본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
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Biochemistry

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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Abstract

Introduction

21 세기 의료의 주요 과제 중 하나는 알츠하이머 병 (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환이다. 타우 미세 소관 (MT)의 형성을 자극 미세 소관 - 연관된 단백질이다. 타우 동등하게, 여러 가지 신경 퇴행성 질환에서 가장 잘 알려진이 AD로되어있는 소위 퇴행성 신경을 참여하고있다. 이러한 질환에서, 타우 쌍 나선형 필라멘트 (PHFs)에서 자기 집합체와는 같은 인산화 1과 번역 후 수정 (PTMS)에 의해 많은 잔류에 수정 발견된다. 타우 단백질의 인산화는 MT 안정화 및 AD 신경 세포의 특징 기능의 병리학 적 손실의 생리 기능을 모두 조절에 관여한다.

질병 뉴런 PHFs에 통합 될 때 더욱이, 타우 단백질은 언제나 2 hyperphosphorylated된다. 2 ~ 3 인산염 그룹을 포함하는 일반 타우는 달리, PHFs에서 hyperphosphorylated 타우 5-9 phosphat을 포함전자 그룹 3. 타우의 과인산 일부 사이트에서와 인산화의 병적 인 사이트라고 추가 사이트의 인산화에 화학 양론의 증가에 모두 해당한다. 그러나, 중복 레벨 4의 양적 차이에도 불구하고, AD 및 인산화의 정상 성인의 패턴 사이에 존재합니다. 어떻게 특정 인산화 이벤트에 영향을 미치는 기능과 타우의 기능 부전은 크게 알려지지 않은 남아있다. 우리는 분자 수준에서 PTMS에 의해 타우 규제를 해독하는 것을 목표로하고 있습니다.

타우의 분자 측면의 이해를 깊게하기 위해, 우리는 기술적 인 문제를 해결해야합니다. 첫째, 타우 솔루션에 고립 본질적으로 무질서 단백질 (IDP)입니다. 이러한 단백질은 생리 학적 조건에서 잘 정의 된 세 가지 차원 구조를 결여하고 그 기능 (들) 및 구조적 특성을 연구하기 위해 특정 생물 물리학 적 방법이 필요합니다. 타우는 실향민의 성장 클래스에 대한 패러다임, 자주와 관련된 발견이러한 신경 퇴행성 질환과 같은 병리, 따라서 그 기능의 기초가되는 분자 파라미터를 이해하기 위해 관심을 증가시킨다. 둘째, 타우 인산화 특성은 최장 441 아미노산 타우 이성체의 순서에 따라 80 전위 인산화 부위와 분석 도전이다. 항체의 다수의 타우 인산화 에피토프에 대해 개발되어 뉴런 또는 뇌 조직 병리학 타우 검출을 위해 사용된다. 인산화 이벤트는 프롤린이 풍부한 지역 내 가까이에 그들의 대부분, 프롤린 지시 키나제의 대상이 적어도 20 사이트에 일어날 수있다. 정 성적 (어떤 사이트?) 및 (화학량 무엇?) 정량적 특성은 가장 최근에 MS 기술 (5)에 의해 곤란하다.

NMR 스펙트럼은 매우 이형태 앙상블 구성 동적 시스템이다 무질서 단백질을 연구하는데 사용될 수있다. 고해상도 NMR 분광법 어플리이었다에드는 타우 단백질의 양 구조와 기능을 조사합니다. 8 - 또한, 타우의 인산화 프로파일의 복잡도 인산화 부위 (6)의 식별을위한 NMR을 이용하여 분자 도구 새로운 분석법의 개발을 이끌었다. 분석 방법으로 NMR은 인산 결합의 정도의 글로벌 방식으로 타우 인산화 사이트의 식별, 하나의 실험에서 모든 단일 사이트 수정의 시각화 및 정량화 수 있습니다. 타우 인산화 과정은 문헌에 풍부하지만, 이들 대부분은 인산화 프로필 불확실성의 큰 정도 따라서 개별 인산화 이벤트의 실제 영향을 떠나는 항체 수행 되었기 때문에이 점은 중요하다. PKA, 글리코겐 신타 제 키나제 3β (GSK3β), 사이클린 의존 키나제 2 / 사이클린 A (CDK2 / CycA에 의해서), 사이클린 의존 키나제 5 (CDK5) / P25의 행위를 포함하는 재조합 키나제향해 타우 인산화 활성을 나타내는 ivator 단백질 세포 외 신호 조절 키나아제 2 (ERK2) 및 미세 소관 연관 조절 키나아제 (MARK)는, 활성 형태로 제조 될 수있다. 또한, 잘 특성화 인산화 패턴 특정 타우 단백질 이소 형을 생성 할 수 타우 돌연변이 타우의 인산화 코드를 해독하는데 사용된다. 8 - NMR 분광법이어서 효소 변성 타우 샘플 6을 특성화하기 위해 사용된다. 타우 인산화 시험관은 글루탐산 (Glu가) 잔기로 선택 빼앗아 /의 Thr 돌연변이 등에 의해 의사 인산화보다 더 도전이지만,이 방식은 장점을 갖는다. 실제로, 인산화도 구조에 미치는 영향도 상호 작용 매개 변수는 항상 글루타민산 산으로 모방 할 수있다. 예 글루 돌연변이 9 재현되지 포스 포세린 (202) (pSer202)의 주위에 관찰 턴 모티브 / phosphothreonine 205 (pThr205)입니다.

