大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health
Published 1/06/2017
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Biochemistry

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Zalewski, J. K., Heber, S., Mo, J. H., O'Conor, K., Hildebrand, J. D., VanDemark, A. P. Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins. J. Vis. Exp. (119), e54886, doi:10.3791/54886 (2017).

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Abstract

Introduction

X線結晶学を介した構造の決意は、現代生物学のあらゆる分野への根本的な貢献をしてきました。生活とどのように彼らは様々な状況下で互いに対話をサポートする巨大分子の原子ビューを提供します。私たちは、病気を引き起こすメカニズムを理解することを可能にし、合理的疾患を治療するための薬を設計する機会を提供します。結晶学は長い高分子構造を決定するための支配的な実験的手法となっており、現在の構造データベース(www.rcsb.org)の89.3パーセントを占めています。この技術は、非常に高解像度のための潜在的な、サイズの広い範囲、比較的容易なデータ収集、および高分子は、溶媒だけでなく、リガンドと相互作用する方法を視覚化する機会を巨大分子を可視化する機能など、多くの利点があります。

組換えタンパク質発現1,2における数多くの技術の向上にもかかわらず、PURification 3、及びこれらのシステム4、結晶過程における単一の最大の障害物を生成するために使用される分子生物学、回折品質結晶を成長させる能力が残りますこれは、大規模なコイルドコイルドメインを含むタンパク質のために特に当てはまるてきました。すべてのアミノ酸の5%ほどが、この非常に共通の構造的特徴7作り、コイルドコイル内で5,6を発見 、まだこれらのタンパク質は、多くの場合、より多くの困難を精製し、結晶化さ球状タンパク質よりも8-10されていると推定されています。これはさらに、コイルドコイルドメインは、多くの場合、したがって、正しく多くの場合、結晶化のために有害である非構造化またはフレキシブル配列の包含を回避することが重要であり、これらのドメインの境界を予測する、より大きなタンパク質のコンテキスト内で見出されるという事実によって悪化します。

ここでは、Webベースの計算を組み合わせた概念フレームワークは、エクスペリと分析を提示構造研究、そしてどのように準備し、結晶化の試行の前に、タンパク質サンプルを特徴づけるためのタンパク質断片(複数可)を選択する方法:ベンチからリットルのデータは、結晶学的プロセスの初期段階を含むを通じてガイドのユーザーを支援します。私たちは、大規模なコイルドコイルドメインを含む二つのタンパク質に我々の分析に焦点を当てる、マッシュルーム(SHRM)とRhoキナーゼ(ロック)。両者がコイルドコイルドメインを含み、生物学的に関連する複合体11-16を形成すること知られているように、これらのタンパク質を選択しました。マッシュルームとRhoキナーゼ(ロック)は、それぞれ構造的に17-20特徴づけられているそのうちの多くの部分をコイルドコイルの〜200および680残基を含むことが予想されています。ここに記載された方法は、迅速に結晶化やすいであろうコイルドコイル含有タンパク質のフラグメントを同定するための合理化されたワークフローを提供し、しかし、記載された技術は、簡単にほとんどのタンパク質またはタンパク質複合体のために適合さまたは高スループットapproaを組み込むように修正することができますCHESとして利用できます。最後に、これらの方法は、一般的に安価であり、ほぼすべての経験レベルでユーザが実行することができます。

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Protocol

注:概念フレームワークまたはワークフローの図を参考のため、図1に記載されいます。計算または配列に基づく予測、タンパク質の発現および精製、生化学的特徴、および結晶化:プロトコルは、4つの段階に分けることができます。図示の実施例は、マッシュルームSD2ドメインおよび/またはマッシュルーム・ロック複合体を分析するが、任意のタンパク質と共に使用することができます。

