Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

Biology

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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica di attività elettrica dal mouse atrio destro e soprattutto il nodo seno-atriale, con una risoluzione spaziale e temporale elevata.

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Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

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Abstract

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Tutti i metodi e protocolli utilizzati in questi studi sono stati approvati da The University of Wisconsin cura degli animali e Usa Comitato protocollo seguendo le Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicati da NIH (pubblicazione n ° 85-23, revisionato 1996). Tutti gli animali utilizzati in questo studio hanno ricevuto la cura umana nel rispetto della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Rimozione Cuore e Langendorff perfusione

  1. Prima di isolamento cuore, soluzione Tyrode riscaldare a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua e una camicia d'acqua.
  2. Anestetizzare il mouse con il 5% isoflurano / 95% O 2.
  3. Garantire un livello adeguato di anestesia controllando la perdita del dolore riflesso.
  4. Eseguire la toracotomia. Aprite la cassa, utilizzando curve 5.5 "forbici Mayo e 5.5" Kelly emostatico perceps Per fare un 1 cm tagliato sulla parte anteriore del torace.
    1. estrarre rapidamente il cuore dal petto (entro 30 secondi). Utilizzare 4 "pinze curve Iris per afferrare il tessuto polmonare e tagliare il polmone, il timo e il cuore insieme con il pericardio con 4.3" forbici Iris. Non afferrare direttamente il cuore.
    2. Lavare in ossigenata (95% O 2/5% di CO 2), a temperatura costante (36.8 ± 0.4 ° C) ha modificato la soluzione di Tyrode. Utilizzare la seguente composizione della soluzione (in mM): NaCl 128,2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 1.3 CaCl 2, 20.0 NaHCO 3, e 11,1 glucosio (pH 7,35 ± 0,05).
  5. Mentre immersa nella stessa soluzione, identificare il polmone, timo e tessuto adiposo. li sezionare con cura dal cuore. Utilizzare curvo 3 "forbici Vannas-Tubinga e 4.3" # 5 pinze.
  6. Quindi individuare l'aorta e cannulate è su una cannula 21 G su misura. Utilizzare due curve 4.3 "forza # 5Bps.
  7. Dopo incannulazione, contemporaneamente defluire in (attraverso la cannula ad una portata di ~ 5 ml / min; questo dovrebbe essere regolata in base alla pressione aortica, vedi sotto) e superfuse (nel bagno ad una portata di ~ 50 ml / min) cuore con soluzione Tyrode riscaldato e filtrata durante l'intero esperimento. Far passare la soluzione di perfusione attraverso un filtro di nylon 11 micron di linea per evitare l'intasamento della circolazione coronarica.
  8. Utilizzando un trasduttore di pressione (o un manometro) collegato attraverso un rubinetto a 3 vie Luer serratura alla linea di perfusione, monitorare la pressione aortica e mantenerlo tra 60 e 80 mmHg. Regolare la velocità di perfusione se necessario per mantenere la pressione aortica all'interno di questa gamma.

