Studere Mitokondriel struktur og funktion i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. J. Vis. Exp. (119), e54989, doi:10.3791/54989 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitokondrier er klassisk beskrevet som den cellulære kraftcenter, da de er de vigtigste pladser i energiproduktionen i differentierede celler. Desuden mitokondrier spiller en kritisk rolle i stofskiftet, varmeproduktion, lipid modifikation, calcium og redox homeostase, orkestrering af celle- signalering processer, etc 1. Mitokondrier spiller også en aktiv rolle i induktion af celledød 2, samt i cellecyklus regel 3. Sådanne multifunktionalitet rejser følgende grundlæggende spørgsmål: a) hvordan mitokondrier udføre alle disse funktioner samtidig og b) er der specifikke mitokondrie puljer eller underområder, der er specialiseret til forskellige funktioner? I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at de multifunktionelle mitokondrier er dynamiske i deres form, størrelse og struktur i individuelle celler, og at steady-state form af mitokondrier kan variere mellem celletyper. Årtiers forskning fra forskellige laboratorier tyder på, at ændring af mitokondrie form, størrelse og struktur, samlet kaldes mitokondrie dynamik, er afgørende for at opretholde forskellige mitokondrie funktioner 4,5,6. Disse resultater rejser muligheden for, at mitokondrier kan udføre deres multifunktionalitet i kraft af deres strukturelle dynamik.

Omfattende indsats i gang for at forstå den mitokondrielle struktur-funktion forhold. Dynamikken i mitokondriestruktur primært vedligeholdes af deres evne til at undergå fission og fusion arrangementer med hinanden. Spaltning af store mitokondrier omdanner dem til mindre mitokondrielle elementer, mens fusion mellem to mindre mitokondrier fletter dem i en større mitokondrie element 7. Desuden kan forbigående fusion af to mitokondrier forekomme for at tillade blanding af deres indhold. De fission og fusion begivenhederne i de indre og ydre mitochondriemembraner er omhyggeligt styret af specSp ec ifik sæt af proteiner. Kernen fission maskiner er sammensat af dynamin-relateret protein 1 (Drp1), som er rekrutteret fra cytosolen til mitokondrierne ved dets interaktion med visse bona fide mitokondrielle proteiner (f.eks Fis1 eller MSpol frem1), mens Drp1 funktion også kan reguleres ved andre proteiner på mitokondrie flade 4. Selv Drp1 opererer på den ydre membran, dets fission evner påvirke den indre membran samt. Den orkestrering af fission af ydre og indre mitochondriemembraner er ikke godt forstået. På den anden side er fusion af den indre membran er omfattet kernen af aktiviteterne i Opa1, mens mitofusins regulerer fusion af ydermembranen 5. Den resterende del af de modvirker fission og fusion begivenheder mitokondrier diktere steady-state mitokondrie form i en celle. For eksempel ville undertrykkelse af mitokondrie fission resultere i fuldstændig og enstemmigt fusion, medens overaktivitet af mitokondrierl fission ville resultere i fragmentering af mitokondrier 3.

Studiet af mitokondriestruktur-funktion forhold aktiverer primært to gratis fremgangsmåder: a) analyser af de cellulære og organismal fænotyper efter genetisk manipulation af mitokondrielle fission / fusionsproteiner og b) direkte vurdering af mitokondrisk struktur og funktion. Det er bemærkelsesværdigt, at genetiske analyser ikke altid kan afsløre direkte funktionalitet af molekylet ved hånden (i dette tilfælde, mitokondriske fission / fusionsproteiner), som kan opstå de fænotyper på grund af sekundære virkninger. Derfor er det af største vigtighed at udvikle og anvende værktøjer til at studere mitokondrielle struktur og funktion direkte. Enhver vurdering af mitokondriestruktur involverer forskellige mikroskopi værktøjer. Anvendelse af fluorescens mikroskopi af levende celler har i høj grad avancerede studier af mitokondrie dynamik, da mitokondrie dynamik kan overvåges både kvalitativt og quantitatlukkende at bruge de passende fluorescens mikroskopi værktøjer og teknikker 8. Fluorescensmikroskopi-baserede værktøjer er blevet udviklet til at studere mitokondrielle struktur og funktion i levende og faste Drosophila melanogaster væv, belyse betydningen af mitokondrie dynamik in vivo 9. Disse og beslægtede metoder er beskrevet her, med det mål at studere mitokondrisk struktur og funktion i Drosophila æggestok.