체외 인산화 타우의 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 12 - ERK2은 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / ERK 키나제 (MEK) (10)에 의해 인산화에 의해 활성화된다. 개질 된, 동위 원소로 표지 된 타우 단백질의 제조뿐만 아니라, PTMS의 식별을 위해 사용 된 NMR 전략을 설명한다.

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Protocol

15 N 1. 생산, 13 C-타우 (그림 1)

  1. BL21에 pET15b-타우 재조합 T7 발현 플라스미드 (13, 14)을 변환 (DE3) 유능한 대장균 박테리아 세포 15.
    주 : 최장 (441 아미노산 잔기) 타우 이성체에 대한 cDNA의 코딩은 플라스미드 pET15b에서을 NcoIXhoI에 제한 부위 사이에 클로닝한다.
    1. 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라스미드 DNA의 μg의 당 1-5 × 10 (7) 식민지를 형성 (DE3) 세포의 부드럽게 50 μl를 섞는다.
      참고 : 진핵 cDNA를 발현 코돈 - 사용에 최적화 된 균주는 인간의 타우를 생산하는 것이 필수적되지 않습니다.
    2. 42 ° C에서 10 초 동안 다음 30 분 및 열 충격 얼음에 세포 혼합물을 놓습니다. 다시 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓고 실온 LB (루리아 - 베르 타니) 배지 1 ㎖를 추가합니다. 부드러운 하에서 30 분 동안 37 ℃에서 세균 현탁액을 부화동요.
  2. 항생제 암피실린을 100 ㎍ / ml를 함유하는 LB 한천 배지의 플레이트 상에 접종 루프를 고르게 세포 현탁액 100 ㎕를 사용하여 확산.
  3. 37 ° C에서 15 시간 동안 선택 플레이트를 인큐베이션.
  4. 약 2 주 최대, 문화 단계로 진행하기까지 4 ° C에서 선택 판을 보관하십시오.
    주 : 세균 배양 (50 % 글리세롤)의 글리세롤, -80 ℃에서 보관은 이후 단계에서 배양을 시작하기 위해 제조 될 수있다.
  5. 멸균 M9 염 1 L (6g이 나에게 HPO 4 3g의 KH 2 PO 4 ml의 100 mM의 CaCl2를 10 ㎖의 100 × MEM 용 비타민 보충 1 mL의 1 M 황산, 1, 1 ml의 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 추가 0.5 g의 NaCl).
    주 : 백색 침전물을 빠르게 방산 M9 소금에 염화칼슘 (2) 용액을 첨가에 형성 할 것이다.
  6. 15 N 300 ㎎, 13 C-완전 배지, 15 1g을 용해NH 4 CL 13 C M9 배지 6 글루코스 10 ml를 2g. 살균 필터 직접 M9 배지에, 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 동위 원소 용액.
  7. 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 20ml에 선택 플레이트로부터 박테리아를 형질 pET15b 타우 접종 루프를 사용하여 하나의 콜로니 일시.
  8. 약 6 시간 동안 37 ° C에서 접종 매체를 품어.
  9. 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양의 10 배 희석액 1ml를 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다.
    참고 : 3.0-4.0의 600 중독에 대응하는 세균성 문화의 탁도는 포화 성장 단계에 도달했음을 나타냅니다.
  10. 2 L의 삼각 플라스틱 배플 배양 플라스크에서 암피실린 (100 μg의 / ㎖ 최종 농도)로 보충 M9 성장 배지 1 L로 포화 LB 배양 20 ㎖를 추가한다.
  11. 10 °로 설정 프로그램 배양기에서 배양 플라스크를 배치C 50 rpm으로. 다음날 이른 아침에 200 rpm으로 37 ° C로 전환 인큐베이터 프로그램.
  12. 플라스틱 분광계 큐벳에서 세균 배양 1 ㎖에 측정 OD (600). 1 M IPTG 400 μL (이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드) OD 600 재조합 타우 단백질의 발현을 유도하는 약 1.0의 값에 도달 (-20 ° C에 보관) 스톡 용액을 첨가.
  13. 또한 3 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션을 계속한다. 20 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 균체를 수집합니다.
  14. -20 ℃에서 박테리아 펠렛을 동결. 필요하다면 장기간의 정제 공정 전까지 냉동 보관.

15 N 2. 정제, 13 C-타우 (그림 2)

  1. 121 ° C에서 압력솥 양이온 교환 (CEX) 정화 버퍼 20 분 15 PSI에서. 4 ° C에서 보관 버퍼.
  2. 박테리아 세포 펠렛을 녹여 45 ㎖에 완전히 재현 탁추출 CEX의 버퍼 (50 mM의 NAPI의 완충액 pH 6.5, 1 mM의 EDTA)를 갓 프로테아제 억제제 칵테일 1 배 (1 정)과 DNAseI (2,000 대)로 보충.
  3. 20,000 psi에서 고압 균질기를 이용하여 균체를 방해. 3-4 패스가 필요합니다. 40 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 불용성 물질을 제거합니다.
  4. 수조를 사용하여 75 ° C에서 15 분 동안 박테리아 세포 추출액을 가열한다.
    참고 : 흰색 침전물이 몇 분 후에 관찰된다.
  5. 20 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기 및 열 안정성 타우 단백질을 포함 뜨는을 유지한다.
  6. 다음 정제 단계까지 -20 ℃에서 저장, 필요하다면.
  7. 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 시스템 (그림 3 A)를 사용하여 5 ml의 침대 컬럼으로 포장 강한 CEX 수지에 양이온 교환 크로마토 그래피를 수행합니다.
    1. 2.5 ml / 분으로 설정 유량.
    2. 버퍼 CEX에서 열 평형
    3. 60-70 ML의 heated-를로드타우 샘플 펌프를 사용하여 추출 함유, 또는 대안 적으로 시스템에 따라 펌프. 플로우를 통해 분석은 타우 단백질이 효율적 (2.8 참조) 수지에 결합되어 있는지 확인 할를 수집합니다.
    4. 다시 기본 값입니다 nm의 280에서 흡수 될 때까지 CEX로 버퍼를 수지 씻으십시오.
    5. CEX B의 버퍼의 점진적인 증가에 의해 얻어진 세 단계의 NaCl 구배를 사용하여 칼럼으로부터 용출 타우 (CEX 1 M NaCl을 가진 버퍼). 프로그램 FPLC 다음과 같이 500 mM의 NaCl을 도달하기 위해 5 CV 250 mM의 NaCl을, 50 % CEX B 버퍼에 두 번째 단계에 도달하는 10 컬럼 부피 (CV) 25 % CEX B 버퍼에 그라데이션의 첫 번째 단계와 세 번째 단계 이 CV에서 100 % 완충액 B CEX 1 M NaCl을 도달한다. 용출 단계에서 1.5 ml의 분수를 수집합니다.
  8. SDS-PAGE (12 % 아크릴 아미드 SDS-GEL) 쿠마시 염색 (도 3 A) (16)에 의해 용출 단계 동안 수집 된 분획의 10 μl를 분석한다. analy가 아니라 컬럼에 로딩하는 단계를 점검플로우 스루 10 μl를 쌩쌩.
  9. 타우을 함유하는 분획을 선택하고 다음 단계에서 이들 분획을 풀.
  10. 타우 함유 풀링 분수 (그림 3 B)에 버퍼 교환을 수행합니다.
    1. FPLC 시스템을 사용하여 50 mM의 암모늄 바이 카보네이트 (휘발성 버퍼)에 53 ml의 G25 수지 충전 층 (26 X 10cm)의 탈염 열 평형.
    2. / 분 5 ㎖로 설정 유량. 5 mL의 주입 루프를 통해 열에 타우 샘플을 주입한다. 280 nm에서 흡수 피크에 대응하는 분획을 수집한다.
    3. 초기 CEX 풀의 양에 따라, 주사를 3 ~ 4 번 반복합니다.
  11. 280 나노 미터 (타우 1 mg을 140 ml의 MAU *에 대응)의 크로마토 그램의 피크 면적을 이용하여 정제 된 타우 단백질의 양을 계산한다.
    주 : 280 nm에서의 타우 단백질의 흡광 계수가 7,550 M -1 cm-1이다. 타우는 TRP의 잔류 물을 포함하지 않습니다.
  12. 수영장은 모든 타우 분수.
  13. Aliquo타우의 1 ~ 5 밀리그램의 등가를 포함하는 튜브에 샘플을 t. 용액의 부피는 상기 튜브 (50 ㎖의 튜브 용액, 예를 들어 5 ㎖)의 체적에 비해 작게되도록 이들 튜브를 선택한다.
  14. 바늘을 사용하여 튜브를 뚜껑의 구멍을 펀치. -80 ° C에서 타우 샘플을 고정.
  15. 동결 건조 타우 샘플. 동결 건조 된 타우 단백질이 장기간 동안 -20 ℃에서 유지 될 수있다.

15 N-타우 3. 체외 인산화

  1. 500 ㎕의 인산화 버퍼 (50 mM의 헤 페스을 · KOH, pH가 8.0, 12.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA, 50 mM의 염화나트륨)의 동결 건조 된 타우 5 mg을 녹이고.
  2. 0.5 M 스톡 2.5 mM의 ATP (100 mM의 스톡 용액을 25 μL가 -20 ℃로 유지), 1 mM의 DTT (1 M 스톡 용액을 1 μL를 -20 ℃로 유지), 1mM의 EGTA 추가 (2 μL 용액), 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1 ml의 인산화 버퍼 한 태블릿을 용해시킨 40X 재고 25 μL) 및 한81; M 그의-ERK2 활성화 (보존 버퍼 250 μL를 10 -80 ° C에 보관 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 1mM의 DTT, 5 밀리미터의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨 및 10 % 글리세롤)의 총 샘플 부피 1 ml의.
    참고 : 활성화 된 그의-ERK2는 MEK 키나아제와 인산화에 의해 사내 5,8 제조 할 수있다.
  3. 37 ° C에서 3 시간을 품어.
  4. ERK 키나아제를 실활 15 분 동안 75 ° C에서 샘플을 가열한다.
  5. 15 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기. 수집하고 뜨는을 유지한다.
  6. 1 mL의 샘플에 적합한 3.45 mL의 G25 수지 충전 층 (1.3 × 2.6 cm)의 컬럼을 사용하여 50mM의 중탄산 암모늄으로 단백질 샘플을 탈염.
  7. 무결성 및 효율적인 인산화 (그림 4)을 모두 확인하는 단백질 시료의 2.5 μL와 12 % SDS-PAGE (16)를 실행합니다.
  8. 인산화 타우 샘플을 동결 건조. -20 ° C에서 분말을 저장합니다.

NMR 스펙트럼 4. 취득 (FIgure 5)