2. mappatura ottica del SAN dalla Langendorff-perfuso cuore intero

  1. Strumentazione
    1. Posizionare cuore orizzontalmente e il pin del ventricolo al fondo siliconato della camera usando 0,1 mm perni diametro prevent flusso indotta movimento durante l'esperimento. 12
    2. Inserire un piccolo ( "ID x .005" .012) tubo di silicone nel ventricolo sinistro (LV) attraverso la vena polmonare, gli atri sinistro (LA) e la valvola mitrale (MV). Fissare il tubo con una sutura di seta (4-0) al tessuto connettivo suono.
    3. Posizionare il cuore con il lato posteriore rivolto verso l'alto (figura 1A, pannello di sinistra).
    4. Pin il bordo dell'appendice RA (RAA) al fondo di silicio della camera con diametro 0,1 mm perni minutien. Regolare il livello al fine di rendere la superficie posteriore del RA piatta e permettono di essere situato piano focale della fotocamera. Ciò consentirà misure ottiche della superficie massima dell'atrio.
    5. Noose superiore (SVC) ed inferiore (IVC) vena cava da una sutura di seta (4-0), allungare e pin l'altra estremità della sutura al fondo di una camera siliconato (Figura 3A). Assicurarsi che i punti di sutura non bloccano lacampo di vista ottico.
    6. Posizionare l'elettrodo di stimolazione misura sul bordo del RAA. Per elettrodi, uso di silicio rivestito fili diametro argento di 0,25 mm, con 0,5 mm di distanza inter-elettrodo e privo di silicone per una lunghezza di 1 mm al fine di stimolazione. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29-gauge) elettrodi monopolari vicino alla base del ventricolo destro e sinistro. Posizionare l'elettrodo ECG terra vicino all'apice dei ventricoli.
  2. colorazione
    1. Poiché entrambi i coloranti fluorescenti e disaccoppiatore blebbistatin elettromeccanico sono sensibile alla luce, eseguire tutte le procedure descritte qui di seguito in una stanza buia. Prima preparare dye voltage-sensitive RH-237 o di-4-ANNEPS come una soluzione madre, 1,25 mg / ml in dimetilsolfossido (2,5 mM), un'aliquota esso (30 ml ciascuna) e conservare le aliquote a -20 ° C.
    2. Diluire 5-10 ml di soluzione colorante magazzino in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e poi iniettare nella linea di perfusione coronaricaper un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer.
    3. Preparare blebbistatin come una soluzione madre (2 mg / ml in dimetilsolfossido, 6,8 mM) in anticipo e conservarlo a 4 ° C.
    4. Dopo 20 min di stabilizzazione aggiungere 0,5 ml di riscaldato (37 ° C) blebbistatin nel perfusato e diluire 0,1 ml di blebbistatin in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode. Poi iniettare nella linea di perfusione coronarica in un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer.

3. mappatura ottica del SAN dalla isolata atriale Preparazione

  1. Strumentazione
    1. Per la preparazione atriale isolata, isolare e cannulate cuore come descritto nei passaggi 1,1-1,5 per la preparazione intero cuore.
    2. Sezionare i ventricoli lontano dal lato anteriore. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 1 ° posto per i dettagli.
    3. Aprire il RA, tagliando attraverso la va tricuspidelve (TV) lungo l'asse TV SVC. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare # 2 per i dettagli.
    4. Tagliare l'arto mediale del crista terminalis per aprire il RAA. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 3 #.
    5. Aprire la parete libera atriale anteriore eseguendo un taglio dalla linea mediana del precedente taglio # 3 al bordo del basso a destra del RAA, appiattire e pin parete libera atriale al fondo di una camera di silicio rivestito. Vedere la direzione indicata dalla freccia bianca in figura 1A, tagliare 4 #. Conserva un bordo di tessuto ventricolare di spinatura la preparazione per evitare danni al atri.
    6. Allo stesso modo, aperto LA tagliando attraverso la MV lungo l'angolo MV-superiore del appendice LA (LAA).
    7. Per aprire la LAA, tagliare a partire dalla metà del LAA aperto, attraverso la parete libera atriale anteriore fino in prossimità di un bordo mezzo della LAA.
    8. Aprire il atriale alo parete libera anterioreng stessa direzione, quindi appiattire e il pin per il fondo di una camera Sylgard rivestite.
    9. Parzialmente rimuovere il tessuto del setto interatriale. Questo riduce la dispersione del segnale ottico da tessuto che non è a fuoco. Pertanto, sia il LA e RA, nonche la SAN e giunzione atrio-ventricolare (AVJ) sono accessibili in questa preparazione (Figura 1B).
    10. Sollevare la preparazione finale di circa 0,5 mm dal fondo della camera siliconato per permettere superfusione da entrambe le superfici epicardici ed endocardici.
    11. Superfuse preparato con riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode ad una velocità costante di ~ 12 ml / min per un flusso mirato situato vicino alla SVC e ~ 30 ml / min per un superfusione vasca.
    12. Posizionare il Ag / AgCl 2 elettrodi di stimolazione su misura (0,25 mm di diametro) sul bordo del RAA sezionato. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29G) elettrodi (monopolare) vicino al RAA e LAA, rispettivamente. Posizionare il terreno ECG elettiha guidato vicino al AVJ.
  2. colorazione
    1. Eseguire una diretta applicazione del colorante di tensione-sensibili (RH-237 o di-4-ANNEPS). Per questo, diluire 1-2 microlitri della soluzione di colorante in magazzino 1 mm di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e rilasciare lentamente il colorante diluito sulla superficie del preparato utilizzando una pipetta 1 mm.
    2. In alternativa, eseguire la colorazione atriale con il colorante tensione sensibile attraverso una perfusione coronarica del cuore Langendorff-perfuso simile a quello sopra descritto per la preparazione intero cuore (gradini 2.2.1-2.2.2).
      1. Dopo la colorazione perfusione coronarica, isolare la preparazione atriale come descritto. Eseguire ulteriore colorazione della superficie in caso di necessità di raggiungere un livello di fluorescenza soddisfacente. isolamento atriale rapida non candeggiare il colorante e non influenza la qualità della colorazione.
    3. Immobilizzare la preparazione con l'elettro-meccanico di sganciamento, blebbistatin. Diluire 3-5 ml blebbistatin soluzione madre nella (37 ° C) Soluzione Tyrode riscaldato e rilasciare lentamente il blebbistatin diluito sulla superficie della preparazione e della soluzione circostante. Poiché blebbistatin ha dimostrato di essere sensibile alla luce, 13,14 evitare lunga esposizione alla luce durante la preparazione e la colorazione.
    4. Eseguire applicazioni aggiuntive blebbistatin quanto necessario per sopprimere la contrazione. Normalmente fino a 3 applicazioni aggiuntive (3-5 microlitri per ogni applicazione) possono essere utilizzati per sopprimere l'artefatto di movimento sufficiente per ricostruire con precisione SAN e l'attivazione atriale.
    5. Aggiungere aggiungono 0,5 ml di blebbistatin riscaldato in perfusato. Durante questa procedura, mettere in pausa il superfusione per 30 secondi per permettere il colorante / blebbistatin per macchiare il tessuto atriale.