Den Drosophila æggestok består af kimcellelinje og somatiske slægter, som stammer fra deres respektive voksne stamceller, der findes i germarium 10,11. Seksten syncytial kønsceller (GCS) bliver indkapslet af somatiske follikelceller (FCS) for at danne individuelle æg kamre, der dukker op af germarium (figur 1). En af de 16 GCS gå forpligtet til at blive en oocyt, og de resterende 15 GCS udvikle sig til sygeplejerske celler, som understøtter væksten af ​​oocyt kammerLette modningen af ​​ægget, før det er lagt. Størstedelen af ​​FCS undergår 9 runder af mitotiske inddelinger før de forlader den mitotiske cellecyklus til terminalt differentiere til en mønstret epitelcelle lag bestående af forreste follikelceller (AFCs), posterior follikelceller (PFC), og væsentligste kropsceller (MBC'er) . De konsekutive æg kamre er forbundet ved stilk celler, der differentierede celler, der også stammer fra FCS tidligt i udviklingen. Mitokondrie form reguleret af mitokondrie fission protein Drp1 er aktivt involveret i processen med differentiering under den normale udvikling af Drosophila æggestokkene FC lag 9,12. De anvendes i disse undersøgelser for at identificere inddragelsen af Drp1 i Drosophila follicle cellelag udvikling metoder er beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Drosophila (de nødvendige værktøjer er afbildet i figur 2A)

  1. For enhver af de beskrevne eksperimenter, indsamle Drosophila (holdes ved stuetemperatur, eller 25 ºC) inden for 5 dage eclosion og placere dem i et hætteglas fyldt til punkt 5 - 7 ml Drosophila mad (se Materialer tabel), med ikke mere end 25 fluer i hvert hætteglas; opretholde en kvinde: mand forhold på 2: 1.
  2. Drys en lille mængde granuleret gær til at stimulere Drosophila ægproduktionen. Udføre eksperimentel manipulation inden for 2 - 4 dage.

2. Dissektion af Drosophila Ovarier (de nødvendige værktøjer er afbildet i figur 2A)

  1. Varm insekt dissekere medium (se Materialer tabel) til stuetemperatur, 25 ° C. Fyld tre brønde af en otte-brønds glas dissekere fad, med 200 pi medium i hver brønd.
  2. Bedøver Drosophila med CO Drosophila på et tidspunkt, hvor udfører live mikroskopi.
  3. Mens du ser gennem okularet af dissektion mikroskop, skille thorax fra underlivet bruger to par pincet. Brug af pincet, omhyggeligt overføre abdomen til den anden brønd i skålen.
  4. Brug en tang til at holde maven ved den bageste ende, og langsomt skubbe æggestokkene ud (sammen med de andre abdominale indhold) med det andet par pincet. Hvis dette forsøg mislykkes, forsigtigt fjerne den abdominale Exoskeleton ved at indsætte pincet ind i den forreste ende til at frigive æggestokkene.
  5. Ved hjælp af pincet, holde en individuel æggestok ved uigennemsigtige bageste ende (dvs. blommen fyldt, sene æg), og flyt den forsigtigt til den tredje brønd af skålenfor drilleri der behandler dem for levende mikroskopi (trin 3) eller til fastgørelse til udføre immunfarvning (trin 7).
  6. drille forsigtigt den beskyttende kappe fra hele æggestokkene ved at feje en drillende nål let fra den bageste til den forreste ende af hver æggestok, mens du holder det ved den bageste ende med en pincet.
    BEMÆRK: For at minimere skader under drilleri, bøje nålespidsen og zoome ind på hver æggestok ved at øge forstørrelsen af mikroskopet (figur 2A). Teasing bør være effektive nok til at bryde hylsteret, men det bør også nøje gøres for at bevare integriteten af ​​de ovarioles.