1.コイルドコイル領域の境界の計算予測を生成するために、Webベースのツールを設立

  1. シーケンス同族体の進化的に多様なセットを収集します。
    1. www.uniprot.orgに移動し、上部の検索バーにマッシュルームを入力します。
    2. 次の自分のアクセッション番号のボックスをチェックして、ダウンロードするシーケンスを選択します。スターを有する配列はUNIPROTによってレビューシーケンスを示します。一般的に、より信頼性があります。すべての配列が完全かつ正確であることを保証するために注意してください。
    3. 選択されたのを保存[ダウンロード]ボタンをクリックしてequences。
    4. クラスタル-オメガ21(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)を使用して、マッシュルーム配列の集合を合わせます。マッシュルーム配列とファイルを選択し、「参照」ボタンをクリックし、Submitを押してください。
    5. アライメントが完了したら、「位置調整のファイルをダウンロード」ボタンをクリックします。
    6. (ファイルから| |入力アライメントファイル)Jalviewを使用して、1.1.5で生成された複数の配列アラインメントを開きます。新しい整列ウィンドウ、アイデンティティ(|パーセントアイデンティティカラー)による色の中で。
  2. 二次構造の予測、柔軟なまたは無秩序な配列の予測を計算し、目的のタンパク質(複数可)内のコイルドコイル領域を予測しました。
    1. コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。
      注:この分析は、コンプに数時間かかる場合がありますLETE。マッシュルーム配列は非常に大きいので、配列は、ウェブサーバのサイズ制限内に収まるように1,000未満のアミノ酸のブロックに分割される必要があり得ます。 Shrm2を分析する場合には、このセクションでは、コイルドコイル領域を含むことが知られているSHRM SD2ドメインを含むよう千C末端アミノ酸が使用されることが推奨されます。他のタンパク質とのこの分析を繰り返す場合は、可能な場合は、完全長タンパク質配列を使用することをお勧めします。それができない場合は、公知の生化学的または機能的データに基づいてシーケンスを可能な最大の断片を使用するか、または切開。
    2. コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。
  3. マッシュルーム・シーケンスの単一の包括的な注釈に1.2.2へのステップ1.1の結果を結合します。
    注:非常また、任意およびすべての関連する私を含めることが奨励されていますこの段階でのタンパク質の機能または精製についての文献や他のソースから収集することができますnformation。
  4. この総合的な注釈付き配列を使用して、保護を最大化しようとすると、タンパク質のドメイン境界(または可能な境界のシリーズ)を予測し、無秩序または可撓性配列の量を最小限に抑えながら、構造的特徴を予測しました。既知の場合、得られたタンパク質は、目的の機能特性を保持すべきです。