4. mappatura ottica Set Up

NOTA:. Una descrizione dettagliata del sistema di mappatura ottica è fornito altrove 12

  1. Utilizzare una fotocamera con un TEMrisoluzione porale di 2.000 fotogrammi / sec o superiore, e una serie di lenti condensatrici raggiungere risoluzione spaziale di 100 pm / pixel o superiore. Questo è necessario per ricostruire attivazione SAN e propagazione intranodale.
  2. Per ridurre il moto manufatto dalla soluzione vibrante, fissare un piccolo vetro di copertura sulla superficie della soluzione sulla preparazione atriale cuore / isolato.
  3. Utilizzare luce di eccitazione (520 ± 45 nm) fornita da una corrente costante, lampada alogena a basso rumore. Dirigere il fascio di luce filtrata sulla preparazione utilizzando una guida di luce biforcato flessibile.
  4. Filtrare la fluorescenza emessa da un filtro passa lungo (> 715 nm). Raccogliere, digitalizzare e salvare il segnale fluorescente acquisito su un computer utilizzando il software fornito dal produttore della fotocamera.

5. Data Processing

Nota: I dati mappatura ottica vengono raccolti e conservati come una serie di matrici di intensità fluorescente in diversi momenti. Ogni represe pixelNTS una misura di intensità della fluorescenza raccolti da una posizione specifica sulla preparazione dei tessuti in un punto temporale specifico. Fluorescenza di fondo viene rimosso automaticamente per pixel per consentire una migliore visualizzazione delle variazioni di fluorescenza indotte da variazioni di tensione della membrana e dall'alto in basso per corrispondere con potenziali d'azione (AP) misurati da sistemi di microelettrodi. I dettagli delle varie fasi di elaborazione dei dati di imaging ottico, tra cui la segmentazione delle immagini, filtraggio spaziale, il filtraggio temporale, e la rimozione deriva della linea di base, sono previsti nella revisione mirata. 15