3. Forberedelse til Live-væv Microscopy

BEMÆRK: nødvendige værktøjer er afbildet i figur 2A.

  1. Før Drosophila dissektion, forberede polyL-Lysin coatede kamre. Til dette formål placere to 20-pi dråber polyL-Lysin (0,1 mg / ml) på coverglass (14 mm, Nr 0) af et glas-bund petriskål (35 mm) i en rimelig afstand fra hinanden for at forhindre sammensmeltning af dråberne. Lufttørres pladerne i 1 time ved 37 * C og markere kanterne af hvide polyL-lysin film på undersiden af ​​pladen med en sletbar markør.
    BEMÆRK: polyL-lysin-coatede kamre kan opbevares ved 4 ° C i en uge. Hvis du bruger en tidligere belagt kammer, bringe det til stuetemperatur, før du starter Drosophila dissektion.
  2. Indstil scanning parametre i konfokale mikroskop for at sørge for, at prøven kan afbildes umiddelbart efter afslutningen af ​​dissektion og montering, som nedenfor.
  3. Placer en dissekeret og drillede ovarie (efter trin 2 og farvet, hvis det kræves, efter trin 5) på en markeret polyL-lysin-coatede region og sprede ovariet med drilleri nål for at adskille ovarioles. Placer en 10-ul dråbe insekt dissekere medium oven i æggestokkene, og sørg for at dække than hele polyL-lysin-coatede område. Dæk petriskål.
  4. Umiddelbart udføre konfokal mikroskopi af monterede prøve ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Kun en Drosophila bør dissekeret, behandles og afbildes på et tidspunkt. Desuden bør mikroskopi ikke udføres ved 37 ° C, som vil efterligne et varmechok miljø for Drosophila væv.

4. Fluorescens Loss I Fotoblegning (FLIP) Indhold til Vurdere Mitokondriel Matrix Kontinuitet

BEMÆRK: Mitokondrisk matrix kontinuitet i et fusioneret mitokondriestruktur etableres efter at hele sammensmeltning af mitokondrie indre og ydre membraner efter en progression gennem de mellemliggende trin. Spaltning af mitokondrier kan følge de samme trin, men i den modsatte retning (figur 3A). FLIP er en tid-lapse mikroskopi-baserede semikvantitativ metode, der kan anvendes til at vurdere mitokondrielle matrix kontinuitet iendelig smeltet tilstand af ex vivo mitokondrier (trin 3 og 4 i figur 3A) i levende Drosophila æggestokke 9. FLIP analysen udføres som en lille region af interesse (ROI) af mitokondrier udtrykker et fluorescerende molekyle i den mitokondriske matrix, som Lysblegede med regelmæssige intervaller (FLIP ROI i figur 3A). Som følge heraf vil enhver omgivende mitokondrie region, der er kontinuert med klappen ROI (eksperimentel ROI i figur 3A) miste signal på grund af udvekslingen af molekyler i den kontinuerlige mitokondrie matrix. Klappen eksperimenter viste her udføres på transgene Drosophila udtrykkende mitoYFP, som indeholder den mitokondrielle målretning sekvensen af det humane cytokrom oxidase VIII subunit tagget med YFP at målrette det til den mitokondrielle matrix i et frit diffunderbart formular. Et lignende forsøg kan også udføres med mito pUASP-mito-GFP transgen, som tidligere rapporteret <sup> 9. En lignende FLIP protokol kan anvendes med en probe målrettet til den mitokondriske inter-membran plads til at kunne detektere kontinuiteten resulterende fra fusionen af den ydre, men ikke de indre mitokondrielle membraner (trin 2 i figur 3A).

  1. Åbn købet billedet software på konfokal mikroskop og angive de relevante scanningsparametre i "Acquisition" fanen (tabel 1). Check "Tidsserier", "Blegning," og "Regioner" bokse til at åbne de enkelte faner. Sæt de relevante erhvervelse parameterværdier i hver fane (tabel 1).
    BEMÆRK: pinhole skal stå åben, da dette eksperiment er designet til at overvåge den samlede signal fra hele mitokondrie befolkningen i de enkelte celler.
  2. Brug okularet til hurtigt at finde det område af interesse i den monterede levende væv.
    BEMÆRK: Vælg de ovarioles der er godt spredt på glasset-Bottomed skålen, da konfokal mikroskopi kan ikke udføres på flydende ovarioles.
  3. Klik på "live" for at erhverve et live billede af det valgte område af interesse. Klik på "stop" for at stoppe levende scanning.
  4. Om nødvendigt justeres erhvervelse parametre, at det fundne fluorescerende signal er under mætning niveauer (angivet ved fravær af røde pixels, når "rækkevidde indikatoren" er markeret), med den definerede baggrund som fastsat ved at justere offset værdier.
  5. Tegn en lille ROI ved hjælp af Bezier tegneværktøj fra fanen "Regioner" for at afgrænse fotoblegning zone på billedet overtaget af levende scanning.
    BEMÆRK: Størrelsen af ROI bør være ca. 20 - 50% af den samlede fluorescerende mitokondrie signal i cellen.
  6. Udfør erhvervelse billedet ved at klikke på "start eksperiment."
  7. Kvantificer fluorescensintensiteten ved hjælp af proprietære eller open source-software (se MaterialerTable). Gennemsnitsværdien signalet fra ROI hvor den gentagne blegning er målrettet (FLIP); den ROIs hvor blegning ikke er blevet udført i den samme celle (Eksperimentel); ROI fra en anden ubleget celle i samme synsfelt, til vurdering af den samlede blegning i forsøgsperioden (Blegning); og ROI på baggrunden området (Baggrund). Fratræk den gennemsnitlige baggrundssignal opnået fra middelværdien signal i den anden ROIs. Normalisere fluorescerende signal med det oprindelige pre-blegemiddel signal for den respektive celle.
  8. Plot de normaliserede data ved hjælp af en hvilken som helst standard plotte software.

5. Levende Farvning med fluorescerende mitokondrie Farvestoffer

BEMÆRK: Steady-state mitokondrie struktur og potentiale kan vurderes ved hjælp af farvestoffer, der specifikt indarbejde i mitokondrier i levende celler og væv. Levende Drosophila ovarier kan farves ex vivo med fluorescerende mitochondrialpletter at visualisere mitokondrierne, at vurdere mitochondriske reaktive ilt arter (mito-ROS) produktion, og vurdere mitokondrie potentiale per masseenhed. Dette kan opnås ved co-farvning med den mitokondriske potentiometrisk farvestof tetramethylrhodamin ethylester (TMRE) og en kompatibel levende mitokondrie plet repræsenterer mitokondriemasse (se Materialer Tabel til de specifikke farvestoffer).

  1. Fortynd status over de pletter i varmt insekt dissekere medium til de endelige arbejdsbetingelser koncentrationer: mitokondrie plet, 250 nM; TMRE, 50 nM; og mito-ROS plet, 5 uM.
  2. Efter dissektion og drille æggestokkene efter trin 2, skal du placere æggestokkene i 200 pi en bestemt farvning løsning i en brønd i en dissektion fad. Inkubere dem i 10 minutter med skålen dækkes af en egnet kasse omviklet med aluminiumfolie for at beskytte den mod lys. Vask de farvede æggestokke ved at flytte dem forsigtigt med en pincet i 3 på hinanden følgende boringer containing medium uden plet.
  3. For co-farvning med TMRE og den kompatible samlede mitokondrie pletten, følger ovenstående protokol til at farve først med TMRE og derefter straks med det overordnede mitokondrie pletten (uden vasketrin i mellem).
  4. Monter æggestokkene på en polyL-lysin belagt glas-bund fad efter trin 3 og forberede konfokal mikroskopi med de relevante scanningsparametre (tabel 1), efter trin 4,2-4,4.
    BEMÆRK: Signalet fra de inkorporerede farvestoffer varede ikke når man forsøger at montere de farvede prøver i monteringsmedium.
  5. Kontroller Z-sektionering boksen for at åbne fanen. Drej fokuseringshjul mod bunden af ​​prøven, mens den bliver levende scannet og klikke på "indstilles først" til at definere det nederste Z-sektion. Gør det samme, mens du flytter fokus hjulet mod den anden retning for at definere den øverste sektion.
  6. Udfør erhvervelse billedet ved at klikke på "start eksperiment."
  7. Kvantificer baggrunden korrigeret fluorescensintensitet fra ROI'er for baggrunden signal og de enkelte celler (som i trin 4.7) og plot dataene ved hjælp af enhver plotte software.

6. Generering af Drp1 Null Mosaics

BEMÆRK: klonale anvendte strategi her introducerer grønne fluorescerende protein (GFP) -negative Drp1 null kloner i baggrunden af en GFP-positive, fænotypisk vildtype baggrund, der er genotypisk heterozygot for Drp1 null mutation 9. Heat shock-induceret flippase-flippase target anerkendelse (FLP-FRT) -medieret stedsspecifik mitotisk rekombination skaber homozygote kloner af funktionelt null drpKG03815 allel. Den genotype Drosophila bærer Drp1 mutant er drpKG03815 FRT40A / CYO, mens genotypen bærer varme chok-induceret FLP (hsFLP) og UbiGFP klonede markør er hsflp; ubiquitin NLS-GFP (UbiGFP) FRT 40A / cyo. Genotypen af ​​SEkeret afkom af krydsning mellem de ovennævnte genotyper er hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

  1. Synkroniser Drosophila for jomfru samling ved at flytte dem ind i nye hætteglas med friske fødevarer hver 2 til 3 dage. Overvåg pupariating hætteglas dagligt for at indsamle nye jomfruelige hunner.
  2. Saml rød-eyed, krøllet-wing virgin hunner fra Drp1 mutant genotype hver dag, en gang om morgenen og en gang om aftenen, og placere dem i et separat hætteglas. Parallelt hermed indsamle mandlige Drosophila med mørkerøde øjne og lige vinger bærer hsflp og UbiGFP senest 5 dage efter eclosion.
  3. Opsæt et kryds ved at tilføje hannerne til Jomfru hunner med en kvindelig: mand-forhold på 2: 1.
  4. Drys en lille mængde granuleret gær til at stimulere ægproduktionen.
    BEMÆRK: Flyt forsigtigt Drosophila til et frisk hætteglas af medier hver 2. til 3. dag at øge mængden af afkom og reducere hætteglas fortrængning.
  5. enesthetize, sortere og indsamle straight-vingede, rød-eyed kvindelige afkom inden for 5 dage eclosion.
  6. For varmechok, placere det opsamlede Drosophila i tomme hætteglas med en lille mængde granuleret gær og en lille, blød tørre (for at absorbere fugt under varmechok). Placer hætteglasset med Drosophila i et vandbad ved 38 * C i 1 time, til at generere primært follikel cellekloner, og ved 37 * C i 1 time to gange dagligt (lade mindst 5 timer mellem de 2 varmechok) i 2 på hinanden følgende dage , at generere både kimcellelinje og follikelstimulerende cellekloner.
    BEMÆRK: Sørg for, at hætteglasset er helt nedsænket i vand op til niveauet for stikket.
  7. Varmen chok kan gøre Drosophila immobile. Lade dem afkøle-chokeret Drosophila restituere i 1 time ved stuetemperatur, når de bliver mobile igen.
  8. Tilføj hannerne tilbage til hunnerne i samme forhold som i korset, og flytte dem til friske hætteglas med medium drysses med en lille mængde granuleret gær. Opretholde Drosophila i mindst 5 dage.
  9. Dissekere æggestokkene som er nødvendigt for en levende eller fast eksperiment.
    BEMÆRK: Ovarier isoleret fra den parentale Drosophila udtrykkende UbiGFP bør anvendes som negative kontroller for at bekræfte effektiv induktion af GFP-negative kloner ved varmechok.

7. Co-immunfarvning for cyclin E og Mitokondrier

BEMÆRK: For at opdage Drosophila cyclin E (dCyclinE), har vi brugt en kommercielt fremstillet antistof rejst specifikt mod dCyclinE 9 (se Materialer tabel). Som mitokondrie markering, anvendte vi et antistof mod ATP-B (en underenhed af mitokondrie ATP syntase kompleks) 9.

  1. Varm 4% paraformaldehyd (PFA) til stuetemperatur, 25 ° C. Forsigtighed! Paraformaldehyd er giftigt.
    BEMÆRK: Efter åbningampullen bør PFA opbevares ved 4 ° C og anvendt inden for 7 dage. Dette er fordi opbevaring af PFA kan tillade oxidation til methanol, hvilket dramatisk ville ændre mitochondriemembraner under fiksering, selvom stede i spormængder.
  2. Umiddelbart efter dissektion, fastsætte de dissekerede æggestokke ved at placere dem i 200 pi frisk PFA i en brønd i en glas dissekere fad (uden drillende). Hold fadet i et stinkskab i 15 min. Vask de faste æggestokke ved at flytte dem forsigtigt med pincet i 3 på hinanden følgende brønde, der hver indeholder 200 pi 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Eksperimentet kan stoppes her og prøverne kan efterlades ved 4 ºC i 1 dag.
  3. Drille æggestokkene mere grundigt i PBS (svarende til trin 2.6) til forsigtigt at fjerne det beskyttende fiberholdigt kappe, der kan hindre antigen adgang af antistoffet.
  4. Permeabilisere de drillet æggestokke ved at placere dem i et mikrofugerør med 500 pi frisk gjort 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) og inkuberes i 30 minutter under rokkende ved 25 rpm.
    BEMÆRK: Under den rokkende, placere rørene parallelt med rokkende bevægelse; placere dem vinkelret kan tillade vævet at holde sig til hætten af ​​rørene, hvilket resulterer i væv tab.
  5. For at fjerne PBS-TX, placere mikrofugerør i et rack at tillade væv at slå sig ned på bunden af ​​rørene. Undersøg dem visuelt og tryk rørene, hvis det er nødvendigt, for at bringe enhver flydende væv ned til bunden. Aspirer opløsningen forsigtigt fra toppen og sikre, at vævet i bunden af ​​rørene forbliver uforstyrret.
  6. Blokere æggestokkene ved at tilsætte 200 pi 2% bovint serumalbumin (BSA) opløst i 0,5% PBS-TX, og inkuber det på rocker ved stuetemperatur i 1 time. Fjern det blokerende middel ved følgende trin 7.5.
  7. Tilføj primære antistoffer i 200 pi frisk blokeringsmiddel: anti-kanin dCyclinE antistof (1: 100) og anti-muse ATP-B-antistof(1: 100). Inkubér væv på vippen i 2 timer ved stuetemperatur.
  8. Vask ovarierne med PBS-TX 3 gange i 15 minutter hver, efter trin 7.5.
  9. Tilsæt 200 pi af de passende sekundære antistoffer i frisk PBS-TX: anti-muse-CY3 (1: 1.000) og anti-kanin-CY5 (1: 500). Inkuber på rocker i 1 time ved stuetemperatur.
  10. Vask ovarierne med PBS-TX 3 gange i 15 minutter hver, efter trin 7.5.
  11. At farve DNA'et, tilføje Hoechst (1: 1.000 fortynding) til den endelige PBS-TX vask.
  12. Endelig forlader vævet i 500 pi 1x PBS.
  13. Ved hjælp af en 1-ml mikropipette, fjerne immunofarvet æggestokke fra mikrofugerøret i en frisk brønd i en glas dissekere skål indeholdende 200 pi PBS.
  14. Tilsæt en dråbe glycerol-baserede montering medium til et objektglas og tilsæt immunfarvet æggestokke én efter én til montering medium.
    BEMÆRK: Sørg for, at æggestokkene faktisk overføres til montering medium. Ikke at gøre so vil føre til tab af væv.
  15. Kig i dissektion mikroskop, forsigtigt plukke de transparente ovarioles (yngre stadier) fra de uigennemsigtige modne æg kamre ved hjælp af drilleri nål, mens du holder uigennemsigtige del af æggestokkene med pincet. Fjern de modne æg kamre fra montering medium.
  16. Placer en dækglas (22 mm, No. 1) på dias og tryk let at sikre, at monteringen medium spredes jævnt nedenunder.