第1節で同定されたドメインの境界2. ExpressとPurifyのタンパク質

注:このセクションの目的は、第1節で生成された架空のドメイン境界をスクリーニングするために迅速かつ簡単に定量化可能な一連のアッセイを使用することです。

  1. 標準的な分子生物学技術を使用して、彼の10 -mRuby2-XH2プラスミド内のフレームにおける所望のコード配列を有する発現プラスミドを生成し(ベクターマップAについては、 図3を参照てくださいND詳細)。
  2. 18-24時間室温で自己誘導培地1にBL21(DE3) 大腸菌または他の適当な発現株を用いて、各発現プラスミドのためのテスト発現レベル。
    1. このような、ここ(https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 1などの細胞に付属または堅牢な形質転換プロトコルを使用して説明書には、次のBL21(DE3)に発現プラスミドと同様に、空のプラスミド対照を変換-変換/)。
    2. たての形質転換プレートから、単一コロニーを選択し、/ mlカナマイシン34μgので溶原性ブロス(LB)培地中で一晩、37℃で5ミリリットルをスターター文化を育てます。
    3. 次の日、文化をペレット化し、新鮮なLBのでペレットを洗浄
    4. 34 / mlのカナマイシンを自動誘導培地50mlにスターター培養物を追加します。文化は、室温または37℃のいずれかで飽和状態に成長することを可能にします。一般的に、18から24時間〜のために成長します。
    5. ペレット細胞sおよび無期限精製前に-80℃で得られた細胞ペレットを凍結します。
    6. 最も効率的に所望の融合タンパク質を産生する株を決定するために、各発現株及びSDS-PAGEによる空ベクター対照からの全細胞抽出物の比較。彼10 -mRuby2-マッシュルームSD2融合タンパク質を、約50分間、又は染料前線がゲル22の底部に達するまで、180 Vで10%SDS-PAGEゲルを実行します。
    7. 各株23内の総細胞タンパク質を可視化するクマシーブルー染色ゲル。
  3. 成功しmRuby2融合タンパク質を発現し、各株に初期アフィニティークロマトグラフィー工程を実行します。一般的に、タンパク質は、4℃で精製などの改変された条件の恩恵を受けるない限り、精製は、室温で2.3.2-2.3.7手順を実行します。
    1. ステップ2.2.5からの細胞ペレットを解凍します。
    2. 溶解緩衝液(10%グリセロール、500mMのNaCl、40 1.5mlの各細胞ペレットを再懸濁mMイミダゾール、20 mMトリスpH8.0の、1mMのβ-メルカプトエタノール)。適切なプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーを補います。
    3. 10mg / mlのリゾチームの30μlを添加して、室温で20分間インキュベートします。楽器のための指示に従って超音波処理は、使用されています。
    4. 不溶性物質または非溶解細胞をペレットに14,000×gで30分間テーブルトップ遠心機で1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に移します。 SDS-PAGEを経由して、その後の分析のために上清とペレットの両方を保存します。
    5. Ni-NTAビーズを100μlで可溶性画分をインキュベート、ニッケルアフィニティー精製を行います。ビーズを混合するために、数回転倒、5〜10分間可溶性溶解液でビーズをインキュベートします。
    6. ビーズをペレット化し、卓上遠心機で30秒間800×gで遠心分離します。非特異的な汚染物質をオフにきれいにする溶解緩衝液でペレット3-5回洗浄することにより、これを従ってください。
    7. 1を補充した溶解緩衝液でビーズからルビー融合タンパク質を溶出Mイミダゾール。
    8. 上記の「間に合わせ」精製に彼-mRuby2-マッシュルームタンパク質の挙動を比較するためにSDS-PAGEを使用してください。

3.有利な特性を持つものを同定するためにタンパク質サンプルを特徴づけます

  1. ルビー融合タンパク質の濃度を測定し、その後、ネイティブPAGEゲル24上に融合タンパク質の1-5μgのをロードすることによって試料の均一性を評価するために、280nmで分光光度計セットを使用します。 175 Vで140分間、4℃で10%ネイティブPAGEゲルを実行します。
    1. 画像mRubyタグ化融合は、このアッセイで移行どこ観察、蛍光を可視化するために装備イメージャーを使用して、ネイティブPAGE。
      注:このタンパク質はおそらく集約されるよう十分でスタックしている融合タンパク質を観察するように注意してください。蛍光イメージャーが利用できない場合、1は、多くの場合、視覚化することができますとRubyの画像に濃縮サンプルはブラックライトの下またはUVライトボックスを有するタンパク質をタグ付けされています。
  2. 安定的に折り畳まれたドメインを同定するための限定分解を実行します。 0.025%ズブチリシンAの5μlを持つミリリットル〜1ミリグラム/でのRuby-SHRM SD2融合の95μLをインキュベート
    1. 各時点での反応からの10μLを除去し、0、0.5、2、5、15、60、及び120分の時点で反応をサンプリングし、15%アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを介して反応の進行を視覚化します。
    2. ステップ2.2.7のようにクマシーブルーで染色し、プロテアーゼ耐性種を識別することができるかどうかを評価します。
  3. 溶液中のこれらのタンパク質の全体的な動作を総合的に評価の中に部分的に精製されたmRuby2-マッシュルーム融合タンパク質の精製効率、ネイティブPAGEでの動作、および限られたタンパク質分解からのデータを統合します。
    1. 適切な機能的アッセイが利用可能である場合(オプション)、この時点での活動をチェックします。

4.コイルドコイルSD2の高品質結晶を生成マッシュルームからドメイン

注:タンパク質は異なる温度、通常は4℃で精製恩恵を受けるない限り、セクション4.1内のすべてのステップは室温で実施されています。

  1. 発現および精製能力の目安として50ミリリットルの増殖を使用して、完全に精製されたサンプルの5-20 mgの達成を目標にmRuby2-マッシュルームSD2の大規模な表現を行います。典型的には、培養2 Lは、適切な出発材料を提供します。 10分間、8000×gでの遠心分離による成長細胞をペレット化した後。
    1. 溶解のためにリゾチームを用いた場合、凍結細胞ペレットのグラム当たりの溶解〜2 mlで使用し、前のように、溶解緩衝液中の2 Lの成長からペレットを再懸濁します。代わりに、ホモジナイザーやフレンチプレスを使用している場合、ペレットの〜8ミリリットル/ gで再懸濁します。 30分30,000×gで遠心分離によって細胞破片をペレット化。
    2. バッチは、Ni-NTA樹脂10mlのを使用して4.1.1からの可溶性画分に結合します。適切な重力カラムに注ぎます未結合タンパク質は切ることができます。
    3. 洗浄は、1 MのNaClを補充した溶解緩衝液で洗浄した溶解緩衝液40mlで3~5回樹脂。
    4. 80 mMイミダゾールを補充した溶解緩衝液40mlで洗浄樹脂。
    5. 1 Mイミダゾールに補充溶解緩衝液40mlでのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を溶出します。手動で4〜10ミリリットル画分に溶出したタンパク質を分画。
    6. 10%SDS-PAGEを用いてのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を含む画分を確認してください。
    7. 適切な画分を透析6-8 kDaのMWCO透析チューブを用いて、15mMのイミダゾール、20mMトリスpH8.0の、1mMのβ-ME、8%グリセロール、250mMの塩化ナトリウム、に(典型的には2-4分画)。融合タンパク質のあらゆる25-50 mgのためのTEVプロテアーゼ1mgを追加します。ゆっくりと攪拌しながら室温で一晩透析。
    8. 反復ニッケルアフィニティー精製は、4.1.2ステップ。 4.1.6へ。彼の10 -mRuby2がバインドされたままになりますしながら、マッシュルームSD2ドメインは現在、非結合画分に残るべきです樹脂および溶出画分に記載されています。クマシーブルーでこの使用して、12%SDS-PAGE染色を確認してください。
    9. 8%グリセロール、100mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール緩衝液を一晩20 mMトリスpHを8.0にマッシュルームSD2ドメインを含有する画分を透析します。
    10. FPLCを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー25を実行し、0.1〜1.0 MのNaClからのNaCl勾配で溶出します。 12%SDS-PAGEを用いて分画を分析します。
    11. スピンコンセントレーター(研究されているタンパク質に応じて、10キロダルトン以上のMWCO)を使用して、ミリリットル/〜0 mgまでのピーク画分を濃縮し、次いでサイズ排除クロマトグラフィー26を実行 、12%SDS-PAGEを介してピーク画分を分析します。
    12. プールのピーク画分および20 mMトリスpH8.0の、50mMのNaCl、2%グリセロール、1mMのβ-ME、および結晶化する前に10mg / mlに濃縮するに透析します。
      オプション:このステップの間の濃度で5μlのサンプルを除去する1、2、5、および10mg / mlのサンプルを濃縮する過程。このステップの間にサンプルの振る舞いを見て、各サンプルのネイティブPAGEローディング2-5μLを実行します。
  2. 結晶化試験のための最適なタンパク質濃度を同定するために12の条件の小さな配列をスクリーニング。これらの状態の組成は、 図7に記載されています。
    1. 蒸気拡散法、ピペッティングを使用して結晶化試験を行い、24ウェルシッティングドロップ結晶化トレイを使用して、最初はうまく溶液1μlとカバースリップ上のタンパク質試料の1μLを含ん滴が続く別々のウェルへの12の条件のそれぞれの500μlの。この技術の詳細については27を参照てください。
    2. 迅速に明確なテープでトレイを密封し、振動の自由で適当な温度制御された環境にトレイを移動します。使用温度は変えることができるが、4°C、16°C、および20°Cは非常に一般的です。
    3. 次の3日間にわたりトレイの低下を調べ100X倍率までの顕微鏡を使用してAYS。 3日間の期間の終了時に、降水(クリア)、光沈殿、豪雨(茶色)、または結晶を含有しないように、各ドロップをスコア。適切なタンパク質濃度はせいぜい6重い沈殿が含まれている必要があります。
    4. 4.2で同定されたタンパク質濃度を用いて、市販の結晶化スクリーンの広い範囲をスクリーニング。また、液滴の誤差を最小限に抑えながら液体処理または結晶化ロボットの使用が大幅にこのプロセスをスピードアップします。これは、ユーザーが単一のサンプルでより多くの条件をスクリーニングすることができ、同様にはるかに少ないタンパク質を必要とします。
    5. 系統的に以前のように24ウェルスクリーニングトレイを用いた結晶化ドロップ内の各変数を変化させることにより、広い画面から特定の初期条件を改善します。

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Representative Results

本システムで利用するワークフローを示す図で、図1に示されており、三つの主要な段階を含みます。配列のコンピューター分析は、関心のコイルドコイルタンパク質のドメイン境界についての仮説を開発するために利用されます。 Shrm2 SD2ドメインの注釈付きの分析の例を図2に示されています。この図では、目標はマッシュルームがSD2と呼ばれる細胞骨格レギュレータのC末端に保存されたドメインのための可能なドメインの境界を同定することでした。この分析から架空のドメイン境界の三つの異なるセットは、結晶化のための最良の候補として終わったC末端付近全体の保存SD2または最小限のフラグメントにまたがるコイルドコイル断片を含む生成されたました。配列解析から同定候補者は、その後すぐにmRuby2でタンパク質融合を使用して、小規模でテストされている( 図3)FO効率的な解析をrの。代表小規模(培養の50ミリリットル)2彼の10 -mRuby2タグ付きタンパク質の精製は、図4に示されています。この図では、不溶性タンパク質の挙動は、その可溶性対応物と比較して容易に明らかです。不十分な発現または不溶性のタンパク質融合を容易かつ迅速に、このように識別されます。限られたタンパク質分解によるタンパク質断片の生化学的分析が記載または単離および精製されたマッシュルームSD2ドメインとRubyのシステムを枯れ使用してフラグメントの様々な図5に示されています。 図5Aに、 図3の仮想のドメイン境界#2、#1に対応するマウスSHRM SD2の二つの変種を、室温で30分間(0-1.0%)からのプロテアーゼ濃度の勾配を用いて消化しました。これらの両方を効果的に適度な酵素濃度における小さな製品の宿主に分解されました。 図5Bは、SAMを示しています電子実験は、 ショウジョウバエ SHRM SD2から仮想的な境界#3を使用して行います。このタンパク質は、結晶化した、その構造は、19に記載されています。上記のプロトコルから生成されるようにRubyの融合物を検査する際にタンパク質分解分析にも役立ちます。 図5Cに示すように、ヒトShrm2 SD2(1427から1610)を有するルビー融合タンパク質を示す時点室温で、非特異的プロテアーゼのサブチリシンの高濃度(0.025%)で消化しました。ここではRubyとSHRMの間のリンカーはすぐに予想されるように切断しました。また、マイナーな製品は、このタンパク質を示す形成された2つの他のプロテアーゼ感受性領域を有し、しかし、2分以内に生成された分解生成物は、タンパク質が実際には非常に安定であることを示す実験の残りの部分で大部分が無傷のままでした。