  1. Manualmente o utilizzando l'algoritmo speciale (per esempio, un rilevamento soglia o fronte) 15 per determinare i confini dei tessuti, creare una maschera binaria di 1 (pixel incluse) e 0 (pixel esclusi) e applicare la maschera per ogni fotogramma della sequenza. Questo processo crea un'immagine binaria che evidenzia le aree di interesse per ulteriori elaborazioni.
  2. Per migliorare il rapporto segnale-rumore del optdati iCal, filtrano i segnali all'interno delle aree selezionate di interesse. Per questo, utilizzare spaziale (media di pixel fluorescenti adiacenti quali definite da un bidone convoluzione desiderato o kernel, ad esempio 3 x 3 o, per i dati rumorosi, 5 x 5) e / o filtro temporale (per esempio, Butterworth, tipo Chebyshev 1, tipo 2 Chebyshev, ellittico, ecc) (Figura 2). Tenete a mente la possibilità di artefatti filtrati indotta quando si interpretano i dati. Per maggiori dettagli, vedi recensione. 15
  3. Rimuovere deriva della linea di base in registrazioni ottiche quando necessario (utilizzando filtro passa-alto o raccordo polinomio al segnale originale) e quindi normalizzare ogni segnale pixel da 0 (fluorescenza minima) a 1 (fluorescenza massima).
  4. Selezionare una finestra temporale che comprende i tempi di attivazione di tutti i pixel per una singola propagazione AP. Assegnare ad ogni pixel il suo tempo di attivazione come il momento di massima derivata salita (dF / dt max, dove F è fluorescenintensità ce). Utilizzando tutti i tempi di attivazione del pixel, ricostruire la mappa di attivazione isochronal. Ogni isochron mostrerà quindi i pixel attivati ​​contemporaneamente.
  5. Per ricostruire la mappa di distribuzione durata AP (APD), per ciascun pixel calcolare la durata tra il tempo di attivazione e il tempo ad un livello specifico di ripolarizzazione (ad esempio, al 80% di ripolarizzazione, APD 80). Utilizzando tutti i valori dei pixel APD, ricostruire la distribuzione mappa isocrona APD. Ogni Isochron mostrerà quindi i pixel con lo stesso APD.
  6. Per calcolare la velocità di conduzione per AP propagazione, montare una superficie di preparazione ai dati in tempo di attivazione calcolati in 5.4. Per questo, utilizzare la superficie polinomiale di montaggio o locale levigatura della superficie del kernel e quindi calcolare vettori di velocità di conduzione locali dalla pendenza della superficie accoppiata.
  7. Per creare la mappa ripolarizzazione, assegnare ciascun pixel suo tempo ripolarizzazione, definito come la derivata seconda massimo (d 2 F / dt2) del segnale ottico alla fine del OAP, o il tempo del 90% ripolarizzazione.

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Representative Results

Mappatura ottica del intatto SAN dal Cuore Langendorff-perfuso
Un tipico esempio di una mappa di contorno di attivazione RA ricostruiti ritmo sinusale spontanea è mostrato in figura 3 per un cuore del mouse Langendorff-perfuso. Il punto di attivazione precoce si trova all'interno della regione intercaval vicino alla SVC dove il SAN è anatomicamente definito. 3,16 mappe di contorno attivazione acquisite a 1.0 e 0.5 msec frequenza di campionamento a due RA sono mostrati in figura 3B.

Per valutare SAN funzionamento, abbiamo misurato il tempo di recupero SAN (SANRT). 9 Dopo RAA stimolazione per almeno 1 min a 10-12 Hz, la stimolazione elettrica è stata interrotta e SANRT è stata calcolata come l'intervallo di tempo tra l'ultima AP catturato e la prima spontanea AP (Figura 3C). Il SANRT è stata corretta a la frequenza cardiaca (es SANRT <sub> c) calcolando la differenza tra il SANRT e la lunghezza del ciclo base. Inoltre, è stata identificata la posizione del primo pacemaker post-stimolazione. Per questo esempio, il SANRTc era di circa 49 msec.

Isolato attivazione Atria e SAN
L'attivazione del preparato atriale isolata durante il ritmo sinusale spontaneo è mostrato in Figura 4A. E 'nato nel anatomicamente definito SAN vicino alla SVC con un ampio fronte d'onda che si diffuse anisotropo in tutto il RA, con due di conduzione direzioni preferenziali in prossimità dei bordi superiore e inferiore SAN e blocco completo alla direzione del setto (segnata nelle mappe di attivazione in figura 4a) . La mappa di attivazione acquistata a 1 frequenza di campionamento msec mostra una vasta superficie di attivazione precoce. Un aumento della frequenza di campionamento a 0,5 msec e 0.3 msec permette di identificare la zona precisa della posizione leader pacemaker. We ha osservato un tipico, beat-to-beat posizione monofocale stabile del pacemaker che porta, che corrisponde alla zona pacemaker primaria in precedenza caratterizzato elettrofisiologicamente da microelettrodi di vetro 17 e mappatura ottica 8-11,18,19 nonché da immunomarcatura per connexin45 e HCN4 . 6,16

