Élaboration d'un modèle de coiffage pulpaire direct pour l'évaluation des pulpaire Wound Healing et Formation reconstructrice Dentin chez la souris

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Summary

Nous décrivons une méthode étape par étape de réalisation coiffage pulpaire direct sur les souris des dents pour l'évaluation de la cicatrisation pulpaire et la formation de dentine réparatrices in vivo.

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Song, M., Kim, S., Kim, T., Park, S., Shin, K. H., Kang, M., Park, N. H., Kim, R. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. J. Vis. Exp. (119), e54973, doi:10.3791/54973 (2017).

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Abstract

Protocol

Les souris ont été achetées auprès de Jackson Laboratory et conservés dans un vivarium exempt d'agents pathogènes dans la Division UCLA de médecine de laboratoire animale (DLAM). Les expériences ont été effectuées selon les directives institutionnelles approuvées du Comité de la recherche animale du chancelier (ARC N ° 2016-037).

1. Souris Anesthésie

  1. Utilisez huit semaines vieille souris C57 / BL6 femelles (n = 3).
  2. Anesthésier les souris en utilisant de la kétamine (80 à 120 mg / kg de poids de souris) / xylazine solution (5 mg / kg de poids de souris) et à administrer par voie intraperitoneale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
  3. Préparer la kétamine (80-120 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) des solutions et les administrer par voie intrapéritonéale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
  4. Vérifiez que les souris sont complètement anesthésiés en effectuant une pincée d'orteil.

2. Procédure de coiffage pulpaire

  1. Placer le porte-embouchure dans la bouche de la souris.
  2. Fixer le porte-bouche sur la table telle que la luiannonce est orientée vers le haut.
  3. Placer le microscope (10X) au-dessus de la bouche de sorte que la première molaire du maxillaire est entièrement visible.
  4. Utilisation du ¼ de tour bur dans une pièce à main haute vitesse à 200 000 rpm, retirer la partie de l'émail de la dent dans le milieu jusqu'à ce que la pâte est visible à travers la dentine transparente. Ne pas exposer la pulpe avec le bur.
  5. L'utilisation d'un endodontique K-fichier # 15 (diamètre de 150 um), perforent par la dentine et d'exposer la pulpe.
    NOTE: Des précautions particulières doivent être prises pour que les débris de dentine ne soit pas poussé dans la pâte. Ceci peut être évité en faisant tourner le K-file trimestrielle, puis en tirant le K-déposer sur.
  6. Mélanger MTA avec H 2 O stérile conformément aux instructions du fabricant. Livrer et placez le MTA sur la pulpe exposée à la pointe de l'explorateur. Utilisez le côté arrière du point de papier (fine) pour emballer le MTA dans la pulpe exposée en tapotant doucement. Le côté le plus épais du point de papier est plat et permet doncpour la bonne condensation du MTA dans la pulpe exposée.
  7. Graver la dent pendant 15 s en plaçant l'agent d'attaque d'acide phosphorique à 35%, où elle couvre juste la dent. Prendre des précautions particulières afin de limiter le placement de l'agent d'attaque, car il peut irriter les tissus gingivaux.
    Remarque: le réactif d'attaque est dans une seringue et est utilisée pour rendre rugueuse la surface des dents de telle sorte que les adhésifs dentaires peuvent circuler pour médier la liaison micromécanique sur la dent. Parce qu'ils sont visqueux, il peut être autonome en appliquant de petites quantités directement sur la dent.
  8. Utilisez aspiration négative sous pression pour enlever le décapant. Utilisez une boulette de coton qui est légèrement imbibé d'H 2 O pour éliminer les résidus de la gravure. Répétez cette étape jusqu'à ce que la gravure est complètement retiré de la dent.
  9. L'utilisation d'un dépoussiéreur à air comprimé, sécher délicatement la dent.
  10. Appliquer les adhésifs dentaires à l'aide de l'arrière du point de papier.
  11. Faire la couche adhésive mince en utilisant l'air comprimé pendant 3 s.
  12. Cure les adhésifs dentaires pour 20 s à l'aide de l'unité de durcissement-lumière.
  13. Placer le composite fluide en petites quantités sur la dent qui a été coiffé avec MTA. Utilisez la pointe de l'explorateur à couler le composite dans les rainures des dents.
  14. Cure le composite pendant 30 s en utilisant une unité de photopolymérisation à polymériser. Vérifiez que le composite est complètement guéri et en utilisant l'explorateur dur.