補完的なアプローチは、ネイティブPAGEのanalysを使用して示されています図6です。 図6Aでは、Rubyのタグを付けた人間SHRM SD2(1427年から1610年)と同様にSHRM内の示された点突然変異を含むタンパク質は、ネイティブPAGEによって分析されています。結晶化しない3変異体は劇的に異なる動作をしながら、この実験では、(結晶を形成する)野生型タンパク質は、二つの別個のバンドとして実行されます。システムはまた、タンパク質複合体に有用であり得ることを実証するために、マッシュルーム・ロック複合体の様々な図6BのネイティブPAGEによって分析しました。この場合、人間Shrm2 SD2の同じフラグメント(1427から1610)は、ヒトロックの異なるフラグメントを利用しながら、分析を明確に支援するために使用されました。このアプローチは、ロック700から906を使用して形成され、746から906は、複数の種を持っていた複合体は、べたつく、少ない均質であることが示唆されました。結晶を形成するのに数週間かかったとコンものの、788から906を利用した複合体ではない劇的いえ、改善された、この種が結晶化することができましたtainedはロックのタンパク質を分解しました。ロック834から913を使用して生成された複合体は、ゲル上の単一の、より均一な種を形成し、容易に一晩結晶化しました。 図7は、結晶化試験でのタンパク質試料の挙動に知らせるために使用される一般的な結晶化条件のセットを示し、そして任意のタンパク質で一般的に使用され得ます。理想的には、明確かつ沈殿させる条件のミックスが得られることになります。多くの条件で沈殿するものがより低いタンパク質濃度で、またはタンパク質の溶解性を促進する緩衝条件で使用されるべきである沈殿物を形成しないタンパク質は、高濃度またはより厳格な緩衝条件を必要とします。

図1
図1: ワークフローダイアグラム。計算の配列解析と生化学の統合を描いた一般図とドメイン境界の輪郭を描く、結晶化のためのタンパク質断片を同定するための包括的戦略に他のウェットラボ技術。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: マッシュルームからのコイルドコイルSD2ドメインの注釈付き配列解析。計算のオーバーレイはCLUSTALオメガによって生成され、Jalview(ステップ1.1)内の配列同一性によって着色多重配列アライメントを含め、マッシュルームSD2ドメインの分析します。また、二次構造、無秩序系列予測、およびマッシュルームSD2ドメインのコイルドコイル予測(ステップ1.2)予測も含まれます。観測された境界線と二次構造がそうであるように架空のドメイン境界(ステップ1.3)が示されていますその後の結晶構造解析19によって明らかにされたように要素。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 彼の10 -mRuby2-発現系の図。 (A)図は、発現ベクターの彼10 -mRuby2-XH2ベクターは、本研究で使用しました。 (B)このベクターの多重クローニング部位の図。タンパク質コード配列は、典型的には、BamHIおよびEcoRIクローニング部位を介してこのベクターに挿入されます。 mRuby2タンパク質の極端なC末端が赤で表示され、TEVプロテアーゼ切断部位は、ブラケットと、赤の三角形として示した切断部位で示されています。 mRuby2およびTEV部位との間のリンカー配列は、シアンに示されています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
4:2 mRuby2の代表的な小規模精製は、融合タンパク質をタグ付けしました。 (A)細菌培養発現ルビーSHRM SD2又は不溶性であることが知られている関係のないRubyの融合タンパク質のサンプルの画像が描かれています。 Rubyのタグなしのタンパク質を発現する別個の文化は比較のために示されています。 (B)上記培養物から可溶性画分は、可溶性のRuby-SHRM SD2の可視化を実証し、30分間30,000×gで、次の溶解および遠心分離を画像化しました。ルビー・SHRM SD2の上に固定されていることを示す結合後のNi-NTAビーズ(C)画像とその後の洗浄工程ビーズ。 (D)は、ステップ2.3.6と2.3.7で説明したように洗浄および溶出段階のサンプルは、効果的にカラムから溶出されるまでの80 mMイミダゾールの存在下で、一方ではRuby-SHRM SD2の融合が樹脂に結合したままであることを実証します1 Mイミダゾール溶出バッファーと。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:異なるマッシュルームタンパク質からの候補SD2ドメインの限定タンパク質分解。様々なマッシュルームタンパク質から4 SD2ドメインの比較。 (AおよびB)示さSHRM SD2断片は0〜1.0%のプロテアーゼトリプシンの濃度勾配を用いてインキュベートし、その結果は、SDS-PAGEにより分析しました。そのタンパク質の断片のウィットの関係hは仮想的な境界が示されています。プロトコールに記載された時間経過法を用いて彼の10 -mRuby2-マッシュルームSD2融合タンパク質の限定されたタンパク質分解消化の(C)SDS-PAGE分析。反応液を室温で0.025%トリプシンで発生しました。 RubyとマッシュルームSD2との間のリンカーの消化は、迅速であり、内部対照として機能します。彼の10 -mRuby2-マッシュルームSD2融合タンパク質と、浄化しを共同推定される分解生成物は、(*)が表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:天然ゲルを用いてタンパク質の挙動の変化を観察します。 mRuby2-Shrooの特性を変化させる変異体の効果を示す(A)10%ネイティブPAGEメートルSD2。 SD2内の示された点変異体は、異常な移動パターンの範囲を表示しながら、これらの条件下でSHRM SD2は、2つの別個のバンドとして実行されます。 (B)ロックの異なるバージョンを使用して形成し、ネイティブPAGEによって分析マッシュルームSD2-岩複合体の比較。マッシュルームSD2とロックキナーゼの示された断片(両方のコイルドコイルタンパク質)との間の複合体は、ネイティブPAGEにより分離しました。結晶は数週間後にロック788から906を含む複合体について得られたが、ロック834から913を含む複合体が急速に結晶化させました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7: 結晶化のためのクイック一次スクリーニング。 (A)一般的な結晶化の共同の迅速な画面nditionsは結晶化試験でのタンパク質試料の挙動を評価するために使用されます。単純なスコアリングマトリクス(B)としては、結晶化の低下を評価します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで説明するプロトコルは、ユーザーが自分の結晶化を促進するために大規模なコイルドコイルタンパク質内ドメインの境界を識別するのに役立つように設計されています。プロトコルは、潜在的なドメイン境界の系列を生成する計算予測と他のソースからのデータの様々な全体的な組み込みに依存しています。これらは、迅速かつ安価であり、さらにこれらの初期の仮説を絞り込むために使用されている生化学的実験のセットが続いています。このアプローチを使用して、ユーザーはすぐに望ましくない潜在的なタンパク質断片を排除し、より良い候補者にもっと注意を集中することにより、結晶を得るの見通しを向上させることができました。

多くの重要なステップは、架空のドメイン境界の初期セットの開発など結晶の製造のためのような重要などれもが、しかし、この技術の中にはありません。このステップでは、情報OBとしてだけでなく、計算の様々なアプローチを取り入れときに利用可能な文献や機能データからtained。ケアは、予測のいずれかに定量化可能な信頼値を取り付ける場所には方法が現在存在しないように、単一の「最良の」ソリューションに至るまで、すぐに磨くために戦略を使用しないように注意する必要があります。その代わりに、最高の迅速に実験的に検証される必要がある可能ドメインの境界の小さなセットを同定するための方法として使用されます。

このプロトコルを用いて分析することができるコイルドコイルタンパク質の特性は非常に広いです。計算の観点からは、コイルドコイル予測の強さは20アミノ酸未満に制限され、ステップ1.2.1で述べたように、コイルドコイル領域が大きく1,000アミノ酸はDISOPREDによる分析のために複数のセクションに分割する必要があります。我々は、それがウェブサーバによって課され、この方法は、将来的にアップグレードされるように変更したりする可能性があり、一時的これ以降の制限を表示します。その後の生化学分析しかし、苦しむことができますさまざまな方法インチまず、プロテアーゼに対する過敏内部ループまたは領域は、サンプルは、それが実際よりも少なく安定であるように見せることができます。プロテアーゼによりループを切断されているか、そうでなければ、ニックの入っている安定したタンパク質はまだユーザーが両方の戦略を探ることが推奨される理由である、ネイティブPAGE上で安定した外観を与える必要があります。ネイティブPAGEは、彼らは非常に長く、ゲル中にゆっくりと移行したり、特定の電荷が作る可能性があるため、彼らは完全にゲルから反対方向を実行しかし、いずれかのために、いくつかのタンパク質のために困難な場合があります。この場合には、ネイティブPAGEゲルシステムの異なる緩衝条件を探索するために有用であり得ます。

ここで提示仕事の焦点は、大コイルドコイル含有タンパク質にされているが、このプロトコルは、非常に少数の適応とほぼすべてのタンパク質のために利用することができます。球状タンパク質のための第一の添加は、このようなpDomTHREADER 28 <としてドメイン予測ソフトウェアの追加になります/ SUP>またはDomPred 29ドメイン境界を探すために、そのようなPhyre2 30などの立体構造予測配列解析の予測力を高めるために。さらに、そこに二次構造予測や無秩序な予測を行うために利用可能な多くのアルゴリズムがあり、追加のアルゴリズムを含めることは有用である可能性があります。球状タンパク質は、多くの場合、酵素活性またはターゲットの選択時に重要な追加情報を提供する他の機能的リードアウトを有します。さらに、中程度または高スループット技術を適宜配合することができます。例えば、96ウェルフォーマットで1〜2ミリリットル文化や金属親和性精製のための安価なシステムが31容易に入手可能です。最後に、最小のサンプルを用いた結晶化実験の多くを設定するためのロボットの使用がルーチンになってきているが、ロボットシステムの効率的な操作は、十分に特徴付けられたタンパク質試料の挙動に基づいています。添加このプロトコルにアルの変更は親和性タグの様々なサンプリング含めることができます。多くの異なる蛍光タグが利用可能である、または蛍光タグが必要または有用されていない場合はHIS-、GST-、チオレドキシン、Strep-、およびMBP-は、利用可能なオプションの数十の一つです。

この手順を実行すると、ユーザーはmRuby2タグが興味のあるユーザーのタンパク質に及ぼす影響に留意する必要があります。異なる融合体の様々なこのタグを使用してからの事例証拠は、複数のクロマトグラフィーの工程を経て結合したままmRuby2は時々、目的のタンパク質に非常に強く結合するという事実をサポートしています。この動作は、明らかに望ましくないが、意図しないRubyの複合体は、通常、分離され及びクロマトグラフィー的に除去することができます。 MBP 32について観察されたようシャペロンのような動作であるかどうかは不明です。

結晶を取得した後、一般的に利益相反に直面している多くの課題が残っていますこのプロトコルでは扱われていない導いたコイルタンパク質。最も一般的には不完全に形成された格子や異方性回折による貧弱な回折品質、のいずれかです。そこ異方性回折33を支援するための場所でツールがあり、これらはいくつかのコイルドコイル構造18,20を解決するための重要なされています。多くの結晶の病状は、したがって、強化された回折特性を有する追加の結晶形を検索することが多いが賢明である、すぐに克服することが、残念ながら困難です。これは、条件の数千のロボットスクリーニングによって促進されます。代替的に、脱水、または34シードとして回折品質を改善するための多くの後、結晶化技術があります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) Rosetta Emd Millipore 70954-3
BL21(DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003
BL21(DE3) Codon Plus Agilent Technologies 230245
Lysozyme Spectrum Chemical Mfg Corp L3008-5GM
Ni-NTA resin Life Technologies 25216
SubtilisinA Spectrum Chemical Mfg Corp S1211-10ML
24 well Cryschem Plate Hampton research HR3-160
INTELLI-PLATE  96: Art Robbins Instruments 102-0001-03
PEG 3350 Hampton research HR2-591
PEG 8000 Hampton research HR2-515
PEG 400 Hampton research HR2-603
PEG 4000 Hampton research HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2 Addgene 49089
Overnight Express Autoinduction System 1 Emd Millipore 71300
Lysogeny Broth powder ThermoFisher Scientific 12795027 

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References

  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189, (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434, (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252, (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137, (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21, (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16, (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23, (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13, (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118, (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281, (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239, (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22, (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3, (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279, (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8, (12), e81075 (2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23, (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6, (3), e18080 (2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28, (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48, (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132, (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280, (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25, (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11, (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10, (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66, (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312, (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, (Pt 9), 1173-1180 (2005).

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