Come dimostrato in precedenza, il potenziale di azione ottica SAN consiste in un segnale a due fasi che comprende due componenti distinti: il componente SAN sale lentamente e la salita rapido aumento del miocardio atriale (componente atriale) (Figura 4B) 20 A causa della dispersione della luce. processi, senior rappresenta un'attività elettrica media derivante da molteplici strati di cellule all'interno del tessuto. La profondità e la larghezza di scattering è governata da una costante spazio, che è determinata dalla luce proprietà di diffusione e di assorbimento e può raggiungere fino a 1,5-2 mm. A causa della condu SANritardo ction, il SAN AP precede sempre l'attività atriale durante l'attivazione fisiologica (Figura 4B). Per calcolare la transizione dalla SAN all'atrio (cioè SAN tempo di conduzione, SANCT), abbiamo utilizzato sia il punto di tempo in cui il segnale bicomponente SAN raggiunge il 50% della componente di ampiezza SAN, o il primo picco dei due picco OAP derivata prima (dF / dt). Il SANCT dalla zona di prima attivazione SAN al RA era ~ 5 msec, simile a quella misurata con microelettrodi di vetro.

SAN Tempo di recupero
Analogamente, il SANRT stata misurata nella preparazione atriale isolata (Figura 4D). Per questo, i preparati atriali sono stati stimolati a 12 Hz attraverso un elettrodo di stimolazione trova all'angolo del RAA per almeno 1 min. 9 In questo esempio, il SANRTc era di circa 34 msec, che è paragonabile a quello misurato in Langendorff-perfuso cuore (Figura 3C). Inoltre, è stata identificata la posizione del primo pacemaker post-stimolazione.

Heart Rhythm e fluorescente Segnale stabilità nel tempo
Se le procedure di carico di chirurgia e coloranti sono seguiti in modo appropriato, non ci dovrebbe essere alcun cambiamento significativo nelle caratteristiche fisiologiche del dell'atrio. Nella Figura 5, presentiamo il ritmo cardiaco misurato prima e dopo la procedura di isolamento atriale e durante la perfusione 3 ore. Non sono state osservate variazioni significative della frequenza cardiaca sia durante l'isolamento atrio o dopo la tintura di carico.

Sebbene colorazione arteriosa può richiedere una grande quantità di colorante, la stabilità del segnale fluorescente nel tessuto località SAN sembra essere migliore utilizzando questo metodo di caricamento. Nella Figura 6, presentiamo segnale di intensità decadimento nel tempo sia per colorazione coronarica e di superficie. in t egli tessuto SAN, IC 50 (che indica il periodo in cui l'intensità del segnale è deceduto al 50%) è di circa 107 minuti dopo la colorazione coronarica, quasi il doppio del tempo come quella di colorazione della superficie.