3. Post-op Soins

  1. Administrer le carprofène (5 mg / kg) par voie sous- cutanée (sc) immédiatement après la procédure de pâte de coiffage.
  2. Placez la souris sur un coussin chauffant à faible puissance pour garder les animaux au chaud avant qu'ils ne se réveillent.
  3. Retour les souris au vivarium pour le logement.

4. Tissue Procurement

  1. Après 5 - 6 semaines euthanasier les souris par dislocation cervicale sous une condition d'anesthésie avec l'isoflurane.
  2. Retirez délicatement le maxillaire hors de la base du crâne et le mettre dans un tube de 50 ml. Fixer le entire maxillaires qui contient à la fois de la dent de la pâte à coiffe et la dent non coiffé controlatérale dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4, à 4 ° C pendant une nuit, puis la stocker dans une solution d'éthanol à 70%.
    NOTE: Le paraformaldéhyde est toxique et cancérigène. L'utilisation appropriée paraformaldéhyde doit être surveillé comme indiqué dans les procédures d'utilisation normalisées (SOP).
  3. Balayez les maxillaires de souris à l'aide de l'analyse μCT. Pour sécuriser les maxillaires lors de la numérisation, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les placer dans le tube de culture de cellules de 15 ml.

5. μCT Numérisation

  1. Préparer les échantillons pour la numérisation μCT. En bref, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les fixer dans 15 ml de culture cellulaire tube conique générique. Monter le tube sur la scène de balayage μCT, comme indiqué dans les instructions du fabricant.
  2. Réglez la source de rayons X à un courant de 145 uA, une tension de 55 kV, et un temps d'exposition de 200 ms.
  3. Effectuer l'acquisition d'image avec le scanner μCT à une résolution de 20 um et avec un Al filtre de 0,5 mm.
  4. Reconstruire l'image et le visualiser 11.
  5. Une fois l'analyse de μCT est terminé, commencer décalcification avec 5% d'EDTA et 4% de saccharose dans du PBS (pH 7,4) pendant 2 semaines.

6. Traitement des tissus et Coloration

  1. Incluez les tissus décalcifiés dans la paraffine. Avant l'intégration, de l'assiette du maxillaire en faisant une coupe sagittale immédiatement antérieure à la première molaire. Bien que l'insertion, la position de cette surface vers le bas, de telle sorte que la section longitudinale de la première molaire est la surface de coupe.
  2. Utilisation du microtome, préparer 5 lames um d'épaisseur. Les zones de pâte de coiffage coïncident généralement avec la racine distopalatal (DP), qui peut être utilisé comme point de repère. Déterminer la zone précise d'intérêt en examinant l'histologie au microscope optique et en comparant les images μCT.
  3. Pour coloration H & E, Deparaffinize et réhydrater les lames avec du xylène (2 fois) et de l'éthanol dilué en série (EtOH 100% 2 x, 95% de EtOH 2x et 70% de EtOH 1 x).
  4. Rincer les lames avec de l'eau courante du robinet.
  5. Colorer avec une solution hématoxyline pendant 2,5 minutes et rincer à l'eau du robinet.
  6. Plonger les lames dans 95% d'éthanol pendant 1 min.
  7. Colorer avec une solution éosine pendant 1 min et rincer à l'eau du robinet.
  8. Déshydrater avec de l'éthanol dilué en série (70% de EtOH 1x, 2x EtOH à 95% et 100% de EtOH 3x) et du xylene (3 x).
  9. Monter les lames avec une solution de montage.

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Representative Results

Ici, nous avons montré les procédures étape par étape pour effectuer le coiffage pulpaire sur souris des dents. L'un des aspects clés de coiffage pulpaire chez la souris est d'avoir l'appareil approprié. A cet égard, comportant le microscope avec un grossissement de 10X puissance est essentielle (figure 1A). Pour créer une préparation de classe I comme dans la dent, nous avons utilisé une fraise ¼ tour dans une pièce à main haute vitesse électrique à 200.000 tours par minute (figure 1B). En variante, tous les autres moteurs, y compris ceux qui utilisent de l'air comprimé, peut être utilisé pour préparer une dent.

Dans la figure 2A-2E, étapes représentatives pour effectuer le coiffage pulpaire sont présentés. La préparation de classe I-like a été réalisée (figure 2B). Parce qu'un jet d'eau peut noyer les souris au cours de la procédure, son utilisation est déconseillée. Pour cette raison, il est essentiel de préparer la dent avec douceur et intermittent coups pour éviter la surchauffe. L'utilisation de l'air comprimé est également recommandé de fournir des effets de refroidissement. Bien que l' exposition de la pâte avec un fichier endodontique, prenez soin de ne pas pousser les débris de dentine dans la pâte, car cela pourrait interférer avec l'interprétation des données dans réparatrices formation de dentine (figure 2C). Ceci peut être évité en utilisant l'air comprimé. De même, le MTA doit être placé sur la pulpe exposée sans pousser trop loin dans la pâte. Placement MTA peut être réalisé en utilisant l'arrière du point de papier avec tapotements doux (Figure 2D). Après le placement du MTA, la dent doit être nettoyée à l' aide de H 2 O boulettes de coton imbibés pour éliminer tout MTA restant dans les rainures, qui peuvent interférer avec la liaison du composite sur la dent. les méthodes conventionnelles de restauration composite sont utilisées, notamment la gravure des surfaces de dents, l'amorçage et le collage avec des adhésifs, et de mise en place et le durcissement des composites à faible viscosité (Figure 2F).

Six semaines après le coiffage pulpaire, les souris ont été récoltées, et la vue de dessus a été photographié pour confirmer que le composite était encore intact (figure 3A). balayage μCT a montré une récession significative de l' espace pulpaire dans le groupe de la pâte à coiffe (figure 3B), ce qui suggère que la dentine réparatrice a été formé dans la pâte. Les échantillons de tissus ont été soumis à décalcifiées coloration H & E pour examiner plus histologiquement la formation de la dentine réparatrice in vivo. Dans le groupe témoin, les couches odontoblastiques (OB) étaient bien en évidence évidente sur les bords de la dentine (figure 4A - 4C). En revanche, le groupe de coiffage pulpaire avait des quantités importantes de dentine réparatrice (RD) formée dans l'espace pulpaire (figure 4D - 4F). Fait intéressant, un examen plus approfondi a révélé que la dentine réparatrices (RD) présentait une caractéristique typique de la dentine (par exemple, s lignes triated représentant tubules, flèche rouge), ainsi que celle de l' os (par exemple, ostéocytes représentant ostéoblastes piégés, des pointes de flèches noires). Quand nous avons coloré pour dentinaire protéine de matrice 1 (DMP1), un marqueur pour la différenciation odontogène 12, nous avons constaté une augmentation significative de l'expression de DMP1 dans la pulpe de la dent de la pâte coiffés par rapport à celui de la dent non coiffé (figure 5A et 5B) , indiquant que la dentine réparatrice a été formé au sein de la pâte.

Figure 1
Figure 1: Le programme d' installation de l' équipement pour la procédure Pulp coiffage. (A) un microscope (10X) pour la visualisation de la dent de la souris. (B) La pièce à main à grande vitesse et le moteur à un moteur électrique pour la préparation d' une préparation de classe I afin d' exposer la pâte à papier.= "_ Blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Étapes de représentation dans la procédure de capsulage. (A) de la dent sur Unprepared la première molaire du maxillaire chez une souris. (B) l' élimination de l' émail initial utilisant le bur quart de tour. (C) l' exposition de la pâte à l' aide du fichier endodontique. (D) MTA placement dans la pulpe exposée. (E) de placement de restauration composite sur la dent. La barre représente 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Présentation clinique et μCT Scanning de la Dent Pulp-capped et Uncapped chez la souris. (A) Vue occlusale des maxillaires de la souris sur la dent de la pâte à coiffe ( à gauche) et la dent non plafonné ( à droite). (B) Les images μCT en coupe transversale des maxillaires. La barre représente 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Preuve histologique de formation reconstructrice Dentin In Vivo. (AC) coloration H & E de la première molaire maxillaire non plafonnés dans une souris à 100X, 200X et 400X. (DE) coloration H & E de la première molaire maxillaire de la pâte à coiffe dans une souris à 100X, 200X et 400X. La barre représente 100 um (OB = odontoblastiques couches; RD = dentine réparatrices; pointes de flèches noires =ostéocytes; flèche rouge = tubules dentinaires). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Coloration immunohistochimique de DMP1. (A) DMP1 coloration de la première molaire maxillaire non plafonnés dans une souris à 400X. (B) DMP1 coloration de la première molaire maxillaire de la pâte à coiffe dans une souris à 400X. La barre représente 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

À l' heure actuelle, il existe plusieurs modèles expérimentaux disponibles pour valider les effets in vivo des matériaux dentaires, échafauds, ou des facteurs de croissance sur la différenciation odontogène des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) 13. Ces modèles comprennent une transplantation autologue de ectopique DPSC dans un organe tel que la capsule rénale, ou d'une transplantation sous - cutanée dans des souris immunodéprimées DPSC avec échafauds 14,15. Cependant, ces méthodes sont limitées par le fait que leur effet sur odontogène DPSC n'a pas été réalisée dans le milieu de pâte orthotopique. D'autre part, la transplantation orthotopique dans les procédures de pâte à papier ou de pâte à papier sur une dent capsulage sont utilisés dans les grands animaux 16,17. Bien que ces modèles sont utiles dans l'évaluation du potentiel odontogène orthotopique dans l'environnement, l'utilisation de ces modèles est en grande partie d'observation dans la nature, donnant un aperçu mécanistes limitées sur la cicatrisation de la plaie la pâte et la formation de la dentine réparatrice. Dans cet article, nous présentons une méthode détaillée pour effectuer coiffage pulpaire chez la souris. Cette procédure étape par étape comprend anesthésier les souris, la préparation de la cavité de classe I analogue, en plaçant les matériaux de pâte de coiffage, la récolte des maxillaires, l'analyse avec le μCT balayage, et en évaluant les échantillons de tissu pour la formation de la dentine réparatrice. Notre modèle de souris coiffage pulpaire jouera un rôle dans l' étude des mécanismes moléculaires fondamentaux de la cicatrisation de la plaie pulpaire in vivo dans le contexte de la dentine réparatrice en permettant l'utilisation de souris transgéniques ou knock - out, qui sont largement disponibles dans le milieu de la recherche.

Des études récentes ont démontré plusieurs modèles de souris dans lequel la formation de dentine a été observée 18,19. Saito et al. créé une préparation de classe I-like sans exposition de la pâte, ce qui stimule réactionnaire, non réparatrices, la formation de la dentine. Les deux dentine réactionnaire et dentine réparatrices sont classés comme dentine tertiaire, Qui forme après une stimulation externe à la dent. Cependant, contrairement à la dentine réactionnaire, qui est formé par les odontoblastes existantes, la dentine réparatrices est formé par les cellules odontoblastiques-like, comme DPSC, lorsque la pâte est exposée et les couches odontoblastiques ne sont pas respectées 20. Par conséquent, il ne constitue pas un procédé de pâte de coiffage réelle dans la clinique. Dans une autre étude, verre ionomère a été utilisé pour limiter l'exposition de la pâte 19. Cependant, une étude clinique a montré que le verre ionomère a induit une inflammation chronique, mais pas 21 dentine réparatrice. À cet égard, notre modèle de souris coiffage pulpaire représente mieux le mode opératoire de la pâte de coiffage réelle chez les patients.

Il est à noter que , lorsque nous avons récolté des souris après plus de 6 semaines, la formation de dentine réparatrice a eu lieu tout au long de la chambre pulpaire et les canaux radiculaires (figure 4). Une telle observation est assez inattendu, comme nous l'avions prévu la formation de dentine réparatrice au juinction entre le matériau de la pâte de coiffage et de la pâte à papier. Cependant, la minéralisation efficace de la pâte est également observée dans les milieux cliniques, en particulier dans 22 des patients relativement jeunes. Parce que les 8 semaines d'âge des souris utilisées dans cette étude sont considérés comme des «jeunes adultes» 23, il existe une possibilité selon laquelle ces souris recèlent encore un potentiel odontogène significatif. Par conséquent, il serait utile d'examiner les effets du vieillissement de la formation de dentine réparatrices chez la souris.

Nos examens histologiques ont révélé que, bien que la dentine réparatrice a clairement été formée dans la dent de la pâte à coiffe, il y avait des caractéristiques de la dentine et la formation osseuse, comme en témoigne la présence de tubules (flèche rouge) et ostéocytes (têtes de flèches noires) dans le réparatrices dentinaire (figure 5). Ces observations suggèrent que la formation de la dentine réparatrice peut être induite par résidant localement les cellules souches de pulpe dentaire odontoblaste analogues, ainsi que infiltrating de cellules souches mésenchymateuses à partir de l'os environnant.

Par rapport aux cellules de dentine formant, nous avons trouvé aucune cellule dentinaires résorbant au sein de la pâte, telle que déterminée par la phosphatase acide résistant au tartrate (TRAP) Coloration (données non présentées). En effet, l' inflammation pulpaire ou périapicale induit la formation d'ostéoclastes sur la surface de l' os autour de la dent, mais pas sur les surfaces de dentine en raison de la non encore inconnu des mécanismes 24. Fait à noter, il y avait une ligne de démarcation claire entre la dentine existante et la dentine réparatrices nouvellement formé (figure 4). Une étude antérieure a démontré un phénomène similaire; lorsqu'une dent est extraite en présence d' un bisphosphonate ou d'un anticorps anti-RANKL, lesquels inhibent les fonctions des ostéoclastes, il y avait des délimitations nettes entre l' os lamellaire existants et nouvellement formé os réticulaire 25. Cette notion supporte en outre l'absence de cellules résorbant dentinaires dans la pâte. Collectivement, notre modèle de souris établie serait pournir des occasions uniques pour examiner les mécanismes de guérison de la plaie la pâte et la formation de dentine réparatrices in vivo.

Il existe une limitation dans le modèle de souris de pâte de coiffage. makeups génétiques entre les humains et les souris sont clairement différentes. Le génome complet a été séquencée chez les humains et les souris, et il y a environ 85% de similarité dans les régions codant pour des protéines entre les souris et les humains 26,27. En ligne avec cette notion, il a été suggéré que les conclusions relatives à coiffage pulpaire chez les animaux ne reflètent pas nécessairement celles de l' homme 28. Néanmoins, les modèles animaux sont largement utilisés dans la communauté des chercheurs de récapituler maladies humaines in vivo, telles que l' arthrite induite par le collagène de la polyarthrite rhumatoïde 29, la perte osseuse induite par ovariactomy-ostéoporose 30, lipopolysaccharide (LPS) l' administration de choc systémique 31 et ligatures placement pour parodontite 32. En tant que tel, le mou de coiffage pulpairemodèle se sera essentiel d'examiner les mécanismes moléculaires de la cicatrisation de la plaie la pâte et la formation de dentine réparatrices in vivo. Néanmoins, tout comme les autres modèles animaux, l'interprétation et la validation des résultats du modèle de souris coiffage pulpaire doit être soigneusement évaluée.

En résumé, l'étude actuelle démontre la pâte réussie de coiffage chez la souris. Contrairement à d'autres modèles connus, ce modèle de souris coiffage pulpaire fournira un précieux outil de recherche dans le domaine de la pâte régénération et la formation de dentine réparatrice, car il fournit: 1) la possibilité d'utiliser des souches largement disponibles de souris génétiquement modifiées pour élucider les mécanismes sous-jacents à la niveau moléculaire et 2) d'une manière économiquement efficace pour obtenir des résultats statistiquement significatifs en augmentant la taille des échantillons. D' autres études attendent, y compris la quantification objective de la formation de dentine réparatrices in vivo, les effets dépendant de l' âge de la formation de dentine réparatrices, évaluation de matériaux de pâte de coiffage cliniquement disponibles, et la validation des déterminants moléculaires qui sont nécessaires pour une bonne cicatrisation de la plaie pulpaire et réparatrices régénération de la dentine.

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Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par R01DE023348 (RHK) à partir de NIDCR / NIH et la Subvention Faculté de recherche (RHK) du Conseil de la recherche du Sénat académique de la Division de Los Angeles de l'Université de Californie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BM-LED stereo microscope MEIJI Techno Microscope 
Optima MCX-LED  Bien Air Dental 1700588-001 Electic motor engine
isoflurane Henry schein animal health NDC 11695-0500-2
1/4 round bur Brasseler 001092T0
Endodontic K-file Roydent 98947
ProRoot MTA Dentsply PROROOT5W MTA
Paper point Henry schein 100-3941
Ultra-Etch Ultradent product Inc. Phosphoric acid etchant
OptiBond SoloPlus Kerr 29669 Adhesives
Coltolux LED Coltene/whaledent Inc. C7970100115 Curing light unit
Characterization tint Bisco T-14012 Flowable composite
Skyscan Breuker 1275 uCT scanner
Microm Thermo HM355S Microtome
Hematoxyline-1 Thermo Scientific 7221
Eosin-Y Thermo Scientific 7111
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-16 Mounting solution

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References

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