Изучение Митохондриальная Структура и функции в

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Митохондрии классически описывается как клеточном электростанцией, так как они являются основными мест производства энергии в дифференцированных клетках. Кроме того, митохондрии играют критическую роль в обмене веществ, выработки тепла, липидного модификации, кальция и окислительно - восстановительного гомеостаза, оркестровка клеточных процессов передачи сигналов, и т.д. 1. Митохондрии также играют активную роль в индукции клеточной смерти 2, а также в регуляции клеточного цикла 3. Такая многофункциональность поднимает следующие основные вопросы: а) как митохондрии выполняют все эти функции одновременно и б) существуют специфические митохондриальные бассейны или подзоны, которые являются специализированными для различных функций? В этом контексте важно отметить, что многофункциональный митохондрии динамичны в их форме, размеру и структуре в пределах отдельных клеток, и что установившийся форма митохондрий может варьировать между типами клеток. Десятилетия исследований из различных лабораторныхоратории предположить , что изменение митохондриальной формы, размера и структуры, в совокупности называемых митохондриальных динамики, имеет решающее значение для поддержания различных митохондриальных функций 4,5,6. Эти данные указывают на возможность того, что митохондрии могут выполнить свою многофункциональность в силу своей структурной динамики.

Обширные предпринимаются усилия, чтобы понять структурно-функциональные отношения митохондриальную. Динамизм митохондриальной структуры, прежде всего, поддерживается их способность делению и слитые события друг с другом. Деление больших митохондрий превращает их в более мелкие митохондриальных элементов, в то время как слияние между двумя меньшими митохондриях сливает их в больший митохондриальной элемент 7. Кроме того, переходный процесс слияния двух митохондрий может произойти, чтобы позволить смешивание их содержимого. Деление и слитые события внутренней и внешней мембраны митохондрий тщательно регулируются спецификацииIFIC наборы белков. Механизм ядра деления состоит из динамин связанных с белком 1 (drp1), который набраны из цитоплазмы в митохондрии путем его взаимодействия с определенными добросовестные митохондриальных белков (например, Fis1 или Mff1), в то время как функция drp1 также может регулироваться другие белки на поверхности митохондриальной 4. Хотя drp1 работает на внешней мембране, его возможности деления влияют на внутреннюю мембрану, а также. Оркестровка деления наружных и внутренних мембран митохондрий не очень хорошо понял. С другой стороны, слияние внутренней мембраны регулируется в активную зону деятельности OPA1, в то время как mitofusins регулируют слияние наружной мембраны 5. Баланс противодействующих деления и слияния событий митохондрий диктуют стационарную митохондриальную форму в клетке. Например, подавление митохондриального деления приведет к полной и беспрепятственной слияния, в то время как чрезмерной активности митохондрийл деление приведет к фрагментации митохондрий 3.

Изучение структурно-функциональных отношений митохондриальной главным образом состоит из двух взаимодополняющих подходов: а) анализ клеточных и организменном фенотипов после генетической манипуляции митохондриальных деления / слитых белков и б) прямые оценки митохондриальной структуры и функции. Следует отметить, что генетические анализы не всегда могут выявить прямую функциональность молекулы в стороны (в данном случае, митохондриальные деления / слитых белков), как фенотипы могут возникать из-за вторичных эффектов. Поэтому крайне важно развивать и использовать инструменты для изучения митохондриальной структуры и функции непосредственно. Любая оценка митохондриальной структуры включает в себя различные инструменты микроскопии. Использование флуоресцентной микроскопии живых клеток значительно продвинулся вперед исследования митохондриальных динамики, так как митохондриальная динамизм можно контролировать как качественно, так и quantitatраторов , используя соответствующие инструменты и методы 8 флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные инструменты микроскопии на основе были разработаны для изучения митохондриальной структуры и функции в живых и фиксированных тканей MELANOGASTER дрозофилы, выяснении значение митохондриального динамизм в естественных условиях 9. Эти и другие методы описаны здесь, с целью изучения митохондриальной структуры и функции в яичниках дрозофилы.

Яичник Drosophila состоит из зародышевых и соматических родах, которые вытекают из их соответствующих взрослых стволовых клеток , которые находятся в гермарии 10,11. Шестнадцать синцитиальный зародышевые клетки (GCS) получают инкапсулированные соматическими клетками фолликула (FCS) с образованием отдельных яйцевых камер , которые возникают из гермарии (рисунок 1). Один из 16-ти ШС получить стремится стать ооцитов, а остальные 15 ШС перерасти в трофоцитов, которые поддерживают рост ооцитов камеры, Способствуя созреванию яйцеклетки до ее укладки. Большинство ЯК претерпевают 9 раундов митотических делений прежде, чем они выходят из митотического клеточного цикла, чтобы неизлечимо дифференцироваться в узорной эпителиального клеточного слоя, состоящего из переднего фолликулярных клеток (AFCS), задней фолликул клеток (ПФУ), а также основных клеток тела (MBCS) , Последовательные камеры яичные соединены стебле клетками, которые дифференцируются клетки, которые также полученные из ЯК на ранних стадиях развития. Митохондриальная форма регулируется митохондриального белка деления drp1 активно участвует в процессе дифференциации в ходе нормального развития Drosophila яичников FC слоя 9,12. Методы , используемые в этих исследованиях для определения участия drp1 в развитии фолликул клеточного слоя Drosophila описаны здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка дрозофилы (инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А)

  1. Для любого из описанных экспериментов, собирают дрозофилы (выдерживают при комнатной температуре или 25 ° С ) в течение 5 дней с момента вылупления и поместите их в пробирку , заполненную 5 - 7 мл дрозофилы пищи (см Материалы таблицу), не более чем 25 мух в каждом флаконе; поддерживать женщины: мужчины соотношении 2: 1.
  2. Насыпьте небольшое количество гранулированных дрожжей , чтобы стимулировать производство яиц дрозофилы. Выполнить экспериментальные манипуляции в течение 2 - 4 дней.

2. Препарирование дрозофилы яичников (инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А)

  1. Средний Теплый насекомых рассечения (см Материалы таблицу) до комнатной температуры, 25 ° C. Заполните три скважины из восьми скважин стекла рассекает блюдо с 200 мкл среды в каждую лунку.
  2. Обезболить дрозофилы с СО дрозофилы в то время , при выполнении живой микроскопии.
  3. В то время как, глядя через окуляр микроскопа рассечение, разъединить грудную клетку от брюшной полости с помощью двух пар щипцов. С помощью пинцета, тщательно передачи брюшком на вторую лунку блюдо.
  4. Используйте одну пару щипцов, чтобы держать живот на заднем конце, и медленно толкать яичники из (наряду с другими брюшных содержимым) с другой парой щипцов. Если эта попытка не увенчается успехом, осторожно удалите брюшной экзоскелет путем введения щипцов в переднем конце, чтобы освободить яичники.
  5. С помощью щипцов, провести индивидуальную яичник к концу непрозрачной задней (то есть яйца желток заполненные, на поздней стадии) и переместить его тщательно в третью лунку блюдодля дразнить, чтобы обработать его для живой микроскопии (шаг 3) или для фиксации для выполнения иммунное окрашивание (этап 7).
  6. Осторожно дразнить защитную оболочку из вокруг яичников, сдвигая дразнящий иглу слегка от заднего к переднему концу каждого яичника, удерживая его на заднем конце с парой щипцов.
    Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму повреждения во время дразнить, согните кончик иглы и увеличить на каждом яичнике за счет увеличения коэффициента увеличения микроскопа (рис 2А). Теребят должно быть достаточно, чтобы разорвать оболочку эффективным, но оно также должно быть тщательно сделано, чтобы сохранить целостность овариол.

3. Подготовка к микроскопией Live-ткани

Примечание: Инструменты , необходимые изображены на рисунке 2А.

  1. Перед Drosophila рассечения, подготовить polyL-лизином камеры с покрытием. Для этого поместите два 20-мкл капли polyL-Лизин (0,1 мг / мл) на coverglзад (14 мм, № 0) из стеклянным дном чашки Петри (35 мм) на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы предотвратить слияние капель. Высушите пластин в течение 1 ч при 37 ° С и обозначая края белой polyL-Лизин пленку на нижней стороне пластины с стираемым маркером.
    Примечание: The polyL-Лизин покрытием камеры можно хранить при температуре 4 ° С в течение недели. При использовании камеры предварительно покрытую, довести его до комнатной температуры перед началом рассечение дрозофилы.
  2. Установите параметры сканирования на конфокальной микроскопии, чтобы убедиться, что образец могут быть отображены сразу после завершения вскрытия и монтажа, как показано ниже.
  3. Поместите один расчлененный и дразнили яичник (следующий шаг 2 и окрашивают, в случае необходимости, после шага 5) на отмеченной области polyL-Лизин покрытием и распространение яичник с дразнящей иглой, чтобы отделить овариол. Поместите 10 мкл каплю насекомых рассечения среды на верхней части яичника, убедившись в том, чтобы покрыть тон весь polyL-Лизин покрытием области. Накройте чашку Петри.
  4. Сразу же выполнить конфокальной микроскопии смонтированного образца при комнатной температуре.
    Примечание: Только один дрозофилы должен быть расчленена, обработаны и отображены одновременно. Кроме того , микроскопия не следует проводить при температуре 37 ° С, которая будет имитировать ударную среду тепла для Drosophila ткани.

4. Флуоресцентная Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) Анализ для оценки митохондриях непрерывности

Примечание: непрерывность митохондриях в расплавленных митохондриальной структуры устанавливается после полного слияния митохондриальных внутренних и внешних мембран после прогрессии через промежуточные этапы. Деление митохондрий может выполнить те же действия , но в обратном направлении (рис 3А). FLIP является покадровой микроскопии на основе полуколичественный метод, который может быть использован для оценки непрерывности митохондриального матрикса вОкончательное расплавленное состояние экс виво митохондрий (шаги 3 и 4 на рисунке 3А) в живых Drosophila яичников 9. Анализ САЛЬТО выполняется в небольшой области интереса (ROI) митохондрий , экспрессирующих флуоресцентный молекулу в митохондриальный матрикс , который photobleached через равные промежутки времени (САЛЬТО ROI на рисунке 3 , а ). В результате, любая окружающая митохондриальная область , которая является непрерывной с FLIP ROI (экспериментальный ROI на рисунке 3А) потеряет сигнал в связи с обменом молекул в непрерывном митохондриях. Эксперименты FLIP продемонстрированные здесь выполняются на трансгенной Drosophila экспрессирующих mitoYFP, который содержит митохондриальную последовательность таргетирование человека цитохромоксидазы VIII субъединицей маркированного с YFP целевой его в митохондриях в свободно диффундирующего форме. Аналогичный эксперимент может быть также выполнена с мито pUASP-мито-GFP трансгена, как сообщалось ранее <SUP> 9. Аналогичный протокол FLIP может быть использован с зондом , ориентированным на митохондриальный межмембранное пространство , чтобы иметь возможность обнаружить преемственность в результате слияния внешний , но не внутренней митохондриальной мембраны (шаг 2 на рисунке 3 , а ).

  1. Открытое программное обеспечение захвата изображений на конфокальной микроскопии и установить соответствующие параметры сканирования на вкладке "Приобретение" (таблица 1). Проверьте "серии Time", "Отбеливание" и "Регионы" коробки, чтобы открыть отдельные вкладки. Помещенный соответствующие значения параметров приобретения в каждой вкладке (таблица 1).
    Примечание: обскура следует оставить открытым, поскольку этот эксперимент предназначен для мониторинга общий сигнал от всей митохондриальной популяции в отдельных клетках.
  2. Используйте окуляр, чтобы быстро найти поле интереса в смонтированном живой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите овариол, которые хорошо распространяются на стеклянном-bottomed блюдо, так как конфокальной микроскопии не может быть выполнена на плавающих овариол.
  3. Нажмите кнопку "вживую", чтобы получить живое изображение выбранного поля интересов. Нажмите кнопку "Стоп", чтобы остановить живой процесс сканирования.
  4. При необходимости отрегулировать параметры сбора данных таким образом, что обнаруженный флуоресцентный сигнал находится ниже уровня насыщения (указывает отсутствие красных пикселей при включенной опции "Индикатор диапазона" установлен), с определенным фоном, как установлено путем корректировки значения смещения.
  5. Нарисуйте небольшой ROI, используя инструмент для рисования Безье на вкладке "Регионы" разграничить фотообесцвечивание зону на изображение, полученное с помощью живого сканирования.
    Примечание: Размер ROI должен быть около 20 - 50% от общего флуоресцентного митохондриального сигнала внутри клетки.
  6. Выполните сканирование изображения, нажав на "начать эксперимент."
  7. Количественно интенсивность флуоресценции с помощью собственного или программного обеспечения с открытым исходным кодом (см МатериалыТаблица). Запишите средний сигнал от ROI, где целевой повторяющийся отбеливания (FLIP); трансформирования, где отбеливание не была выполнена в той же клетке (экспериментальная); КОРОЛЬ из другого небеленой ячейки в том же поле зрения, для оценки общего отбеливания в течение экспериментального периода (отбеливающая); и ROI на область фона (Background). Вычесть средний фоновый сигнал, полученный от среднего сигнала в другой трансформирования. Осуществить нормировку флуоресцентного сигнала с начальным сигналом предварительно отбеливатель для соответствующей ячейке.
  8. Участок нормированных данных с помощью любого стандартного программного обеспечения для построения графиков.

5. Живой Окрашивание с флуоресцентных митохондриальной Красители

Примечание: Стационарное митохондриальная структура и потенциал может быть оценена с помощью красителей , которые специфически включают в митохондрии в живых клетках и тканях. Живые яичниках дрозофилы могут быть окрашены ех естественных условиях с люминесцентным митохондриальнойпятна визуализировать митохондрии, для оценки митохондриальных активных форм кислорода (мито-РОС) производства, а также для оценки потенциала митохондрий на единицу массы. Это может быть достигнуто совместным окрашиванием с митохондриальной потенциометрического тетраметилродамин краситель этилового эфира (TMRE) и совместимым живой митохондриальной пятно , представляющего митохондриальной массы (см материалы таблица для специфических красителей).

  1. Развести запас пятен в теплой насекомых рассекающих среды до конечной рабочей концентрации: митохондриальной пятно, 250 нм; TMRE, 50 нМ; и мито-РОС пятно, 5 мкМ.
  2. После рассечения и дразня яичники следующие стадии 2, поместите яичники в 200 мкл любого конкретного окрашивающего раствора в лунку рассечение блюдо. Выдержите их в течение 10 мин с блюдом, покрытой подходящей коробке, обернутой алюминиевой фольгой для защиты от света. Вымойте окрашивали яичники, перемещая их тщательно с щипцами в 3-х последовательных скважин containinг среда без пятен.
  3. Для совместного окрашивания с TMRE и совместимым общей митохондриальной пятна, следовать выше протокол к окрашиванию сначала с TMRE, а затем сразу же с общей митохондриальной пятна (без каких-либо стадий промывки между ними).
  4. Установите на яичники со стеклянным дном блюдо следующим шагом 3 polyL-Лизин покрытием и подготовиться к конфокальной микроскопии с соответствующими параметрами сканирования (таблица 1), следующие шаги 4.2-4.4.
    Примечание: Сигнал от инкорпорированных красителей не последний при попытке монтирования окрашенных образцов в монтажной среды.
  5. Установите флажок Z-секционирования, чтобы открыть вкладку. Поверните колесо фокусировки по направлению к нижней части образца во время его живого отсканированы и нажмите на кнопку "установить первый", чтобы определить самую нижнюю Z-секцию. То же самое, перемещая колесо фокусировки в сторону в другом направлении, чтобы определить самую верхнюю секцию.
  6. Выполните сканирование изображения, нажав на "начать эксперимент."
  7. Количественная фон скорректированной интенсивности флуоресценции от трансформирования для фонового сигнала и отдельных ячеек (как в шаге 4.7) и построить данные с помощью любого программного обеспечения, построения графиков.

6. Генерация drp1 Null мозаик

Примечание: Клональная стратегия , используемая здесь , представляет зеленый флуоресцентный белок (GFP) -отрицательное нулевые клоны drp1 в фоне GFP-положительных, фенотипически дикого типа фона , который является генотипически гетерозиготными по drp1 нулевой мутации 9. Теплового шока индуцированных флиппазы-флиппазы распознавание цели (FLP-FRT) -опосредованного сайт-специфической рекомбинации митотического создает гомозиготные клоны функционально нулевой drpKG03815 аллеля. Генотип дрозофилы , несущий drp1 мутант drpKG03815 FRT40A / CYO, в то время как генотип , несущего теплового шока-индуцированной ФЛП (hsFLP) и UbiGFP клоновая маркер hsflp; убиквитин NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. Генотип себебранной потомство креста между выше генотипов hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Синхронизировать дрозофилы для девственной коллекции, перемещая их в новые флаконы свежей пищи каждые 2 до 3 дней. Мониторинг pupariating ампул ежедневно для того, чтобы собрать новые девственные самок.
  2. Собирают с красными глазами, вьющимися крыла девственных самок из мутантного генотипа drp1 каждый день, один раз утром и один раз вечером, и поместить их в отдельный флакон. Параллельно с этим , собирают мужской дрозофилы с темно - красными глазами и прямыми крыльями , несущих hsflp и UbiGFP в течение 5 дней вылупления.
  3. Водрузил крест, добавив самцов к Деве самок с женщиной: мужской соотношении 2: 1.
  4. Насыпьте небольшое количество гранулированных дрожжей, чтобы стимулировать производство яиц.
    Примечание: Осторожно переместите дрозофилы в свежую ампулу среды каждые 2 до 3 дней , чтобы увеличить количество потомству и уменьшить флакон скученности.
  5. esthetize, сортировать и собирать прямо с крыльями, с красными глазами женское потомство в течение 5 дней вылупления.
  6. Для теплового шока, поместите собранный дрозофилы в пустые флаконы с небольшим количеством гранулированных дрожжей и небольшой, мягкий протирать (впитывать влагу во время теплового шока). Помещают пробирку с дрозофилы на водяной бане при 38 ° С в течение 1 ч, чтобы генерировать в основном фолликул клеточных клонов, а при 37 ° С в течение 1 ч дважды в день ( что позволяет по меньшей мере , 5 ч между 2 тепловых шоков) в течение 2 дней подряд , чтобы генерировать как зародышевой линии и фолликул клеточных клонов.
    Примечание: Убедитесь , что флакон полностью погружен в воду до уровня пробки.
  7. Тепловой удар может сделать неподвижности дрозофилы. Дайте тепловому шоку дрозофила для восстановления в течение 1 ч при комнатной температуре , когда они становятся подвижными снова.
  8. Добавьте мужчин обратно к самкам в той же пропорции, как и в кресте, и переместить их в свежих флаконах с mediuм посыпают небольшим количеством гранулированных дрожжей. Поддерживать дрозофилы в течение не менее 5 дней.
  9. Рассеките яичники по мере необходимости для живого или фиксированного эксперимента.
    Примечание: В яичниках , выделенные из родительского Drosophila , выражающей UbiGFP следует использовать в качестве отрицательного контроля для подтверждения эффективной индукции GFP-отрицательных клонов теплового шока.

7. Со-иммунным для циклин Е и митохондриях

Примечание: Для обнаружения Drosophila циклин E (dCyclinE), мы использовали коммерчески полученного антитела поднятый непосредственно против dCyclinE 9 (см Материалы таблицу). В качестве митохондриального маркера, мы использовали антитела против АТФ-B (субъединицу митохондриальной АТФ - синтазы комплекс) 9.

  1. Теплый 4% параформальдегидом (ПФА) до комнатной температуры, 25 ° С. Внимание! Параформальдегид является токсичным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После открытияампула, ПФА следует хранить при температуре 4 ° С и использовать в течение 7 дней. Это происходит потому, что хранение PFA может позволить окисление с образованием метанола, который бы резко изменить митохондриальные мембраны во время фиксации, даже если они присутствуют в следовых количествах.
  2. Сразу после вскрытия, фиксируют расчлененный яичники, помещая их в 200 мкл свежей PFA в лунку стекла рассекает блюдо (без насмешек). Держите блюдо в вытяжном шкафу в течение 15 мин. Промыть фиксированные яичники, перемещая их тщательно с помощью пинцета в 3-х последовательных лунок, каждая из которых содержит 200 мкл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    Примечание: Эксперимент можно остановить здесь и образцы могут быть оставлены при температуре 4 ° С в течение 1 дня.
  3. Дразнить яичники более подробно в PBS (аналогично шагу 2.6), чтобы тщательно удалить защитную фиброзной оболочки, которые могут препятствовать доступу антигена с антителом.
  4. Проницаемыми дразнили яичники, помещая их в пробирке 500 мкл свежеприготовленных 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) и инкубировать ее в течение 30 мин при встряхивании при 25 оборотах в минуту.
    Примечание: Во время укачивания, поместите трубы параллельно качалки движения; размещая их перпендикулярно может позволить ткани прилипать к крышке трубок, что приводит к потере тканей.
  5. Для того, чтобы удалить PBS-TX, поместите микроцентрифуге трубки в стойку, чтобы позволить ткани осесть на дне пробирки. Осмотрите их визуально и нажмите трубы, если это необходимо, чтобы привести любые плавающие ткани вниз к основанию. Аспирируйте раствор осторожно сверху, убедившись, что ткани в нижней части трубок остается нетронутой.
  6. Блок яичники путем добавления 200 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА), растворенное в 0,5% PBS-TX, и инкубировать ее на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч. Удалите блокирующий агент, следуя шаг 7.5.
  7. Добавить первичных антител в 200 мкл свежего блокирующего агента: анти-кроличий dCyclinE антителом (1: 100) и анти-мышь АТФ-B антитела(1: 100). Инкубируйте тканей на качалке в течение 2 ч при комнатной температуре.
  8. Вымойте яичники с PBS-TX 3 раза в течение 15 мин каждый раз, после шага 7.5.
  9. Добавить 200 мкл соответствующих вторичных антител в свежем PBS-TX: анти-мыши-Cy3 (1: 1000) и анти-кролик-Cy5 (1: 500). Инкубируют на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Вымойте яичники с PBS-TX 3 раза в течение 15 мин каждый раз, после шага 7.5.
  11. Для того, чтобы окрасить ДНК, добавьте Hoechst (1: 1000 разбавления) до конечной промывки PBS-TX.
  12. И, наконец, выйти из ткани в 500 мкл 1х PBS.
  13. Использование 1-мл микропипетки, удалите иммуноокрашиванию яичники из пробирки в микроцентрифуге свежую лунку стекла рассекает чашку, содержащую 200 мкл PBS.
  14. Добавьте одну каплю глицерина на основе монтажной среды на предметное стекло и добавьте иммуноокрашиванию яичники один за другим к монтажной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь , что яичники действительно переносится на монтажную среду. Несоблюдение этого правила SO приведет к потере тканей.
  15. В то время как, глядя через рассечение микроскоп, аккуратно срывать прозрачные овариол (младшие этапы) из непрозрачных зрелых камер яиц с использованием дразнящий иглы, удерживая непрозрачную часть яичника с щипцами. Удалите зрелую яйцеклетку камеры от монтажной среды.
  16. Поместите покровного стекла (22 мм, № 1) на слайде и легко нажмите, чтобы гарантировать, что гистологическая среда распределяется равномерно снизу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на покровного стекла также обеспечивает надлежащее выравнивание ткани вдоль покровного стекла. Несоблюдение этого правила может позволить оптимально меньшие этапы, чтобы плавать в монтажном среде, предотвращая оптимальную микроскопию этих тканей.
  17. Высушите образцов в течение 15 мин и запечатать края покровного стекла тщательно с лаком для ногтей.
  18. Выполните конфокальной микроскопии в соответствии с экспериментальной потребности (таблица 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Описанные методы могут быть использованы для изучения митохондриальной структуры и функции в живых и фиксированных яичниках дрозофилы (рис 2В). При условии, некоторые примеры ожидаемых результатов, полученных с помощью описанных методов.

Препарирование яичника дрозофилы: Когда вскрывали дальше, отрубленные животы (рис 3B) со всей дрозофилы (рис 3А) следует освободить брюшные содержимое, в том числе 2 яичников от каждого отдельного дрозофилы. Интактные яичники выглядят как овальной формы, белые сооружения (стрелки на рисунке 3C и D) , которые в идеале должны оставаться прикрепленным друг к другу через йцевода ножке. В овариол в каждом яичнике должны быть скреплены фиброзной оболочки (# в увеличенной части фиг.3С), которая удаляется бу осторожно дразня (толстая стрелка на рисунке 3D; * указывает на сильно дразнили яичник с отделенными овариол) , чтобы выставить овариол для окрашивания и микроскопии. Освобожденные яичники с яйцевода стеблями порванные во время выпуска содержимого брюшной полости также могут быть использованы, при условии, что они не повреждены иным образом. Любые поврежденные яичники (* на рис 3C) и других брюшных содержимого (на рисунке стрелок 3C) должны быть отброшены.

Живая микроскопия яичниках дрозофилы: Здесь мы демонстрируем технику переворачивать и загрузку митохондриальных структурных и функциональных красителей в Drosophila яичников.

Методика переворачивать, ранее примененные для оценки митохондриальной непрерывность в фолликул клетках дрозофилы 9, было показано здесь в овариальных трофоцитов трансгенной Drosophila (Рисунок 4A). FLIP нацелен на один из митохондриальных облаков , связанных с медсестрой клеток приводит к потере флуоресцентного сигнала от синего и белого трансформирования окружающих красный FLIP ROI в течение 200 с (рис 4В и С) больше , чем 50%; сигнал от зеленого ROI используется для коррекции фона. Флуоресцентный сигнал от желтого ROI в других нецелевых трофоцитов остается постоянным в течение этого периода времени, означающий минимальное общее отбеливание во время хода эксперимента (рис 4В, и C). Кроме того, смотрите видео 1. Этот результат указывает на то, что митохондриив трофоцитов расплавились свои внешние и внутренние мембраны, примеры которых приведены в пунктах 3 и 4 (рис 4а), в то время как митохондрии в шагах 1 и 2, как ожидается, не показывают какой - либо потери флуоресценции в этот период времени.

Ранее было показано , что полуколичественный показатель митохондриального потенциала на единицу митохондриальной массы может быть оценена совместным окрашиванием с потенциометрического красителя TMRE и общей митохондриальной пятно , который отражает массу митохондриальных 13. Здесь, та же техника была использована для демонстрации оценки потенциала митохондрий на единицу массы в живом Drosophila овариальной ткани. Конфокальной микроскопии живых яичниках Drosophila окрашивали TMRE демонстрирует уменьшение сигнала с глубиной ткани (фиг.5А). Эта потеря флуоресцентного сигнала из-за увеличения разброса в большей глубине ткани, как ожидается, произойдет с любым видом fluoropHore с заданным рабочим расстоянием объектива в использовании. Поэтому, важно, чтобы различить максимальную глубину ткани, внутри которой флуорофор могут быть обнаружены во время получения изображений живых тканей. Например, живут Drosophila яичники окрашивали с общей митохондриальной пятна (Мито) могут быть отображены с помощью описываемой установке микроскопа (таблица 1) в диапазоне от 20 мкм от покровного стекла, в то время как максимальная гарантируемой глубина уменьшается с увеличением размеров яиц в камере (рис 5В). Оптимизированные настройки микроскопа для митохондриальных пятен обнаружить положительные сигналы в соответствующие каналы обнаружения, в то время как параметры для изучения каких - либо неоправданных сигнала перекрестных помех или флуорофора поперечное возбуждение ожидаемо не обнаружено минимальное или отсутствие сигнала (рис 6а). Совместное окрашивание TMRE с общей митохондриальной пятно может быть использован как для качественного (фиг.6В) и количественный (фиг.6С и D </ STRONG>) оценки митохондриального потенциала на единицу массы в живых яичниках дрозофилы. Например, а) качественный анализ показывает , что гермарии дрозофилы демонстрирует более высокую митохондриальный потенциал на единицу массы в стадии 2b , где соматические фолликула клетки возникшим инкапсулировать зародышевой клетки (стрелки головки на фиг.6В) и б) Полуколичественные анализы показывают , разница в митохондриальной потенциала на единицу массы между (Stretch) и АЧХ MBCS, как было проанализировано из яйцевой камеры стадии 9 (рис 6в). Следует отметить, что количественное определение было выполнено из 2-х различных оптических срезов для MBCS и АЧХ в зависимости от их плоскости фокусировки. Использование зонда мито-РОС , который был успешно использован в Drosophila 14 демонстрируется в живых Drosophila эпителиальные слои фолликул клеток, где функциональные нулевые клоны митохондриального белка деления Drp1were введенных. Большинство из них, бушельт не все, из живых GFP-отрицательных клонов нуль фолликул клеток drp1 демонстрируют повышенное окрашивание для митохондрий-ROS (рис 7А и B). Следует отметить, что несмотря на то особым митохондриальный сигнал не может быть обнаружен в этой ткани, концентрация красителя мито-РОС может быть обнаружена в ядерной области в развитых постмитотических фолликулярных клеток, которые значительно больше, чем митотических фолликулярных клеток (* на рисунке 7С). Это может происходить из - за взаимодействия ядерной ДНК флуоресценция продукта окисления красителя мито-РОС, который является производным от этидия 15.

Обнаружение митохондриальная циклин Е в неподвижных Drosophila фолликула клеток: Это было недавно показано , что митохондрии может регулировать молекулу клеточного цикла циклина Е путем набора его к митохондриальной поверхности в клетках млекопитающих и слой Drosophila фолликул клеток 12 клеток дрозофилы фолликула. Здесь приведен пример митохондриальной локализации циклин Е в фолликул клетках Drosophila продемонстрирована с использованием ко-иммунным протокол , описанный. Обратите внимание на повышенные уровни dCyclinE в GFP-отрицательных drp1 нулевых клонов , где сигнал dCyclinE перекрывается с митохондриальной сигнала АТФ-B в гермарии (фиг.8А), хотя сигнал не может быть разложено на отдельные митохондриальных элементов с ограниченным разрешением конфокальной микроскопии. Кроме того , в постмитотических MBCS, что GFP-отрицательные drp1 нулевые клоны имеют как ядерные и цитозольных сигналы dCyclinE, причем последний значительно перекрывается с сигналом АТФ-B, в то время как дикого типа GFP-позитивные клетки имеют только сигнал ядерной dCyclinE (рис 8Б).


Рисунок 1. Развитие дрозофилы яйцевых камер. Мультфильм изображающие яйцевая трубка Drosophila , состоящий из цепи развивающихся яйцевых камер, каждая из которых состоит из ооцита и медсестра клеток (зародышевые) , заключенного в капсулу слой фолликула клетки (соматической). Яичные камеры развиваются из гермарии и развиваться через этапы, где митоза фолликула клетки становятся постмитотическими. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Экспериментальный план и подготовка. (A) Инструменты , используемые в способах , описанных: A. Fly пузырек; B. насекомых рассечения среды; С. параформальдегид; D. Fly щетка; Е. Рассечение блюдо; F. Защитное стекло; G. Microfuge трубки. H. Стеклянным дном блюдо; I. предметное стекло; J. 1000 мкл микропипетки; К. 200 мкл микропипетки; L. 2,5-мкл микропипетки; М. Теребят иглу с загнутым кончиком (кончик увеличивается); Н. Толстые пинцетом; О. Тонкие щипцами. (Б) потока Диаграмма схематично представляющий способы , описанные. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Препарирование дрозофилы яичниках. (A) анестезировали целом дрозофилы. (B) Кусок Drosophila животы с или без (*) брюшной полости содержимого. (C) Выпущенный Drosophila содержимое брюшной полости, в том числе яичников (стрелки и *) и другое содержимое(наконечники стрел); увеличение в коробочной области на правом подсветки переднюю (ANT) и задний (Post) концы пары яичников, проводимых яйцевода стебле, где овариол удерживаются фиброзной оболочки (#). (D) дразнили Drosophila яичник (толстая стрелка маркировки надлежащим образом дразнили и * маркировка плохо дразнили) по сравнению с unteased яичник (тонкая стрелка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Живая тканей FLIP анализа. (А) Схематическое представляющая этапы митохондриального деления / слияния, который может быть проанализирован с помощью соответствующего митохондриального анализа непрерывности с использованием метода FLIP; В этом случае зонд мито-YFP в митохондриях позволяет assessmлор непрерывности митохондриях. (B) Покадровый ех естественных условиях микроскопии живого трансгенного Drosophila яйцевой камеры , выражающей Mito-YFP; выбрать только моменты времени (T) показано на рисунке. Смотрите видео 1 для всех временных точках. (С) Количественное флуоресцентного сигнала от соответствующего цветного трансформирования в (В), выражаются после коррекции фона и нормализации. Стрелки указывают повторами моменты времени фотообесцвечивание, тогда как интервал времени между двумя последовательными событиями отбеливания является время восстановления. Шкала бар: 10 мкм. Изображения были получены с параметрами , описанными в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Живая Митохондриил Окрашивание и микроскопия Drosophila яйцевая трубка. (A) Отдельные оптические ломтики живого Drosophila яйцевая трубка , окрашенном TMRE; Снимок был получен с параметрами , описанными в таблице 1. Z обозначает расстояние от покровного в мкм. (B) Живая Drosophila яйцевая трубка загружается с общей митохондриальной пятна (Мито). Хт изображение красной линии на изображении XY показан, где В является нижней и Т является верхняя часть полученного изображения. Расстояние от основания до синей линии составляет 20 мкм. Шкала бар: 20 мкм. Конфокальный изображения были получены с параметрами , описанными в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Figure 6. Совместное окрашивание живых Drosophila овариол с TMRE и Общей митохондриальной Stain. (A) , одного оптического среза живого Drosophila яйцевая трубка со-окрашенном TMRE и общей митохондриальной пятна (Мито); * Указывает на экспериментальный артефакт, описанный в разделе обсуждения. (В) Максимальная интенсивность проекции 3 -х последовательных оптических срезов гермарии в (А); размерные стрелки указывают на регион, в котором увеличивается флюоресценции TMRE. (C) Одноместный оптический срез постмитотическими яйцо камеры со окрашивали TMRE и общей митохондриальной пятно. Верхние и нижние панели показывают плоскость фокуса на АЧХ и MBCS соответственно. (D) Box график , показывающий средние интенсивности флуоресценции TMRE и общей митохондриальной пятно количественно от индивидуальных и MBCS АЧХ в штучной упаковке в регионах (C). Усы из коробки сюжета указывают максимальное и минимальное значения для каждой группы, за исключением выбросов. таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Окрашивание Живой drp1 Null Mosaic Drosophila овариол с красителем Mito-РОС. (A) Одноместный оптический срез овариол окрашивали красителем мито-РОС. (В) Максимальная интенсивность проекции 2 последовательных оптических срезов индивидуальной яйцевой камеры с фолликула клетками в Митокрестики стадия окрашивали красителем мито-РОС. (C) Одноместный оптический срез отдельного яйцевой камеры с фолликула клетками в постмитотическими стадии окрашивали красителем мито-ROS; * Указывает на ядерный сигнал. Отсутствие UbiGFP отмечает нулевые клоны drp1. Шкала бар: 20 мкм. Конфокальный изображения были получены с параметрами , описанными в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рисунок 8. Со-иммунное Fixed drp1 Null Mosaic Drosophila овариол с dCyclinE и АТФ-B антител. (A) Максимальная интенсивность проекции 3 -х последовательных оптических срезов совместно иммуноокрашиванию гермарии. (В) Максимальная интенсивность проекции 3 -х последовательных оптических срезов со-immunosтойчивое постмитотические MBCS. Контуры разграничить UbiGFP-отрицательные нулевые клоны drp1. Шкала бар: 10 мкм. Конфокальный изображения были получены с параметрами , описанными в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9
Рисунок 9. Примеры возможного повреждения и артефактами. (А) гермарии из UbiGFP экспрессирующих яйцевая трубка фиксируют и окрашивают с помощью ДНК красителем Hoechst , показывающий неоправданные разрывы (*). (B) Яйцо палата UbiGFP , экспрессирующих яйцевая трубка фиксировали и окрашивали с ДНК красителя Hoechst , показывая вмятин / слезы (*). (C) В прямом эфире с яйцевая трубка UbiGFP-отрицательных нулевых клонов drp1 окрашивали красителем мито-РОС , показывая деформированную камеру (*) и поврежденные яйцевой камеры, позволяя частичное Окрашивание зародышевую (**); # Обозначает возможно реальное пятно неповрежденного яйца камеры в том же яйцевая трубка. (D) Прямой эфир яйцевая трубка окрашивали-РОС митохондрий краситель , показывающий общий поврежденную камеру с интенсивным артефактом окрашивания зародышевой линии. * Указывает на повреждение индуцированных сплющенные овариол с потерей сигнала UbiGFP, тем самым приводя к артефактом GFP-отрицательных клонов. Шкала бар: 20 мкм. Конфокальный изображения были получены с параметрами , описанными в таблице 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Видео 1
Видео 1. Живая ткань-FLIP анализа. Полное время курс фотообесцвечивания на основе FLIP анализа , описанного на рисунке 5..com / файлы / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите сюда, чтобы просмотреть это видео. (Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.)

Таблица 1: Конфокальные Настройки Микроскоп для приобретения Представленное Представитель изображения. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра Таблица 1. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола

Фотообесцвечивания: Предотвращение чрезмерного фотообесцвечивания флуоресцентных образцов является абсолютно необходимым для выполнения эффективной конфокальной микроскопии. Таким образом, время, используемое для обнаружения образцов через окуляр или установить параметры захвата изображений через режиме реального времени сканирования должна быть сведена к минимуму, чтобы минимизировать фотообесцвечивания.

Повреждение тканей: Так как митохондрии считаются датчики клеточного здоровья, крайне важно , чтобы гарантировать , что данные , полученные с помощью описанных методов являются физиологически актуальны и не отражают неоправданный ущерб , вызванный процедурного рассечения яичников дрозофилы. Рассечение должна быть выполнена как можно быстрее, но и с крайней меры предосторожности, чтобы свести к минимуму повреждение тканей. Среднее время для рассечения и дразня 5 Drosophila яичников составляет от 5 до 7 минут (в нашей рукес). Усилия должны быть приняты, чтобы идентифицировать яичные камеры, показывающие поврежденные ткани, которые будут исключены из анализа. Повреждение тканей из - за рассечения может включать в себя неоправданные пробелы (* на рисунке 9А, как это определено в связи с отсутствием сигнала), вмятин / слезы (* на рисунке 9Б, как это определено в связи с отсутствием сигнала), или деформации яйцевых камер (* на рисунке 9С). Тем не менее, любой значимой камеры деформации, возникающие из экспериментальной манипуляции должны быть тщательно оценены. Хотя нет покровное не используется на верхней части живой ткани в протоколе , описанном, уплощение овариол может возникнуть с чрезмерного давления , приложенного к ткани в то время как дразнят или монтажа (* на рисунке 9D). Уплощение овариол не наблюдалось с фиксированными образцами, так как протокол, описанный предполагает фиксацию тканей сразу после диссекции, с дразнящая происходит после этого. Любая изолированная яйцевой камеры без каких-либо подписей aforementioned ущерб может считаться нормальным. Механические повреждения могут возникнуть в результате диссекции может также привести к потере GFP, давая ложные GFP-отрицательных клонов 16, а также может привести к включению расширенного красителя. Учитывая , что зародышевую клетки находящиеся внутри яйца камер не являются обычно проницаемы для живых митохондриальных красителей (6 и 7), повышенное митохондриальной окрашивание зародышевых клеток дрозофилы может возникнуть в результате увеличения проницаемости поврежденных / омертвевшей ткани; такие артефактом происходит с красителем мито-РОС (** на рисунке 9в и весь яйцевая трубка на рисунке 9d), а также с другими живыми митохондриальных пятен (не показан). Потеря UbiGFP на рисунке 9D (*) может также быть результатом повреждения, вызванного уплощение яйцевых камер. Хотя другие яичные камеры в поврежденном яйцевая трубка может оставаться подлинным и артефакт бесплатно (# на рисунке 9C

Чувствительность Время: В случае живого экс естественных условиях микроскопии, данные должны быть получены в течение 15 мин монтажа ткани; в противном случае, экспериментальные результаты могут быть затронуты изменениями физиологии в связи с наступившей смертью ткани. Иногда, в зависимости от мощности лазера и других параметров сканирования, в 10 мкл монтажной среды может испаряться раньше, чем через 15 мин. Обнаружение митохондриального пула циклин Е путем совместного иммунным окрашиванием требует минимизации времени рассечение (вероятно из-за переходного характера mitochondриал циклин E бассейн , который поддерживается за счет активного митохондриального дыхания 12). Заметное митохондриальная циклин Е пул также не наблюдается с временами пермеабилизирующего менее чем за 30 минут.

FLIP: Движение любого яйцевой камеры под экспертизой во время хода FLIP может привести к артефактом анализа и , следовательно , должны быть исключены. Использование любых живых митохондриальных красителей или TMRE не рекомендуется использовать в FLIP эксперименте, так как введение иностранного красителя может изменить митохондриальную непрерывность и тем самым привести к артефактом результатам.

Стратегия перехода Drosophila: Крест обратная той , которая описана здесь (где используются самцы , несущие мутантный аллель drp1) не дает много потомства, вероятно из - за неустановленного воздействия drp1 репрессий в гетерозиготном мужских родителей.

Интерпретация клонального данных: Любые GF-отрицательных клонов , обнаруженные в яичниках контрольныхизолированы от родительского дрозофилы выражения UbiGFP указывало бы артефактом ложноотрицательные клоны, вероятно , генерируемые из - за потери GFP , вызванного повреждением во время вскрытия 16. Тем не менее, количество GFP-отрицательных клонов в тепловому шоку потомстве креста должна быть значительно выше, чем любые ложноотрицательных клонов видели в контрольной группе. Клоны , генерируемые в слое фолликула клетки Drosophila по описанной митотической стратегии рекомбинации на основе могут возникать из митотических фолликул стволовых клеток (стволовых клеточных клонов) или из митотических нестволовой фолликулярных клеток (переходные клоны). Для получения стволовых клеток клонов, экспериментальные анализы следует проводить только через 10 дней после теплового шока, когда яйцеклетка камеры с переходными клонов уже заложены. Для переходных клонов, анализы следует проводить в течение 6 дней после теплового шока, с фолликула клеточных клонов овариол без какого-либо клона фолликул клеток в гермарии.

Модификации и устранение неисправностей

При оценке потенциала митохондрий на единицу массы с помощью описанного метода, необходимо знать о потенциальных артефактов, возникающих из оптики микроскопа или митохондриальных комбинаций красителей. Любой регион , показывающий ослабленный сигнал от общего митохондриальной пятна и сравнительно повышенной TMRE сигнал (рис 5A, *) может возникнуть из - за флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) между красителями 8 или из - за различных оптических свойств красного (TMRE) и зеленый (в целом митохондриальная краситель) флуоресцентные лампы, учитывая фиксированный размер обскура в настройках приобретения. Лада, связанные с артефактом, можно было бы избежать за счет снижения концентраций красителя, если это возможно, в то время как количественный анализ может быть выполнен на проекции 2 - 3 последовательных оптических срезов, чтобы избежать оптических артефакт. Кроме того, если флуоресцентный сигнал обнаружен в перекрестных помех и перекрестного возбужденияканалы, параметры лазера и детектора необходимо отрегулировать, чтобы свести к минимуму сигнала в этих каналах, которые, как ожидается, чтобы уменьшить флуоресцентного сигнала в оптимальных каналов, а также.

Лазер-индуцированное поврежденная от повторяющийся фотообесцвечиванию может привести к митохондриальной фрагментации и, таким образом, вызвать митохондриальную разрыв, предотвращая успешную FLIP. Подозревается фрагментации митохондрий во время выполнения протокола FLIP могут быть идентифицированы путем получения изображений более высокого разрешения с уменьшенным точечным (и повышение коэффициента усиления детектора). Если фрагментация митохондрий заметно заметили во время выполнения протокола FLIP, мощность отбеливающего лазера должна быть уменьшена и / или интервал между последовательными отбеливателей должна быть увеличена. Если есть общее отбеливание во время хода Обратной эксперимента (сигнал от желтого ROI на фигуре 3В и С), лазерное сканирование должно быть повторно доводили до уровнячто позволяет минимальным или какого-либо общего фотообесцвечивание.

Для того, чтобы избежать потенциальной артефакт из-за потери повреждения индуцированного GFP, GFP-положительных клонов может быть введена с использованием стратегии MARCM, следуя описанной теплового шока протокола. Здесь уместно дрозофилы , которые будут использоваться для креста девственница drpKG03815 FRT40A / CYO X мужской Gal80 FRT 40A / CYO; ванна-Gal4, UAS-CD8GFP / ТМ6 9. Прямым крылом потомством следует использовать для генерации клонов с использованием теплового шока (как это описано на шаге 6).

Ограничения техники

А) В то время как фолликула клетки , находящиеся на поверхности живых яйцевых камер Drosophila включают митохондриальных окрашивания красители, зародышевой клетки внутри яйцевой камеры не в состоянии сделать это; зародышевую младших стадий испачкать слабо (рисунки 5 и 6). Б) в прямом эфире экс естественных Tissuэлектронной микроскопии должна быть выполнена в течение 15 мин завершения окрашивания на яичниках , выделенных из индивидуального дрозофилы, по одному за раз. Поскольку экспериментальные группы должны быть обработаны и отображены в тот же день, общее время , необходимое для получения статистически значимых данных из живого экс виво микроскопии ткани из различных экспериментальных групп является достаточно больше , чем полученные из фиксированных тканей. C) Мы отметили , что пятно мито-РОС не была очень стабильной в естественных условиях экс Drosophila ткани, вероятно , из - за переходного характера ROS аналита он обнаруживает 17,15, что может лежать в основе отсутствия обнаружения сигнала от всех drp1 нулевые клоны. Тем не менее, любая биологическая значимость изменчивости в Мито-РОС окрашивания в нулевых клетках drp1 / клоны не могут быть исключены и должны быть предметом дальнейшего расследования. Следует отметить, что положительный сигнал от пятна мито-РОС не может просто отражать повышенную супероксид, но и повышенную митохондриальную или cellulА.Р. окислительный среда 15. D) в целом митохондриальной пятно не может быть использован для GFP-отрицательных или GFP-положительных клональных экспериментов, так как спектр флуоресценции этого митохондриальной пятна и GFP неразличимы. E) FLIP эксперимент предназначен для анализа непрерывности митохондриях потребует получения изображения с открытым отверстием , которая охватывает разрешение митохондриальных структур.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Изучение структурно-функциональных отношений митохондриальную имеет решающее значение для полного понимания механизмов регуляции митохондриальной функциональных возможностей. Поскольку митохондриальные дефекты вносят значительный вклад в различных заболеваний, включая диабет, рак, болезнь Паркинсона, детальное понимание митохондриальной образа действий держит обещание facilitatiнг развитие митохондрии направленного терапевтических стратегий. Live-клеточная микроскопия является незаменимым инструментом для изучения структурно-функциональных отношений митохондриальную. Тем не менее, большинство из этих исследований были ограничены изолированных клеток. Изучение митохондриальной структуры и функции были расширены , чтобы жить дрозофилы ткани в установке 9 ех естественных условиях. Описанный протокол этого и связанных с ними исследований приведет к пониманию митохондриальной структуры и функции в живых яичниках Drosophila, ех естественных условиях, позволяя понимание митохондрий в физиологическом контексте. Этот подход ех естественных условиях имеет значительные преимущества по сравнению с исследованиями в пробирке, так как регулирование метаболических и энергетических свойств митохондрий в данной клетке во многом зависит от наличия питательных веществ и соответствующей сигнализацией в физиологическом контексте клетки.

Генетические манипуляции миtochondrial структура, подавляя митохондриальную белка деления drp1 deregulates клеточного цикла модулятор циклин E и влияет на развитие клеточного слоя фолликула Drosophila 9,12. Здесь протокол включает в себя описание того , как ввести функционально нулевые клоны drp1 в яичниках дрозофилы для изучения структурно-функциональных отношений митохондриальную. Роман пул митохондриальной циклин Е на клетках млекопитающих, а также у Drosophila фолликул клеточный слой 12, был успешно обнаружен, что , вероятно , лежит в основе сообщенного регуляцию циклин Е митохондриями 18. Здесь, рукопись демонстрирует метод обнаружения нового митохондриальную циклин Е пул путем совместного иммуноокрашивания фиксированной Drosophila яичников для dCyclinE и митохондриального маркера (ATP-B).

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

Учитывая, тшляпа дрозофилы это мощная генетическая модель системы, наши описанные способы , как ожидается, в значительной мере способствовать пониманию генетической основы структурно-функционального отношения митохондриального в здоровье и болезни. Drosophila широко используется чесать генетических взаимодействий , приводящих к онкогенеза 19. Возможность генерации клонов в слое эпителиальных фолликул клеток дрозофилы позволяет исследовать взаимодействия митохондрий и онкогенов или супрессоров опухолей в отдельных онкогенных клонов в естественных условиях и бывших естественных условиях установки. Описанные методы могут быть использованы для изучения регуляции митохондриального структурно-функциональных взаимоотношений на яичниках , выделенных из соответствующих мутанта дрозофилы. Описанные методы могут быть дополнительно расширены для изучения прямого воздействия различных питательных веществ и фактора роста сигнализации на митохондриальной структуры и функции через exogтиазом добавление соответствующих питательных веществ и / или факторов роста в естественных условиях среды экс визуализации. Описанные методы могут быть соответствующим образом изменены и использованы в других изолированных тканях Drosophila, как и личиночных имагинальных дисков, которые широко используются для изучения путей сигнальной трансдукции в таких заболеваний , как рак 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics