셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

Developmental Biology

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Summary

면역과 (조골 세포에 특정) 2.3Col1a1-GFP 하나 하나 (뼈 세포에 특정) : 우리는 두 / Cre 호텔이 마우스를 (특히 연골 세포에서 발현) (보편적으로 모든 세포에서 발현) Rosa26의 tdtomato의 조합을 추적 세트를 개발했다. 데이터는 골 연골 세포로의 직접적인 변환을 보여준다.

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Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

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Abstract

셀 혈통 추적 시스템이 발달 생물학 연구에서 주로 사용되어왔다. Cre 호텔 재조합 효소의 사용은 특정 세포주 모든 자손의 리포터의 활성을 허용한다. 여기, 우리가 연골 세포를 직접 긴 뼈와 Cre 호텔, Col10a1-Cre 호텔과 Aggrecan-Cre 호텔 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2) 두 종류를 사용하여 하악 외과 개발 과정에서 조골 세포와 골 세포로 변형을 입증하는 기술을 추적 세포 혈통을 사용 Rosa26 교차 tdTomato. Col10과 aggrecan 모두 연골 세포에 대한 마커를 잘 인식하고 있습니다.

이를 바탕으로, 우리는 특정 세포 마커의 발현을 면역 형광 분석하여 정의 간 세포 운명과 함께 추적하는 새로운 방법 세포 계보를 개발했다. Runx2 (초기 단계의 조골 세포에 대한 마커) 및 상아질 매트릭스 protein1 (DMP1; 말기 조골 세포 마커) 있었다연골 유래 뼈 세포 및 분화 상태를 식별하는 데 사용된다. 이 조합은 셀의 혈통 추적의 적용을 넓혀, 또한 화합물 마우스의 생성을 간소화 아닙니다. 더 중요한 것은, 부모 세포 자손의 수, 위치 및 분화 상태는 단독으로 추적 세포 혈통보다 더 많은 정보를 제공하는 동시에 표시됩니다. 결론적으로, 셀 혈통 추적 기술과 면역의 공동 응용 프로그램은 생체 내에서 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구입니다.

Introduction

개발하는 동안, 연골 내 골 형성의 골격 체적의 80 % 이상을 차지한다. 널리은 비대 연골 세포의 사멸로 시작하는 것으로 생각된다. 그 후, 기본 골수의 세포 침입과 뼈 marrow- 및 골막 유래 세포 1,2에 의해 새로운 뼈 증착 다음에 혈관 신생을 시작합니다. 비대 연골 세포 운명 HCS ()는, 그러나, 수십 년 3 논쟁의 문제였다. 초기의 HC는 연골 세포 분화 경로의 종료로 간주하고, 일반적으로 아폽토시스의 HC의 궁극적 운명 것으로 생각되었다. 지금, 일부 연구자들은 적어도 일부의 HC가 살아남을 수 및 연골 뼈 형성에 기여하는 것이 좋습니다. 그들이 그 성장을 제안했지만 판 연골 세포는 미세 구조, 면역 조직 화학 염색을 기반으로 조골 세포에 transdifferentiate 수있는 능력을 가지고 있었고, 시험 관내에서, 46이 방법 w 전혀 연구되지조골 세포 계보에 연골 세포의 기여를 입증에 결정적인 감수해야.

셀 혈통 추적 기술은 세포의 운명을 연구하는보다 엄격한 방법을 제공합니다. 간단히 말하자면, 오직 셀의 특정 유형에서 발현되는 재조합 효소, 리포터 유전자의 발현을 자극한다. 이러한 방식으로,이 세포의 종류와 그 후손 영구적 7로 표시된다. Cre 호텔-에 loxP 시스템은 일반적으로 혈통 추적에 사용됩니다. CRE (재조합 효소 효소) 둘에 loxP 부위 사이 STOP 서열을 절제하고 특정 세포주 (도 1a)에서 리포터를 활성화한다. 일부의 경우, 연구자는 에스트로겐 수용체 (Cre 호텔 ERT2) (8)의 수정 된 형태로 융합 Cre 호텔을 일으키는 등 타목시펜과 같은 약물을 사용하여 Cre 호텔을 활성화 유리한 시점을 선택할 수 있습니다. 형광 기자는 극적으로 복잡성을 줄일 수 있기 때문에 실험을 추적 혈통의 표준이되었다및 8,9 추적 세포 운명의 정확성과 효율성을 향상시킨다. 그것은 쉽게 7 (도 1A)를 시각화하게 밝은 형광 단백질과 강한 표면 형광을 갖기 때문에 tdTomato 형광 리포터 중에서 최상의 선택되고있다.

시스템을 추적 Rosa26 tdTomato 계보를 사용하여, 우리 그룹과 다른 연구자의 HC 개발 10-14 동안 뼈 세포로 자신의 표현형을 변경할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 2.3Col1a1-GFP (조골 세포에 특정)과 면역 (뼈 세포에 특정) :이 작업을 수행하기 위해, 우리는 Rosa26의 tdtomato (유비쿼터스 식 모든 셀에서) / Cre 호텔 (연골 세포에 특정) 마우스와 조합을 추적하는 두 세트를 개발했다. 데이터는 두 가지 방법이 생체 내에서 세포의 운명을 연구하는 가능한 방법이라는 것을 보여줍니다.

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Protocol

모든 프로토콜을 검토하고 텍사스 A & 치과 M 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 동물 사육

  1. 이 연구에서 세 동물 모델을 사용합니다. 먼저 사용 Col10a1-Cre 호텔 15 쥐 외과 형성의 배아 연골 세포의 운명을 조사하고 Rosa26 tdTomato로 교차합니다 (B6, 129S6- GT는 (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) 마우스를 Col10a1-를 얻기 위해 CRE와 Rosa26 tdTomato 쥐. 다음으로, 2.3Col1a1-GFP 마우스 16이 쥐를 교차. Col10a1-Cre 호텔을 사용합니다; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 셀 혈통 추적 실험 (그림 1B)를 수행 할 수 있습니다.
  2. 출생 후 연골 세포의 운명을 연구하기 위해, 단계 1.1에서와 동일한 절차를 수행하지만, Aggrecan-CRE의 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2를 사용) 17, 18 라인과 AGG-Cre 호텔 ERT2을 유지; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP 마우스는 세포 계보 추적 실험 (도 1C)을 수행한다. 생후 14 일에 타목시펜을 주입한다.
  3. 면역과 기술을 추적 세포 혈통을 결합하려면, AGG-Cre 호텔 ERT2 마우스와 Rosa26 tdTomato 마우스를 교차. 실험에 모두 유전자를 가지고 마우스를 사용하여 출생 후 3 일 (그림 1D)에 타목시펜을 주입.

2. 재료 준비

  1. 10 ㎎ / ㎖의 농도에서 10 % 에탄올 및 90 % 옥수수 유에서 타목시펜 분말을 녹인다. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다.
  2. 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 4 %의 농도로 PBS에 파라 포름 알데히드 (PFA) 분말을 녹인다. 희생 후 조직 (하악 외과와 뒷다리가 여기에 사용되는)를 해결하기 위해 4 % PFA 솔루션을 사용합니다. 때문에 자사의독성, 장갑과 안면 마스크와 후드에 PFA를 처리합니다.
  3. 7.4의 pH 값을 조정하기 위해 2 M 나트륨 수화물을 사용하여 10 %의 농도로 증류수에 EDTA 분말을 녹인다. 하악 외과와 뒷다리를 석회 10 %의 EDTA를 사용합니다.
  4. 15 %와 30 %의 농도로 PBS에서 자당 분말을 녹여. 탈회 후 조직을 탈수 자당 솔루션을 사용합니다.
  5. 2 ㎎ / ㎖, pH 5.0으로의 농도로 PBS에 히알루 분말을 녹인다. 이 솔루션은 면역 항원 검색을위한 것입니다.
  6. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 20 %의 염소 혈청이 포함 된 차단 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다.
  7. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 일차 항체 용액을 제조 1.5mL 용량 튜브를 사용한다. Runx2 400 및 1 : 100 DMP1 대한 일차 항체의 농도는 1이다.
  8. 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용하여거짓 긍정적 인 결과를 피하기 위해 면역 염색에 대한 제어와 토끼 IgG의 솔루션입니다. 이 솔루션은 PBS의 2 % 염소 혈청이 포함되어 있습니다. Runx2 제어 토끼 IgG의 농도는 1 : 400; 100 : DMP1, 1. 동시에 실험 및 제어 염색을 수행합니다.
  9. Runx2 또는 DMP1 면역 염색을 위해 PBS로 2 % 염소 혈청을 포함하는 이차 항체 용액을 제조 1.5 ㎖의 튜브를 사용한다. 500 : 1의 희석에 차 항체를 사용합니다.

3. 슬라이드 공 초점 현미경을위한 준비 (만 추적 휴대 리니지, 면역 형광 아니오 조합)

  1. 유리한 시점에서 AGG-CRE ERT2 마우스에서 타목시펜을 주입한다.
    1. 첫째, 케이지에서 마우스를 제거합니다. 그런 다음, 복부를 노출, 마우스의 뒷면에있는 피부를 잡아 뒤집 왼쪽 엄지와 검지 손가락을 사용합니다. 주사기를 잡고 오른손을 사용합니다. 주입을위한 최적의 엔트리 포인트는 L에EFT 또는 hypogastrium의 오른쪽, 간 및 방광을 피하는.
    2. 마우스의 뒷다리에 주사기 평행을 유지하고 복강 주사. 주사 투여 량은 75 ㎎ / ㎏이다. 각각 18g - 9g, 11 - - 13g, 16 이주 3 주, 그리고 옛 사주의 나이에 마우스의 무게는 약 7이다.
  2. 크 실라 / Ketaset 조합으로 쥐를 마취.
    1. 작동 용액을 제조하기 위해, 각각 제 1 ㎎ / ㎖, 5 ㎎ / ㎖의 농도로 증류수 및 크 실라 Ketaset 희석. 이 비율 다음으로, (1)의 크 실라와 Ketaset 섞는다. 주사 투여 량은 30 μL / g이다.
    2. 단계 3.1에서와 같이 주입한다. 마우스의 발목을 곤란하게하여 마취를 확인합니다. 그것은 아무 반응이없는 경우 마우스가 의식이다.
  3. 마취 후 4 % PFA와 마우스를 관류.
    1. 마우스가 의식을 잃게 한 후, entirel하기 위해 보드에 마우스의 4 개의 다리를 고정y는 복부를 노출합니다.
    2. 70 % 에탄올로 복부를 포화 중간 선을 따라 목에 하복부에서 절제를합니다. 복막 멤브레인을 나타 내기 위해 측면에 피부를 당겨 동시에 핀치합니다. 길이 절단을 만들기 위해 해부 가위를 사용합니다.
    3. 잘라와 마음을 노출 전면 갈비뼈를 제거합니다. 오른쪽 귓바퀴에 슬롯을 잘라 동시에, 22 G 주사기와 좌심실에서 심장에 구멍 주사기를 개최합니다.
    4. 천천히 심혈을 따라 관류하는 4 % PFA를 주입하는 동안 오른쪽 귓바퀴에서 컷 아웃 혈액 플러시. 관류를위한 PFA의 부피 1 ㎖ / g이다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다.
  4. 마우스의 피부를 벗겨 및 4 ℃에서 하룻밤 해결하기 위해 4 % PFA 40 ml에 포함 된 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 몸 전체를 넣어.
  5. 조심스럽게 몸에서 하악과 뒷다리를 제거하는 해부 가위와 # 3, # 5 집게를 사용하여 표면에 근육과 힘줄을 제거 할 수 있습니다. 하드 덕트 건물의 배기 시스템에있는 클래스 I의 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다.
  6. 세 번째 몰의 말단 부위에 두 개의 조각으로 하악을 잘라. 마찬가지로, 탈회를 가속화하기 위해 골수 공동을 노출 간부의 대퇴골과 경골을 자른다. 외과와 과두 과정을 포함하는 부분을 넣고 10 % EDTA의 40 ㎖의에 뒷다리와 함께 2 4 ° C에서 석회하기 - 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 사일.
  7. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 4 ° C에서 외과 하룻밤 뒷다리를 탈수 15 % 자당의 50 ㎖를 사용합니다.
  8. 50 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에서 밤새 4 ° C에서 외과와 뒷다리를 탈수 30 % 자당을 사용합니다.
  9. 시상면 함께 샘플을 포함동결 절단 (Cryosections) 기계의 절삭 접시에 10월
    1. 수평 외과 또는 설치 금형의 뒷다리를하다. OCT에서 조직을 잠수함과 OCT를 정지 할 때까지 동결 절단 (Cryosections) 기계에 둡니다.
    2. 절단 접시에 OCT의 블록을 탑재합니다. OCT를 완전히 얼어 붙은 있는지 확인하기 위해 절단하기 전에 약 15 분 동안 기다립니다.
  10. 10 μm의 섹션으로 외과와 뒷다리를 잘라. -20 ° C에서 슬라이드 및 저장에 섹션을 수집합니다.
  11. 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화.
  12. 5 분 동안 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
  13. 각 섹션 주위에 물을 닦아냅니다. 섹션을 원과 원에 DAPI 또는 비 형광 안티 - 페이드 장착 솔루션을 드롭 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워.

Runx2와 DMP1 4. 면역 조직 화학 염색

참고 : IgG의 콘면역 조직 화학 염색이 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 트롤이 필요합니다. 실험 및 대조군에 대한 염색은 동시에 수행 될 필요가있다.

  1. 염색하기 전에 물을 제거하기 위해 37 °의 C 챔버 슬라이드를 부화.
  2. 증류수로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.
  3. 슬라이드의 모든 부분에 동그라미를하는 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 이 단계에서 완전히 섹션을 다루 원에 준비된 솔루션을 모두 추가 할 수 있습니다.
  4. 30 분 동안 37 ° C에서 습기 챔버에서 히알루와 섹션을 처리합니다. (단계 4.5 - 4.8) 용액의 부피는 부분의 크기에 의존한다. 긴 뼈의 외과 용 용액 50 ㎕를 100 μl를 사용합니다. (0.1 % 함유 PBS 트윈 20) PBST로 3 회 씻는다.
  5. 준비하고 각 섹션에 블로킹 용액을 적용하고, 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에이를 부화.
  6. 차와 섹션을 품어밤새 4 ° C에서 항체 용액 (토끼 항 - 마우스의 Runx2, 또는 토끼 항 - 마우스 DMP1). PBS로 3 회 세척한다.
  7. 실온에서 2 시간 동안 차 항체 용액 (염소 항 - 토끼 알렉사 형석 488)와 섹션을 인큐베이션. PBS로 3 회 세척한다.
  8. 절 주위에 물을 닦아 슬라이드 섹션을 다루 원에 DAPI 놓습니다. 조심스럽게 커버 슬립을 누워.

5. 공 초점 현미경

  1. 488 μm의 (녹색)에서 561 μm의 (적색)에 이르기까지 다양한 파장에서 공 초점 현미경을 사용하여 형광 세포 이미지를 캡처합니다. 10X, 20X 및 63X 렌즈를 사용하여 19 200 Hz에서 여러 누적 된 이미지를 가지고 (1,024 × 1,024의 치수).

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Representative Results

연골 세포는 직접 하악 외과와 긴 뼈의 뼈 세포 (조골 세포와 골 세포)로 변환.

Aggrecan, 연골위한 중요한 유전자는 주로 조기 성숙 연골 세포 (18)로 표현된다. 그 결과, AGG-Cre 호텔 ERT2 연령 2 주에서 타목시펜의 주입; Rosa26 tdTomato 마우스는 모든 연골 세포와 자신의 딸 세포에 붉은 토마토 기자를 활성화. 2.3Col1a1-GFP 라인은 뼈 세포, 특히 조골 세포 및 사전 골 세포를 1 발현 콜라겐에 녹색 형광 색상으로 상승했다. 황색 (녹색 결합 적색) 콜라겐 유전자를 발현 연골 유래 뼈 세포의 존재를 나타내었다. 도 2a에서, 연골 밑 하악 공정에서의 골 세포의 대부분은 적색 또는 Y 있었다ellow (Col1a1를 녹색 형광 두 형광이 중첩되었을 때 이에 노란색 표시 분비하기 시작했다 빨간색 셀). 이러한 결과는이 뼈 세포가 연골 세포로부터 유래 된 강력한 증거를 제공 하였다. 유사한 결과는 골 세포의 대다수가 골단 (도 2B) 및 골 간단 (도 2c) 모두에서 연골 세포로부터 유도 된 긴 뼈 개발 중에 관찰되었다.

또한 이러한 결과를 조사하기 위해, 우리는 Rosa26 tdTomato와 Col10al-Cre 호텔 쥐를 넘어; 2.3Col1a1-GFP 마우스. Col10a1은의 HC에 대한 매우 구체적인 마커 만의 HC와 그 후손 표현이다. 또한 Col10a1-Cre 호텔은 (E14.5 AT) Col10a1 식의 시작에서 세포 분화를 반영하는 비 - 유도 성이다. 3 주령의 마우스, 빨간색과의의 연골 뼈 인터페이스 (우수한 수준) 근처 trabeculae에서녹색 형광 세포가 부족 동안 오메 노란색 형광 세포는 지배적이었다. 약간 더 열등한 영역 (중간 레벨), 상기 셀의 대부분은 약간 적은 형광 빨간색과 노란색 형광이었다. 녹색 형광 세포는 추세가 과두 성장은 대부분의 HC에서 변환 된 뼈 세포에 기여 나타냅니다 .This 만 과두 과정 (하부 레벨) (그림 3)의 가장 열악한 지역에 지배 나타났다. 과두 공정에서의 적색과 녹색 형광 세포의 분포는 하악 성장 열등한 투 우수 방향과 일치한다.

셀 혈통 추적 기술은 분명히 세포 사멸이의 HC의 유일한 운명 아니라는 것을 보여줍니다. 모두 AGG-Cre 호텔 ERT2Col10a1-Cre 호텔 라인은 연골 세포 유래 뼈 세포가 과두 과정에서 뼈 개발 및 골단의 주요 원천을 나타냅니다긴 뼈의 골 간단.

면역 형광 염색 및 세포 리니지 추적의 공동 응용 프로그램은 세포 분화의 추적을 가능하게합니다.

세포 계보 추적 기술은 세포 특이 마커의 검출에 의한 세포 유형을 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이 방법은 세포 운명의 연구를위한 몇 가지 장점이 있습니다. 우선, 연구자는 아직까지도 기술 추적 세포 계보에 대한 응용을 넓혀 특정 GFP 마우스 선없는 적절한 마커를 선택하여 전지 특성을 정의 할 수있다. 둘째, 화합물을 마우스의 생성을 간소화한다. 예를 들어, 우리는 AGG-Cre 호텔 ERT2를 생성해야; Rosa26 tdTomato 화합물 마우스 대신 AGG-Cre 호텔을 만드는, (출생 후 3 일에서) Cre 호텔을 활성화 한 후 붉은 색을 생산하는ERT2; 2.3Col1a1-GFP; 더 십자가를 필요로 Rosa26 tdTomato 쥐.

본 연구에서는 면역 염색 두 가지 항체를 선택했다. 하나는 Runx2, 조골 세포의 성숙하는 동안 중요한 전사 인자 (골 형성 세포의 초기 단계)에 대하여이었다; 다른 하나는, DMP1 반대했다 성숙 골 세포 (골 형성 세포의 마지막 단계)로 표현. 도 4에 녹색 형광을 2 주령 하악 공정에서 Runx2 DMP1 또는 항체의 발현을 나타낸다. 도 4a에서, 연골 하골의 컬러 세포 세 가지 종류가 존재한다. 핵의 노란 색 (빨간색과 녹색 형광의 중첩)은 연골 세포 유래 뼈 세포, Runx2 발현이 세포가 뼈 표면에 미숙 한 조골 세포가 있다고 표시를 나타냅니다. 또한, 적색 형광 Runx2을 표현하지 않았다 뼈 세포 (적색 F 있었다중첩 녹색없이 luorescence). 이러한 세포는 뼈 매트릭스 성숙한 연골 유래 뼈 세포를 나타낸다. 가장 일반적인 세포는 Runx2의 발현 또는 Cre 호텔 활성화하기 전에 발생한 변화와 비 연골 세포 유래 뼈 세포를 나타내는 만 녹색 형광 핵을 가진 사람이었다. 이미지는 빨간색 뼈 세포와 노란색 핵을 가진 사람들이 과두 연골 뼈 형성에 기여하는 대부분의 세포 집단이라고 제안한다.

한편, 골 기질의 거의 모든 적색, 연골 유래 뼈 세포는 세포 기관 주위 DMP1 염색했다. 몇 골 세포는 DMP1에 대한 긍정적 인 있었지만 붉은 세포 기관 (그림 4B)을 부족. 이 이들 세포에 대한 두 가지 가능한 설명은 다음과 같습니다 하나 그들은 비 연골 세포 유래 뼈 세포, 또는 그들은 타목시펜 주입하기 전에 변환 된 연골 세포 유래 뼈 세포입니다. 또한, 더 붉은 골 세포 없다뼈의 표면에들이 골 세포를 성숙되지 않았 음을 나타내는 DMP1를 표명했다.

함께 두 early- (Runx2) 및 말기 마커 (DMP1) 골 형성 세포의 발현 패턴의 데이터는 2.3Col1a1-GFP와 함께 Cre 호텔을 사용하여 이전 결과와 일치했다. 이러한 데이터는 면역 및 Rosa26 tdTomato 추적의 조합이 세포의 운명을 연구하는 좋은 방법임을 보여줍니다. 더 중요한 것은, 연구자는 세포 유형을 구별 분화 단계를 식별하고, Rosa26 tdTomato 단독 추적보다 더 많은 정보를 제공하는 다른 마커와 면역 형광을 사용하여 동시에 형질 전환 된 세포 수를 관찰 할 수있다.

그림 1
그림 1. 세포 리니지 추적과 일에 대한 메커니즘복합 마우스의 전자 생성. 가) Cre 호텔-에 loxP 시스템은 일반적으로 혈통 추적에 사용됩니다. CRE 두에 loxP 부위 사이 STOP 서열 영구적 특정 세포주에서 발현 된 단백질을 tdTomato (적색 형광) 소비세. B) 세 가지 동물 모델은이 논문에서 언급된다. 우리는 2.3 Col1a1-GFP를 사용; Rosa26 tdTomato의 마우스와 Col10a1-Cre 호텔 마우스로 교차. Col10a1-Cre 호텔은 (E14.5 AT) Col10a1 식의 시작에서 세포 분화를 반영하는 비 - 유도 성이다. C) - Aggrecan Cre 호텔 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2)도 2.3Col1a1-GFP 교차 다른 Cre 호텔 라인; Rosa26 tdTomato 마우스. (: 타목시펜 Tm)이 CRE는 타목시펜 주사로 세 2 주에 활성화되었다. 셀 혈통 추적과 면역을 결합하기 위해 D)는, 우리는 AGG-Cre 호텔 ERT2 생성; <EM> Rosa26 tdTomato 마우스는 생후 3 일에 Cre 호텔을 활성화하고, Runx2와 DMP1 면역 수행 (TM : 타목시펜을). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. AGG-Cre 호텔 ERT2를 사용하여 하악 외과와 긴 뼈의 뼈 세포 (조골 세포와 골 세포)에 연골 세포에서 변환; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato 화합물 마우스. A) Cre 호텔은 출생 후 14 일째에 타목시펜에 의해 활성화하고, 쥐 4 주령에 희생시켰다. 세 가지 색깔 세포에 있었다 과두 과정 : 순수한 빨강 (연골 세포 유래 뼈 세포), 노란색 (녹색와 함께 빨간색, 콜라겐 (1) 유전자를 발현 연골 세포 유래 뼈 세포를 나타냄), 순수 녹색 (콜라겐 1 유전자와 비 연골 세포 유래 뼈 세포) . 몇 골 세포는 녹색 (청색 화살표) 동안 연골 밑 하악 공정에서의 골 세포의 대부분은 순수한 황색 또는 적색 (흰색 화살표) 하였다. (:; C 타목시펜 (tamoxifen) : 연골, B : 뼈 Tm)이 이러한 데이터는 강력한 직접 개발하는 동안 과두 과정의 형성 뼈 세포로 변환하고 기여 연골 세포 증거를 제공합니다. B, C)에 골단과 골 간단에서 뼈 세포의 대부분은 (흰색 화살표를 연골 세포 유래했다 : 노란색 또는 빨간색 순수의 연골 세포 형질 전환 뼈 세포, 파란색 화살표 : 녹색 순수한 비 연골 세포 유래 뼈 세포, AC : 관절을 연골, GP : 성장 판)."빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
Col10al-Cre 호텔 사용 하악 외과에서 뼈 세포로 연골 세포에서 변환 3. 그림; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato 화합물 마우스. A) 3 주 된 쥐에서 과두 과정에서 녹색 뼈 세포는 별개의 연골 뼈 인터페이스 근처 trabeculae의 소수 민족 (우수한 수준 A1), 빨간색과 약간의 노란색 세포가 우세했다 반면이었다. 중간 단계 (A2)에서, 옐로우 세포 약간 적은 적혈구와 대부분이었다. 그린 셀은 가장 열악한 지역에서 대다수 것으로 나타났다 (A3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 2 주 된 AGG-Cre 호텔 ERT2를 사용하여 과두 과정에서 리니지-추적 배경 골 형성 세포에 대한 두 개의 마커의 공동 현지화; Rosa26 tdTomato 화합물 마우스. A) 핵의 황색은 외과 연골 밑 뼈의 해면골의 표면에 Runx2 (흰색 화살표)를 발현하는 연골 유래 뼈 세포를 나타낸다. Runx2의 발현없이 순수한 빨간색 골 세포가 골 기질 (노란 화살표) 성숙한 연골 유래 뼈 세포를 나타낸다. fewe세인트 세포 Cre 호텔 활성화 (: 타목시펜 Tm)이 전 연골 세포에서 어느 비 연골 유래 뼈 세포 또는 형질 전환 세포 골을 나타내는 유일한 녹색 핵 운반 이들이었다. 나) 외과 연골 아래의 소주 뼈에서 뼈 매트릭스의 거의 모든 붉은 연골 세포 유래 뼈 세포는 세포 기관 (흰색 화살표) 주위에 DMP1 염색을 실시했다. 골 세포 만 몇 DMP1에 대한 긍정적이었다 그러나 그들의 세포 기관 (노란색 화살표)에 붉은 색이 부족. 타목시펜 주입하기 전에 발생하는 비 연골 세포 유래 뼈 세포 또는 연골 세포 유래 뼈 세포 :이 세포에 대한 두 가지 가능성이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

기술적 한계로 인해, 생체 내에서 세포의 거동을 조사하는 것이 어렵다. 그러나, 셀 혈통 추적 기술은 세포 생물학 7-9을 연구하기위한 강력한 도구로 증명된다. 본 연구에서는 상기 면역과 조합하여 프로토콜을 향상시킨다. 이러한 방식으로, 세포 운명 리니지 추적의 적용을 넓혀 연관된 여러 마커에 의해 정의 될 수있다. 또한, 면역, 토마토 신호의이 공동 현지화 동시에 단독으로 추적 세포 혈통보다 더 많은 정보를 제공 설립자 셀, 자신의 위치 및 분화 상태의 자손의 수를 표시합니다. 또, 셀 고유의 마커를 사용하는 조사를 촉진 화합물 마우스의 생성을 간소화 할 수있다.

Cre 호텔의 특이성은 혈통의 명확한 원인 규명 및 결과 (20, 21)의 정확성을 위해 매우 중요합니다. 그것은 매우 메신저입니다세포의 운명을 확인하기 위해 적절한 Cre 호텔 라인을 선택으로 중요. 그것은 또한 연골 세포 (18)에 대해 잘 인식 마커이기 때문에이 비대 연골 세포 10, 11, 및 aggrecan에 대한 특정 마커 간주되기 때문에 본 연구에서는, Col10a1를 선택했다. 다른 분야에서 사용 Cre 호텔 좋은 모델이있다. scleraxis는 힘줄과 인대 세포 혈통 (22)에 대한 마커 기본 나선 루프 나선 전사 인자이기 때문에 Scleraxis-Cre 호텔 (SCX-Cre 호텔) 라인은, 예를 들어, 힘줄 및 인대의 연구에 유용하다. 또 다른 Cre 호텔은 DMP1 높은 상아 아세포에서 발현 및 23, 24을 골 세포되기 때문에 DMP1-Cre 호텔은 일반적으로 skeleton- 치아 관련 연구에 사용했다.

비 - 유도 Cre 호텔 시스템과 비교하여, 유도 Cre 호텔의 활성화는 공간적 및 시간적으로 제한 될 수있다 (20). 결과를 실험 설계 및 해석 할 때, 몇 가지 제한 사항이 고려되어야한다유도 Cre 호텔 모델. 먼저, 타목시펜 투여는 Cre 호텔 활성화의 효율 표지화 된 세포의 수를 변경할 수있다. 낮은 용량은 클론 밀도 (25)에 관심있는 인구 레이블을합니다; 고용량은 전체 전구 풀 7,26 레이블을 수 있습니다. 따라서, 상기 투여 량은 실험의 목적에 따라 선택되어야한다. 둘째, 타목시펜, 특히 고용량 27,28 잠재적 인 독성을 가지고 있습니다. 이 때문에, 임신 29 일 동안 주입시 말기 유산을 피하기 위해 용량을 감소시키는 것이 좋다.

결론적으로, 셀 혈통 추적 기술과 면역의 공동 응용 프로그램은 생체 내에서 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구입니다. 앞으로 연구자들은 동시에 토마토 신호 배경 위에 두 개의 서로 다른 항체와 면역을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은하기에 더 쉽게, 하나의 섹션에 두 개의 마커의 발현 패턴을 표시 할 수 있습니다조사 비교하고 결과를 분석합니다. 또한,이 공동 출원은 상기 종래의 면역을 통해 존재할 수있는 비특이적 염색을 감소 면역 반응계에 의해 개선 될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

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References

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