Utilizzando la tecnica di manica in un modello murino di trapianto aortico - un Video didattico

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Summary

Vi presentiamo un modello aortico trapianto ortotopico utilizzando la tecnica di manica in topi. È un metodo molto rapido anastomosi, che possa essere impiegato negli studi della malattia vascolare.

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Rowinska, Z., Gorressen, S., Merx, M. W., Koeppel, T. A., Zernecke, A., Liehn, E. A. Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video. J. Vis. Exp. (128), e54915, doi:10.3791/54915 (2017).

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Abstract

Trapianto orthotopic aortica utilizzando la tecnica di manica riduce la lesione all'aorta con tasso di fallimento di solo 10-20%. Il tempo per anastomotizzare l'aorta nei topi utilizzando il metodo di Manica era breve e facile con una media di 20 min, permettendo studi di iso/allo innesti. Il seguente articolo descrive la procedura di trapianto aortico utilizzata nel nostro laboratorio. I topi sono stati anestetizzati con una miscela di 1,5% volume isoflurano e 100% ossigeno attraverso una maschera. A questo punto, il segmento dell'aorta tra le arterie renali e relativa biforcazione è stato separato dalla vena cava, liberamente preparato e clampedat i segmenti prossimali e distali con una singola sutura seta. Prima della rimozione dell'aorta, una soluzione salina contenente eparina è stata iniettata in vena cava inferiore. L'aorta è stato tagliato tra i morsetti, quindi una soluzione salina eparinizzata era utilizzata per irrigare il lume. La tecnica di manica con suture monofilamento è stata usata per trapianto di aorta addominale nella posizione ortotopica.

Introduction

Come sottolineato in un precedente studio, grande attenzione è stata dedicata ai modelli murini trapianto aortico che permettono la distinzione tra specifiche risposte vascolari causate tramite l'innesto stesso e determinati fattori sistemici connessi con un ambiente di arteriogenica 1 , 2 , 3. il fattore principale che svolge un ruolo cruciale qui è la disponibilità di knockout e transgenici. Loro coinvolgimento in tale modello offre la possibilità di identificare e determinare nuovi percorsi fisiopatologici associati con lo sviluppo della malattia vascolare degenerante, quali aterosclerosi e aneurisma formazione4, 5.

Vale la pena notare che durante l'innesto di un intrinseco ischemia/riperfusione possono comparire lesioni ai vasi destinati al trapianto. Pertanto, il verificarsi di problemi specifici con l'integrità dell'innesto o un'inaspettata reazione infiammatoria durante il periodo post-operatorio non si può escludere eventualmente precludendo cambiamenti patofisiologici in malattie vascolari degenerative3 ,4,5,6,7. Anastomosi manica è il metodo alternativo in fine per anastomosi arteriosa dei vasi con un diametro di meno di un millimetro ed è stato applicato con successo nel trapianto renale e cardiaco in ratti che è stato successivamente adattato per aortica trapianto in topi da altresí et al. 8 , 9 , 10 , 11.

Aortico danni usando la tecnica di trapianto di manica sono ridotto al minimo con un tasso di guasti tecnici molto bassa, a causa di esso dura solo 20 minuti in media. I nostri risultati precedenti hanno dimostrato eccellenti proprietà funzionali e strutturali di un isograft in vivo dopo trapianto usando la tecnica di manica1. Altresí et al descrivere che dopo una breve curva di apprendimento, il tasso di successo è stato oltre il 78%10. Le complicazioni quali trombosi sono rare, ad esempio Engelbrecht et al non ha rispettato la trombosi utilizzando la tecnica di manica nel trapianto renale nel ratto8.

Il modello murino trapianto aortico con manica anastomosi è uno strumento rapido e facile per studiare le reazioni di iso/del documento non autografo nel vaso trapiantato. Questo video illustra la procedura di trapianto aortico effettuata nel nostro laboratorio. Questo modello di trapianto può essere utile nel definire i meccanismi patologici della malattia degenerativa vascolare e può contribuire a un'ulteriore valutazione di interventi farmacologici e molecolari12.

Protocol

procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.

Nota: la procedura è dimostrata utilizzando topi adulto maschio wild type con sfondo CD1. Tenere i topi in un'unità di laboratorio specializzato prima e dopo l'intervento chirurgico, assicurando il corretto accesso al cibo, controllo veterinario specializzato ed il trattamento. Se gli animali vengono acquistati all'esterno, consentono una settimana acclimatazione prima di eseguire chirurgia.

1. preparazione del donatore

  1. utilizzare materiali sterili e strumenti per mantenere condizioni di sterilità durante la chirurgia per evitare infezioni.
  2. Anestetizzare ogni mouse con una miscela di 1,5% di volume isoflurano e 100% ossigeno attraverso una maschera. Posare il mouse su una piattaforma nella posizione supina e nastro tutte le sue gambe al tavolo operatorio. Controllare i suoi riflessi pizzicando le zampe posteriori per essere sicuri che il mouse è sufficientemente anestetizzato. Posto unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.
  3. Rimuovere tutti i capelli dall'addome utilizzando un gel depilatorio o utilizzare un rasoio. Eseguire l'operazione in condizioni di sterilità. Disinfettare l'addome con alternanza di scrub di clorexidina e acqua sterile.
  4. Rimuovere l'aorta del donatore attraverso un'incisione addominale del midline con forbici o bisturi. Ritrarre l'intestino manualmente a destra. Delicatamente manualmente riflettono gli intestini sopra al lato utilizzando guanti senza polvere.
    1. Posizionare l'intestino su un pezzo di garza imbevuto di soluzione fisiologica per mantenerla umida.
    2. Distanza sezionare l'aorta addominale molto attentamente dal tessuto circostante utilizzando una dissezione smussa con una pinzetta.
    3. Separare il segmento dell'aorta tra le arterie renali e relativa biforcazione dalla vena cava con le pinzette.
    4. Secure tutti i piccoli rami di questo segmento molto attentamente, usando filo di sutura singola 11-0 monofilamento.
    5. Prima di rimuovere l'aorta, iniettare 0,5 millilitri (mL) di soluzione fisiologica contenente 50 U di eparina in vena cava inferiore.
    6. Lasciare l'animale donatore prosciugare dopo il segmento dell'aorta è stato rimosso.
    7. Sciacquare l'innesto completamente con soluzione fisiologica e poi trasferirlo immediatamente a un contenitore di soluzione salina ghiacciata.

2. Preparazione del destinatario

  1. anestetizzare l'animale destinatario con una miscela di 1,5% di volume isoflurano e 100% ossigeno attraverso una maschera, quindi rimuovere i capelli e disinfettare (sezione 1). Praticare un'incisione della linea mediana al xifoideo al bacino con un bisturi e ritrarre le pareti addominali. Posto unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.
  2. Avvolgere le viscere in soluzione salina inumidito garza e spostare molto delicatamente all'animale ' destra di s.
  3. Dissezionare l'aorta di infrarenal libero tra le arterie renali prossimalmente e la biforcazione distalmente con pinzette.
  4. Secure tutti i piccoli rami di questo segmento molto attentamente, usando filo di sutura singola 11-0 monofilamento.
  5. Morsetto le porzioni prossimali e distali dell'aorta con una sutura in seta singolo 6-0.
  6. Dividere l'aorta a metà tra i morsetti e irrigare le estremità tagliate con soluzione fisiologica eparinizzata per irrigare il lume aperto.
  7. Inserire l'innesto in posizione ortotopica con l'estremità di vaso d'alimentazione inserito nella nave ricevente seguita da sutura con 11-0 monofilamento avendo cura di evitare qualsiasi torsione dell'aorta allineando correttamente il donatore ed il destinatario ( Figura 1) 10.
  8. rilasciare con attenzione le legature dopo aver condotto un'ispezione dell'anastomosi. Rilasciare prima il morsetto distale. Questo si traduce in bassa pressione che tiene le pareti insieme prima di rilasciare il lato ad alta pressione prossimale.
  9. Irrorare l'innesto immediatamente e controllare per un impulso visibile. Rimuovere delicatamente i resti della seta. La lunghezza di sovrapposizione ottimale tra donatore e destinatario dell'aorta è 1-2 mm.
  10. Restituire il contenuto addominale alla cavità addominale e chiudere tutta la ferita con un suturare di acido poliglicolico 3-0 corrente.
  11. Dare la buprenorfina mouse (0,05 mg/kg di peso corporeo per via sottocutanea (SC)) prima di terminare l'anestesia.
  12. Non lasciare incustodito un animale fino a quando non è pienamente cosciente. Gestire il dolore terapia con buprenophine 0,05 mg/kg di peso corporeo somministrato SC tre volte al giorno per tre giorni dopo l'operazione come approvato dall'organismo di vigilanza istituzionale.
  13. Per tessuto raccolta, anestetizzare i topi destinatari come descritto sopra e a filo i vasi con tampone fosfato salino (PBS) seguirono da 4% formaldeide/PBS, (pH = 7,4) dalla puntura cardiaca. Rimuovere delicatamente gli innesti. Dopo la fissazione durante la notte in 4% formaldeide/PBS, processo esemplari maggiori e incorporare nella paraffina.

Representative Results

I topi hanno recuperato dall'anestesia entro 15-30 min con nessun danno fisico osservato, anche se c'era un rischio elevato di trombosi. Analisi ad ultrasuoni è stato utilizzato durante postoperatoria di follow up. I topi wild-type utilizzati nello studio non hanno esibito cambiamenti nelle dimensioni del loro lume. Di conseguenza, sono state osservate le stenosi né formazioni aneurismatiche. Gli animali di trapianto non è riuscita ad esporre lo sviluppo della placca delle pareti dei vasi (Figura 2).

Le procedure di colorazione convenzionali come immunohistology possono essere utilizzate per determinare la targa, modello delle cellule del muscolo liscio e l'accumulazione dei macrofagi. Nel nostro studio l'istologico e la macchiatura di immunohistochemical era eseguita 6 settimane dopo l'innesto per verificare l'integrità dell'innesto. Macchiatura istologica (ematossilina ed eosina (lui) e immunoistochimica (actina del muscolo liscio (SMA) e dei macrofagi (MAC2)) (Figura 3) ci ha mostrato invariati i modelli di distribuzione delle cellule di muscolo liscio, fodera intatta delle cellule endoteliali e no accumulo di cellule nell'intima. Questi risultati indicano che nessuna attivazione significativa lesione o delle cellule è stato rilevato nei vasi innestati (Figura 3).

Figure 1
Figura 1 : Manica tecnica. L'aorta addominale è stato trapiantato utilizzando la tecnica di manica. In questa procedura, dell'aorta del donatore è stato disposto nella posizione ortotopica con punture superficiali presenti nel vaso d'alimentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Intraoperative e immagini ecografiche. Esempi di visualizzazione intraoperatoria (autopsia) degli innesti 6 settimane dopo trapianto (A), l'ultrasuono tridimensionale (B) e B-modalità di visualizzazione (C). Il follow-up postoperatorio è stata condotta facendo uso dell'ultrasuono. Le immagini mostrano la pervietà dell'innesto con nessun cambiamento nelle dimensioni del lume. Inoltre, sono stati osservati senza stenosi o formazioni aneurismatiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Istologica e immunoistochimica immagini. Le immagini rappresentative istologiche e immunoistochimica di animali trapiantati a 6 settimane dopo il trapianto. Nessun lesioni significative sono state osservate in aorte trapiantati dall'istologia (ematossilina ed eosina, egli, 100 ingrandimenti, barra della scala = 50 µm), immunoistochimica (SMA di actina del muscolo liscio (rosso), o del macrofago MAC2 (verde), 200 X ingrandimento, scala bar = 25 µm). I nuclei erano Counter-macchiati di DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Prima di questo studio diversi altri modelli di trapianto in topi sono stati accuratamente analizzati3,6,7,10,13,14. Il modello di trapianto aortico usando la tecnica di manica con modifiche di altresí et al è stato selezionato come e ' abbinato ai nostri criteri e hanno mostrato un'elevata affidabilità dell'anastomosi manica rispetto ai metodi convenzionali-to-end sutura 1 , 10.

Questa tecnica è favorevole in molti modi con tempo di cross-clamp notevolmente ridotto riducendo al minimo i danni all'aorta durante la chirurgia. Oltre ad evitare una potenziale mancata corrispondenza nel calibro di nave tra il donatore e il ricevente è stata osservata una bassa incidenza di trombosi. Le osservazioni di cui sopra rendono questa tecnica altamente adatto per indagare la malattia vascolare nei trapianti aortici nei topi.

In uno studio di follow-up in cui l'ecografia è stata effettuata 8 settimane dopo il trapianto, senza i cambiamenti significativi sono stati rilevati. Questo confermato le ipotesi che eventuali danni all'aorta durante la chirurgia sarebbe minima1.

La procedura d'innesto presentata in questo articolo non garantisce nessun danno sia per l'integrità dell'innesto e la sua funzione. Pertanto, si può concludere che questo modello sperimentale di trapianto può servire come uno strumento prezioso per le indagini molecolari e farmacologici futuri della malattia degenerativa del vaso in topi geneticamente modificati.

Noi crediamo che la video guida può funzionare come materiale che illustrano l'utilizzo di questo semplice modello di artero-arteriosa di insegnamento e che ciò contribuirà ulteriormente fecondo dibattito su molte questioni importanti nella patologia vascolare. Questo metodo di anastomosi molto rapido può essere utilizzato per studiare la malattia vascolare in topi geneticamente modificati. Può anche essere utilizzato come una modifica nel modello aneurisma combinato con trapianto.

Ci sono punti critici durante la procedura. L'immissione della sutura stessa è la fase più critica. Il chirurgo deve aver cura di evitare qualsiasi torsione dell'aorta da un allineamento corretto del donatore e del ricevente. I morsetti vengono accuratamente rimossi dopo l'ispezione dell'anastomosi. Il morsetto distale dovrebbe essere rilasciato sempre prima con conseguente bassa pressione che tiene le pareti insieme prima del rilascio di lato ad alta pressione prossimale. La conseguenza di non correttamente seguendo la sequenza di rilascio sarebbe essere sanguinamento.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Roma Wieczorek e Peter Kurdybacha per la loro eccellente assistenza editing e Leon Decker e Uli Heuter per la loro eccellente assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Halsey Needle Holder Fine Science Tools 12001-13
Dumont #5 Forceps - Fine Science Tools 11254-20
Lexer-Baby Scissors Fine Science Tools 14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder Fine Science Tools 12060-01
Vannas Scissors Aesculap, Germany Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps Geuder, Germany 19015
6-0 silk black (Silk) Deknatel, Research Triangle Park NC, USA 18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon) Ethicon, Norderstedt, Germany EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) Serag-Wiessner, Naila, Germany 60203214
Isofluorane Any genericon
Heparin Any genericon
0.9% saline Any genericon
Buprenorphine Any genericon
Bepanthene eye and nose cream Bayer, Germany
Microscop Zeiss Opmi MDO/S5
Vaporiser Eickemeyer TEC3
Ultrasound Vevo, Canada 770,2100

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References

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