    BEMÆRK: Hvis du trykker på dækglasset sikrer også korrekt tilpasning af vævet langs dækglas. I modsat fald optimalt kan tillade mindre etaper til at flyde i montering medium, hvilket forhindrer en optimal mikroskopi af disse væv.
  17. Lufttørres prøverne i 15 minutter og forsegle kanterne af dækglasset forsigtigt med neglelak.
  18. Udfør konfokalmikroskopi som pr eksperimentel behov (tabel 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium) Fisher Scientific 30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ Electronic Microscopy Sciences 50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) Life Technologies m7514 Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate Sigma Aldrich 87917-25MG Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain) Life Technologies m36008 Reconstitute and Aliquot
PolyLysine MP Biomedicals ICN15017625
Fly Vials Fisher Scientific AS-515
Fly Conicals Fisher Scientific AS-355
Fly Vial Flugs Fisher Scientific AS273
Fly Conical Flugs Fisher Scientific AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) Fisher Scientific AS153
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300) Santa Cruz sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker AbCam ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-175-144
Hoechst Fisher Scientific H3570
VectaShield Fisher Scientific H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides Fisher Scientific 22-026-252
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish Fisher Scientific P35G-0-14-C
Active Dried Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Confocal Microscope Carl Zeiss LSM 700
Dumont #5 Forceps Fine Science Technologies 11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Technologies 26016-12
Minutien Pins Fine Science Technologies 26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) Bloomington Stock Center 7194
Fly Pad Fly stuff 59-118
Blowgun Fly stuff 54-104
Blowgun needle Flystuff 54-119
Dissecting Microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Analyses software Carl Zeiss Zen 
Analyses software Open source Image J
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono  QImaging QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1 QImaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  2. Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337, (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. (2013).
  4. Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23, (4), 427-434 (2011).
  5. Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
  6. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17, (4), 491-506 (2013).
  7. Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
  8. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 21-21 (2010).
  9. Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197, (4), 487-497 (2012).
  10. Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33, (2), 124-134 (2011).
  11. Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (3), 447-457 (2012).
  12. Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128, (22), 4171-4182 (2015).
  13. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (29), 11960-11965 (2009).
  14. Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30, (34), 11369-11378 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48, (8), 983-1001 (2010).
  16. Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2, (12), 1313-1320 (2013).
  17. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, (1), 1-13 (2009).
  18. Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9, (6), 843-854 (2005).
  19. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229, (1), 27-33 (2014).
  20. Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
  21. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63, (2), 411-436 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics