를 나타내고있다도 8은 상기 프라이머 디자인 전략을 보여준다. DDX5 ΔEx12 따라서 질적 인 방식으로 매트 데이터를 확인, 샘플 CEM-C3 및 CEM-R5에서 CEM-WT 및 CEM / R30dm 아니라에서 검출된다. 각각도 10 및도 11에 도시 된 바와 같이 시아닌 그린 QRT-PCR 분석은 정확하게 상기 DDX5 및 PKM 스플 라이스 변이체의 mRNA 발현 수준을 정량화한다.

    그림 1
    그림 1 : 대체 접합 이벤트의 도식 표현. 유전자의 대체 접합의 가능한 패턴의 도식 표현. 박스는 독립적으로 포함되거나 씨에서 제외 할 수 있습니다 이산 엑손 있습니다NA 성적 증명서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2 : 세포 독성 분석 실험 결과. 백혈병 세포주 (A) MTT 분석은 CEM-C3의 덱사메타손 저항성 높은 수준 (IC 50 ± 98 = 386), CEM-R5 (IC 50> 640 μM) 및 CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 μM을 나타낸다 ) 부모 CEM-WT (IC (50) = 0.028 ± 0.003 μM)에 비해. 췌장암 세포 라인 (B) SRB 분석은 부모 Panc-1에 비해 Panc-1R에 젬시 타빈 저항의 높은 수준 (IC (50) = 3.16 ± 0.01 μM) (= 77.22 ± 2.76 nM의 IC 50)을 알 수있다. 그래프는 세 indep의 평균 ± SEM 세포 증식 % 신고endent 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    그림 3 : 아가 로스 겔을 사용하는 RNA 품질 평가. 이백 NG 총 mRNA를 에티 디움 브로마이드로 염색하여 1 % 아가 로스 겔상에서 실행 하였다. 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 18S 및 28S 및 저급 분자량의 얼룩의 유무에 대응하는 본래 밴드의 존재는 우수한 RNA을 가리킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    그림 4 : <시퀀싱 라이브러리의 강한> Bioanalyzer의 흔적. 시퀀싱 라이브러리 (A) Electropherograms은 약 좋은 품질을 나타내는 300 bp의를 피크를 보여줍니다. 샘플 1 내지 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 및 Panc-1R. (B) 풀링 된 샘플의 Electropherogram (FU, 형광 단위).

    그림 5
    그림 5 : 매트와 차동 접합의 검출. (A) 그룹의 비교와 매트를 실행하는 데 사용 (B) 스크립트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 6
    그림 6 : 매트 출력 목록. 그림은 스프레드 시트와 소프트웨어에 매트 분석의 전형적인 출력을 보여줍니다 : 여기 엑손 건너 뛰는 이벤트 (FDR <10 %)에 대한 Panc-1R 비교 Panc-1의 차등 접합 후보를보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 7
    그림 7 : IGV 게놈 브라우저를 통해 DDX5 후보 유전자의 차등 접합의 시각화. 정렬을 가진 파일은 백혈병 세포에 해당하는 (.bam가) IGV 게놈 브라우저에 업로드 (중요한 접합 이벤트를 시각화하기 위해 최소 접합 카운트 값 = 10) 생선회 플롯을 사용하여 시각화 된 읽습니다. 스플 라이스 접합 카운트가 라인 접속에 의해 표현되고RNA의 서열 -에 대응하는 숫자는 엑손 걸친 읽는다. CEM-WT 및 CEM / R30dm는 엑손 12 스킵을 표시하지 않습니다 CEM-C3 및 CEM-R5에 비해 13 엑손하는 엑손 (11)에 걸쳐 건너 뛰는 횟수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 8
    그림 8 : RT-PCR 및 시아닌 그린 QRT-PCR을위한 프라이머 디자인. (A) RT-PCR : 택일 적 접합 엑손의 상류 및 하류에 위치 항시 엑손 (엑손 10, 엑손 13)에 DDX5 어닐링 차동 접합 검출 프라이머 쌍. (B) QRT-PCR 분석 : 정식 성적표에 비해 엑손 건너 뛰는 이벤트의 결과 성적의 상대적 정량, 역방향 프라이머 어닐링 중 하나를 건너 뛴 엑손 (다른 변형) 내에서 또는DDX5 유전자의 exon11 / exon13 경계 (표준 변형)에. 전방 프라이머 어닐링이 중 9 (PKM1를) 엑손 또는 엑손 10 (PKM2)하면서 상호 배타적 인 엑손의 정량화를 들어, 역방향 프라이머는 두 이성체에 공통 11 엑손에 어닐링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 9
    그림 9 : DDX5 차등 접합의 RT-PCR 확인. 1 % 아가 로스 젤은 백혈병 세포의 DDX5 유전자의 차동 스 플라이 싱을 보여줍니다. DDX5 ΔEx12 (430 염기쌍)의 변형은 CEM-WT 및 CEM / R30dm에서 샘플을 증폭하면서 전체 길이 앰플 리콘 (650 염기쌍)을 DDX5에 대응하는 단편은 모든 샘플에서 증폭되고, 크기는 엑손 12 스킵에 해당한다. 저지 이것은, CEM-C3 및 CEM-R5 세포에서 검출되지매트 분석에 의해 채굴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 10
    그림 10 : CEM 세포에서 DDX5 스플 라이스 변종의 mRNA의 발현 수준. (A) QRT-PCR 분석. 상대적 발현 수준의 평균과 두 개의 독립적 인 실험 (REL ± SEM)의 표준 오차를 의미한다. 스플 라이스 변종의 REL의 (B) 비율 (± SEM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 11
    그림 11 : mRNA의 발현 량CEM에서 PKM 스플 라이스 변형 및 Panc-1 세포의의. (A) QRT-PCR 분석. 상대적 발현 수준 및 CEM 세포에 대한 스플 라이스 변이체의 REL의 평균 두 개의 독립적 인 실험 (REL ± SEM) 및 비의 표준 오차를 의미한다. (B) QRT-PCR 분석. REL 평균 ± Panc-1 세포에 대한 스플 라이스 변이체의 두 개의 독립적 실험 REL (± SEM)의 비율의 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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    Discussion

    여기에서 우리는 약물 내성과 관련하여 차동 접합 이벤트를 식별하는 분석을 잘 확립 된 세포 독성 스크리닝 기술과 강력한 NGS 기반 transcriptomic을 결합하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 분광 분석은 시험 관내 암 모델에서 약물 민감도를 평가하기 편리하고 강력한 높은 처리량 방법이며, 세포 독성 검사를 수행하는 많은 실험실에 대한 첫 번째 선택을 나타냅니다. 이 방법에 대한 문제 해결뿐만 아니라 가능한 변형은 광범위하게 다른 곳에서 4,5 설명했다.

    높은 처리량 게놈은 현재 특정 약제 내성 표현형과 관련된 유전자의 발현 추정 약물 내성 메카니즘의 SNP 검출에 주로 의존 살펴 차동 사용 분석한다. 본 연구에서는 정확한 mRNA의 성적 증명서의 주석 및 DIF의 검출을위한 강력한 생물 정보학 파이프 라인과 함께, RNA 시퀀싱 방법의 사용을 설명ferential 접합. 기술 된 프로토콜의 특히 중요한 특징은 별개의 약물 감도 프로파일 두 샘플 그룹간에 신규 스플 라이스 변이체를 식별하는 능력이다. 정확하고 공평 분석을위한 중요한 단계 중 하나는 고순도 및 무결성이어야 RNA의 분리이다.

    매트를 사용할 유사한 생물 정보학 도구의 시리즈 중 우리가 선택한 소프트웨어 (예를 들어, Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice 및 접합 나침반) 대체 스 플라이 싱 (18)의 검출. 그것은 바람직한 옵션을 구성하는 주요 핵심 기능은 뛰어난 정밀도와 정확성뿐만 아니라 새로운 이벤트를 식별 할 수있는 가능성이다. 첫 번째 작업은 엑손 접합부 카운트에 기초하고, 상기 제는 물론 대상 읽는 접합 카운트에 기초한다 : MATS 출력 함유 차동 플라이 싱 분석의 두 종류를 생성한다. 후자 이벤트 스킵 엑손을 검출하기 위해 바람직하지만, 그것으로 권장이 방법은 접합 변경이 특정 유형의 거짓 양성 후보의 수를 감소로 상호 배타적 인 엑손의 분석을위한 첫 번째 옵션을 사용합니다.

    또한, 인트론 고정 초점 분석을 위해, 대안 3 '및 5'스플 라이스 부위 이벤트는 주석 첨부와 함께 인트론 .gtf 파일이 사용되어야한다. 궁극적으로, 샘플 그룹 내 생물학적 기술 변동을 감소시키고 높은 참 양성 비율을 확보하기 위해서는, 강하게 적어도 세 34 복제 서열을 권장한다. MATS의 출력에 기초하여 차분 접합 유전자 후보의 선택은 RT-PCR을 이용하여 확인 단계와 결합시켰다. 이것은 유의 후보 큰 목록 중에서 참 양성 변이체의 선택을 위해 매우 중요하다. 정확한 검증을위한 핵심 요소는 올리고 뉴클레오티드의 설계 및 분자 생물학의 표준에 따라 PCR 반응을 최적화한다. 특별한주의이러한 생거 법에 의한 증폭 산물의 염기 서열로서 엑손 - 엑손 접합부 추가적인 검증 단계를 스패닝 프라이머를 설계 할 때 수행되어야하며, 그들의 특이성을 확인하기 위하여 보증된다.

    MATS 검출 DDX5 및 PKM 사체의 차동 접합은 약물 내성과 관련된 비정상적인 접합의 두 가지 예를 나타낸다. DDX5 ΔEx12는 장기간 덱스 노출 후 선정 된 GC-내성 세포주 (CEM-C3 및 R5)로 표현되지 않았다. DDX5 ΔEx12는 부모 세포주에서뿐만 아니라 화학 요법 제 MTX보다는 덱스에 대한 저항으로 선정 된 서브 클론 CEM / R30dm, 표현 하였다. 암세포에서 PKM2 고도로의 스플 라이스 변이체 PKM1 비교하여 발현되었지만, NGS 결과에 의해 제안 비율은 PKM2 / PKM1는 덱스 내성 세포 높았다. 이는 젬시 타빈 강한 상대에 비해 Panc-1 시료 관찰되지 않았으며, 실제로이 후보 유전자 중 않았다매트 분석에서 통계적으로 유의 한 이벤트. 이것은 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 세포 유형 및 메카니즘을 반영하는 것이다.

    결론적으로,이 프로토콜은 약물 내성의 기초 있고 백혈병 세포 30 고형암 세포 (31) 중 하나에 적용 할 수있는 스플 라이스 변이체의 발견을위한 적합한 방법을 구성한다. 명확한 제한은 종양 세포주 암 이질성의 극히 일부를 캡처한다는 것이다. 또한, 대부분의 세포주 성장 촉진 배지에서 단층 수년 동안 유지되었다. 이러한 조건들은 발신되는 일차 종양 세포 극적 다를 개체군의 선택의 결과, 세포의 특성에 영향을 미친다. 그러나, 약물 내성에 관여하는 유전자의 대부분은 또한 장기 culturin 의해 영향을받을 수있는 세포 증식 및 아폽토시스와 같은 다른 중요한 세포 기능에 관여 플라스틱 g. 따라서, 약물 내성 연구를 개선하기 위해 더 많은 노력 셀룰러 특성의 중요한 변화를 피하기 위해 더 밀접하게 생체 암 미세 환경을 모방 한 것으로, 일차 배양 및 이종 이식 같은 신규 전임상 모델의 개발을 향하는되어야 세포 배양 및 배양 조건의 연장 된 기간에 의해 발생. 32 현저 우리 프로토콜 생체 IC 50 값을 결정하기 위하여 세포 독성 분석을 사용하여, 일차 전지에도 적용 할 수있다. 또 다른 한계는 저항 많은 메커니즘 각 항암제 존재하기 때문에, 저항 유사하거나 상이한 메커니즘이 동일하지만, 독립적 인 치료에 노출 된 세포에서 발전 할 수 있다는 것이다. 따라서, 비교 선택 전략은 동일한 화학 요법 제로 처리 동일한 부모 세포의 스플 라이스 변이체의 유전자 분석을 포함하여 병렬 선택 및 분석을 포함한다.

    jove_content는 "> 기능 검증을위한 추가 방법은 RNA 간섭 또는 스플 라이스 전환 올리고 뉴클레오티드 (33)를 사용하여 자신의 발현을 하향 조절 특히 세포주에 대한 관심의 스플 라이스 변형을 과발현 또는 목표로해야한다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

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    References

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