Figura 1
Figura 1:. Isolamento del mouse atriale Preparazione (A) interventi chirurgici eseguiti per isolare la preparazione atriale mouse. Viene mostrata la vista posteriore del cuore. Tutti i tagli sono indicati da linee rosse tratteggiate ed etichettati da numeri in ordine effettuato. Vedere i dettagli in testo. (B) La descrizione schematica della preparazione atriale isolata topo che mostra le principali caratteristiche anatomiche, compresa la struttura trabecolare delle appendici atriali sinistro e destro e la posizione del nodo seno-atriale (SAN, etichettati da un ovale grigio). Tutte le abbreviazioni sono spiegati nella figura.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Segnali grezzi e trasformati Registrato al 0,3, 0,5 e 1 msec / telaio grezzo segnali vengono raccolti da un singolo pixel. Dopo 3 x 3 binning, i segnali sono filtrati utilizzando il passa-basso-algoritmo di Butterworth. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Whole-cuore mappatura ottica del SAN (A) a sinistra, foto di una preparazione tipica utilizzata per la mappatura del SAN dal cuore intatto.. Il quadrato blu indica il campo otticovista (6 mm x 6 mm). A destra, campo di vista ottico catturato attraverso la macchina fotografica e sovrapposti con punti di riferimento anatomici. SVC e IVC: vena cava superiore e inferiore; RAA: appendice atriale destra; RV e LV: ventricolo destro e sinistro; PV: vene polmonari. Mappe (B) a colori di attivazione di contorno acquisiti con 1.0 msec (a sinistra) e 0,5 msec (a destra) frequenza di campionamento. Sulla destra di ogni mappa, la scala temporale colore corrispondente indicante il tempo di attivazione atriale (dal punto di attivazione prima mostrata in blu, l'ultimo punto di attivazione mostrata in rosso) è mostrato. Il sito di attivazione atriale prima viene etichettato da un asterisco. (C) SAN tempo di recupero (SANRT) misurato nella preparazione tutto-cuore. Esempi rappresentativi delle mappe di contorno attivazione atriali ricostruiti per l'ultimo impulso di stimolazione (S1) e per la prima battuta atriale post-stimolazione (A1) sono indicati per i battiti selezionati sulla traccia rappresentativa OAP sopra.Siti di attivazione atriale prima sono contrassegnati da un asterisco. BCL:. Lunghezza del ciclo di base Fare click qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: ad alta risoluzione mappatura ottica del mouse sino-atriale Node (SAN) dalla superficie endocardica del isolata Atria (A) fotografia di un tipico del mouse SAN preparato (6 mm x 6 mm) e le sue mappe di contorno di attivazione corrispondenti. ottenuto a 1,0 msec, 0,5 msec, e 0,3 frequenze di campionamento msec. SAN e una zona di blocco vicino di casa sono indicati dalle frecce. scale temporali a colori indicano il tempo di attivazione atriale. L'asterisco indica la posizione del pacemaker leader. RAA: appendice atriale destra, SVC e INC: superiore e vena cava inferiore, RV: ventricolo destro, AVJ: atrio-ventricul giunzione ar, CT: crista terminalis, IAS: setto inter-atriale. (B) Meccanismo delle doppie componenti della registrazione OAP dal mouse località SAN. Vedere i dettagli in testo. . (C) OAPs registrati dal centro dell'area SAN (blu), il primo sito di eccitazione atriale (verde) e l'ultimo sito di attivazione RA (rosso) Insets: transizione da nodale forma d'onda atriale con un tempo di conduzione totale pari a 5 msec. Confronto con il tempo di ritardo per l'attivazione RA totale pari a 11 msec. (D) SAN tempo di recupero (SANRT) misurata nella preparazione atriale isolata. sono mostrati esempi rappresentativi delle mappe di contorno attivazione atriali ricostruiti per l'ultimo impulso di stimolazione (S1) e per la prima battuta post-stimolazione atriale (A1). Un sito di attivazione atriale prima è etichettato con un asterisco. BCL - durata del ciclo di base.k "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: ritmo cardiaco misurato prima e dopo la procedura di isolamento atriale (A) e durante la perfusione 3 ore (B). (A) della frequenza cardiaca spontanea battito viene mostrato prima e dopo l'isolamento atriale per due tipi di colorazione atriale: superficie di colorazione dopo l'isolamento (senza colorazione preliminare coronarica) e la colorazione coronarica prima di isolamento atriale. (B) Spontaneous cuore pulsante della stabilità del ritmo nel corso della perfusione 3 ore è indicata per i preparati non macchiato atriali e per colorante fluorescente e blebbistatin preparati atriale colorate. I dati sono mostrati come media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. Intensità segnale decade nel tempo le intensità dei segnali provenienti da entrambi i metodi di caricamento (loading coronarica indicata in rosso e piano di carico indicato in blu) sono stati misurati e tracciati nel tempo. Le intensità di segnale sono stati mediati da una zona 7 da 7 pixel a quattro luoghi tipici nell'atrio destro: Trabecula (Trab), del nodo del seno (SAN), atrio destro appendice (RAA) e del seno coronarico (CS). IC 50 valori sono stati quindi calcolati e etichettati in tutte le curve di decadimento. Il decadimento intensità del segnale da entrambi i metodi di caricamento è stata simile in TRAB e RAA. L'IC 50 di carico arteriosa in CS è stato di circa 20 minuti più a lungo. Nel SAN, questo valore per arteriosa carico era quasi due volte più grande rispetto al carico di superficie, il che indica che i metodi arteriosa di carico portato a una migliore stabilità del colorante nelle tiss SANue nel tempo. I dati sono mostrati come media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, abbiamo presentato due tipi di preparazioni del mouse SAN: 1) intatto SAN nel cuore tutta la Langendorff-perfusione, e 2) SAN nella isolato, aperto preparazione atriale. Questi due tipi di elaborazione hanno diversi scopi sperimentali. Nella preparazione tutto il cuore Langendorff-perfuso, la struttura atriale intatta viene preservata che rende possibile studiare aritmie atriali complesse come la fibrillazione atriale e interazioni tra SAN e atrio durante le tachiaritmie rientranti. 6 Al contrario, nella preparazione atriale isolata , l'atrio viene aperto e appiattito in una pseudo due struttura tridimensionale in cui sono disturbati tridimensionale fasci anatomiche. Questo può influenzare l'anatomia delle vie rientranti che rende la preparazione atriale isolata non è l'ideale per lo studio aritmogenesi atriale. Tuttavia, utilizzando questo tipo di preparazione, la posizione del pacemaker leader (s) siti, conduzione intranodale e AP propagazione pattern può essere accuratamente visualizzato e studiato in dettaglio. Inoltre, atri intatti sembrano essere limitati da una vista posteriore, mentre nella preparazione isolato, l'intera superficie atriale è disponibile per la mappatura ottica.

Inoltre, isolato preparazione atriale consente mappatura strutturale-funzionale dell'atrio risolvendo il complesso microstruttura della rete trabecolare, come mostrato nella figura 4. Per questo, elevata spaziale (100 micron / pixel o superiore) e temporale (2.000 fps o superiore) risoluzioni dovrebbe essere usato perché è fondamentale per entrambe le particularize pattern di attivazione atriale e SAN, che potrebbe essere ulteriormente sovrappongono con le corrispondenti strutture. Mentre 1.000 fps risoluzione temporale può essere un minimo di ricostruire l'attivazione atriale (che dura per 10 - 20 msec), 2,000 fps dovrebbe essere considerata come una risoluzione temporale minima per la conduzione intranodale (che dura per ~ 5 ms e quindi potrebbe essere perso in basso risoluzioni) e SAN attomisurazioni ivation come si vede dalla figura 4. Ciò può consentire la localizzazione di aritmogeni "punti caldi" (come ad esempio foci ectopica o rientro ancorato) durante fibrillazione atriale / flutter che potrebbe emergere dalla sovrapposizione delle regioni di notevole rimodellamento funzionale con quelle di fibrosi elevata e / o ridotta cella-a-cella di accoppiamento. 21,22 Inoltre, l'approccio descritto potrebbe essere utilizzato per studiare i meccanismi elettrofisiologici di anomalie SAN, compresi i blocchi SAN uscita, pause, aritmie tachicardia-bradicardia, sindrome del seno malato, ecc.

Introducendo un secondo (o anche una terza) sonda fluorescente, sarà possibile effettuare la mappatura ottica multi-parametrica dell'attività elettrica in associazione con il trattamento di calcio e metaboliche e altre modifiche. Diverse combinazioni di coloranti possono essere usati per simultanea tensione calcio, raziometrico tensione / calcio o mitocondriale potenziale imaging.

Per l'alta mappatura ottica risoluzione temporale, a causa del periodo di raccolta fluoroforo breve, i segnali di un debole rapporto segnale-rumore possono essere apprezzati. Pertanto, un regime di media viene applicata ai segnali ritmo cardiaco sinusale o segnali di stimolazione serie come necessario. Il dF / dt max viene rilevato per ciascun segnale in un lungo periodo di registrazione. Questi punti di tempo di attivazione sono poi allineati. Un periodo di assestamento di registrazione centrato in questi momenti viene tagliato e media da tutto o selezionata Aps, a seconda delle necessità.

Con l'utilizzo accurato della strumentazione e la procedura di colorazione adeguata, parametri elettrofisiologici atriali tra cui la velocità di conduzione (confrontare le figure 3C e 4D per le mappe di attivazione S1), spontanea ritmo SAN e la longevità della preparazione SAN (Figura 5) non sono interessati, che rimangono stabili per 3 o più ore. È importante sottolineare che il Monit continuaoring di ECG deve essere eseguita utilizzando l'intera procedura di colorazione per garantire la normale funzione elettrica del cuore. L'applicazione di blebbistatin può indurre un transitorio rallentamento della frequenza cardiaca, ma a parte questo, non induce alcun spostamenti leader siti di pacemaker o modifiche AP morfologia come è stato anche descritto in precedenza. 13

Superficie colorazione della preparazione atriale isolata è un passaggio fondamentale. Per questo, rapida applicazione del colorante diluito sulla superficie del tessuto deve essere evitato; invece il colorante dovrebbe cadere sulla preparazione liberamente grazie alla maggiore densità di DMSO, che utilizzato sia per tintura e diluizioni blebbistatin. L'importo totale di carico adeguato e della velocità devono essere regolati in modo da non provocare drammatici cambiamenti della frequenza cardiaca. La procedura di colorazione può essere applicato più volte fino a quando il segnale raggiunge un livello ragionevole. Va osservato che l'applicazione diretta di colorante potrebbe danneggiare il tessuto SAN e pregiudicarne le pacemaking. Pertanto, il colorante deve essere diluita e la quantità applicata deve essere attentamente controllato. Appropriata colorazione della superficie non deve danneggiare la preparazione o SAN 23 che viene valutata la frequenza cardiaca comparabili e velocità di conduzione.

protocolli di colorazione alternativi devono essere anche considerati. Questi possono includere sia 10-15 min superfusione del preparato SAN / atriale con il colorante tensione-sensibili (RH-237 o di-4-ANEPPS) a 35 ± 1 ° C 10,19 o 30 min di incubazione del preparato a temperatura ambiente (20-22 ° C) in una soluzione di Tyrode contenente l'indicatore di tensione-sensibili. 11

Per mappatura ottica del SAN dal cuore tutta Langendorff-perfuso, passi importanti strumentazione includono l'inserimento del tubetto nella LV e la chiusura di SVC e IVC. L'ex impedisce un aumento della pressione da congestione soluzione durante gli esperimenti a lungo termine, così come la successiva isviluppo schemia dopo la soppressione delle contrazioni ventricolari da blebbistatin e l'acidificazione della soluzione di perfusione. Quest'ultima permette RA di mantenere un certo livello di pressione intra-atriale riempiendo l'atrio con soluzione di perfusione e appiattendo la regione intercaval al fine di scoprire l'intera area SAN per mappatura ottica.

Infine, colorazione coronarica, in aggiunta alla superficie colorante di caricamento, potrebbe migliorare sensibilmente l'intensità delle SAN OAPs che può durare più a lungo rispetto alla colorazione pura superficie utilizzata negli studi precedenti. 8,9

Uso di blebbistatin ha molteplici vantaggi rispetto ad altri uncouplers elettromeccanici compresi bassa tossicità, effetti collaterali meno pronunciati, e resistenza washout quando viene utilizzato con cautela. Blebbistatin precipita quando viene disciolto a temperatura inferiore a 37 ° C. 14 cristalli blebbistatin può interrompere il flusso vascolare normale e indurre locale pertantoischemia e provocare eventi aritmici. 24 Inoltre, negli studi che utilizzano GFP o altri coloranti verde / giallo, precipitazioni blebbistatin potrebbero essere scambiati per cellule marcate che dovrebbero essere presi in considerazione. Prevenire blebbistatin precipitazione è semplice, vale a dire, si deve sciogliere blebbistatin in un pre-riscaldato (37 ° C e media superiore) e agitata vigorosamente.

Per analizzare APD, un'alta concentrazione di blebbistatin (fino a 10 pM) potrebbe essere usato. 13,14,25. Allo stesso modo, se vengono utilizzati ogni farmaco che aumenta la contrazione, si raccomanda ulteriore applicazione di blebbistatin.

In una tecnica alternativa per lo studio del mouse SAN attività elettrica, a bassa risoluzione array multi-elettrodo (64 elettrodi separati in un quadrato di 8 x 8, configurazione con una distanza fra gli elettrodi di 0,55 mm) 26 e le registrazioni di vetro di microelettrodi consecutivi, a breve distanza tra impalements vs. fino a 50 um / pixel per ottici mappatura) e non può essere utilizzato per analizzare AP morfologia o per l'imaging multi-parametrica (quali tensione simultanea e mappatura ottica calcio). Anche se le registrazioni vetro microelettrodi forniscono ulteriori informazioni sul AP morfologia, inclusi i valori assoluti per AP ampiezza e potenziale di riposo, è anche limitata da una bassa risoluzione spaziale. Pertanto, può essere utilizzato solo per la posizione stabile del pacemaker leader e non è applicabile per catturare battito per battito alterazioni nella posizione leader pacemaker. Allo stesso tempo, come dimostrato in precedenza 3,20 e evidenziate nel presente studio, l'OAP co SANnsists di un segnale bifase whichincludes SAN e componenti miocardio AP atriali (Figura 4B). Si rende così difficile estrarre un segnale SAN puro e stimare con precisione AP morfologia nella SAN. A questo scopo, microelettrodi di vetro 17 o l'approccio pinza amperometrica sui miociti SAN isolato devono essere considerati.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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