  1. 동결 건조 15 N의 4 ㎎, 400 μL의 NMR 버퍼 (13) C ERK 인산화 타우 (50 mM의 NAPI 또는 트리스 (D11) .Cl 중수 소화의 50 mM, pH를 6.5, 30 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 EDTA 1 mM의 DTT)을 용해.
  2. 내부 NMR 신호 기준으로 NMR 분광계의 필드 잠금 및 1 mM의 TMSP (3- (트리메틸 실릴) 프로피온산-2,2,3,3- D 산 나트륨 염))에 대해 5 % D 2 O를 추가합니다. 완전한 단백질 분해 효소 억제제 칵테일의 40 배 원액의 10 μl를 추가합니다.
  3. 긴 바늘 또는 파스퇴르 피펫 전자 주사기를 사용하여 5mm의 NMR 튜브에 시료를 옮긴다. 플런저를 사용하여 NMR 튜브를 닫습니다. 플런저의 움직임에 의해 플런저와 액체 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거합니다.
  4. 스피너의 NMR 튜브를 놓습니다. 시료 용액의 대부분이 NMR 코일 내부에있을 것 같은 것을 사용하는 NMR 프로브 헤드에 대한 적절한 게이지와 회 전자의 수직 위치를 조정합니다.
  5. 공기 흐름을 시작 리프트 난을 클릭N 자석 제어계 창. 조심스럽게 자석 구멍의 상단에있는 공기 흐름 튜브와 스피너를 배치합니다. 공기의 흐름을 중지 (리프트를 클릭) 튜브 자석의 프로브 헤드 내부 제자리에 내려 보자.
  6. 25 ° C (298 K)로 설정 온도.
  7. 동력 전달을 최적화하기 위해 반자동 튜닝 및 프로브 헤드의 정합을 수행한다. 명령 행에 ATMM 입력합니다.
  8. 중수소 채널 상에 기록 된 샘플의 D 2 O 신호를 이용하여 주파수 분석 장치 잠금. 자석 제어계 창 잠금을 클릭.
  9. 샘플의 위치에서의 자기장의 균일 성을 최적화 shimming 절차를 시작한다. 심 창을 열려면 명령 행에서 GUI를 topshim 입력합니다. 심 창에서 시작을 클릭합니다. 심가 (이하 2 Hz에서 좋은) 최적인지 확인하기 위해 잔류 B0 표준 편차 값을 확인하십시오.
  10. 양성자의 P1 매개 변수 (길이 보정양성자 스핀의 90 ° 회전을 얻기 위해 필요한 마이크로 초에서 고주파 펄스). 물 양자의 1D 스펙트럼 (그림 6)를 사용하여 360 ° 펄스에 대한 목표로하고 있습니다.
  11. (도 6) 1D 스펙트럼 양성자 물 주파수 (Hz 단위)을 O1 매개 변수를 설정하여 주파수 오프셋을 조정한다.
  12. 샘플 (그림 7)로부터의 신호를 확인하기 위해 (예를 zggpw5를 들어, 물 신호 억제를위한 워터 게이트 순서와 펄스 시퀀스) 1 차원 양성자 스펙트럼의 획득을 시작합니다. 상대 단백질 농도를 검사의 수를 적응. 획득을 시작하려면 명령 줄에서 ZG 입력합니다.
  13. 2 차원의 인수에 대한 추가 매개 변수를 설정 [1 H, 15 N] HSQC 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hsqcetfpf3gpsi, 8-9도).
    1. 15 N의 경우, 13 C는 15 N 간접 진화 중 (13) C를 분리, 샘플을 표시.
    2. 1 H (F2) 15 N (F1) 치수의 스펙트럼 폭 (PPM)를 설정한다.
      주 : 점당 Hz의 유사한 번호를 유지하는 분광계 필드에 수집 된 데이터 포인트의 수를 적응 시간 디커플링 제한하기 : 1 H 차원에서는 900 MHz와 600 MHz에서 2048 포인트에서 3072 포인트를 사용한다.
    3. 펄스 시퀀스의 추가 파라미터를 최적화 지연 펄스 길이에 대응하는 주파수, 전력 레벨 오프셋. 명령 행에서 ased 유형 실험에 대한 관련된 모든 매개 변수를 표시합니다.
  14. 3 차원의 획득을위한 설정 매개 변수 [1 H 15 N, 13 C] HNCACB 스펙트럼 (펄스 시퀀스 hncacbgpwg3d, 그림 10A) 600 MHz에서.
  15. 600 MHz에서 3 차원 [1 H 15 N, 15 N] HNCANNH 실험 (펄스 시퀀스 hncannhgpwg3d)에 대한 매개 변수를 설정합니다. 1 H에서 2048 포인트의 수를 설정하고, (64)두 15 N 차원에서 128 점. , (25), 만 (ppm으로) 당 25 부 4.7, 119, 1 H 119 ppm으로, 15 N 15 N 차원을 중심으로 14으로 스펙트럼 폭을 정의합니다. (16) 검사와 취득 기간 1 일 22 시간이다.

인산화 사이트 5. 확인

  1. 수집 및 처리 NMR 소프트웨어를 이용하여 처리 스펙트럼.
    1. 데이터 (도 7)의 푸리에 변환을 수행한다. 1 차원 스펙트럼에 대한 형식 피트, 2 차원 스펙트럼 xfb 또는 명령 행에서, 3 차원 스펙트럼 ft3d.
    2. 단계 참조 모든 스펙트럼 (그림 7C) 대화 형 창을 사용하여.
  2. 2 차원 HSQC 잠재적 인산화 빼앗아과의 Thr 잔기 (그림 9, 빨간색 상자)에 해당하는 관심의 공명을 확인합니다.
  3. 추출면에서 (즉, 2D 1 H-13 C 스펙트럼)2 차원의 관심 공명의 (15) N 화학 변화를 이용하여 3 차원 (1) H-15 N- (13) C 스펙트럼. 시각화 할 수있는면 (W1-W3)에 해당하는 15 N 주파수 (그림 10B)을 선택하는 차원이 (W2)의 커서를 사용합니다.
  4. 각각에 대한 'CA'의 공진 주파수와 '난'의 'CB'13 C 핵와 'I-1'잔류 물 (다음 i 잔류에 비해 신호의 약한 세트)을 선택 [1 H, 15 N] 공명 포인터 모드 메뉴에서 공진을 클릭하여 HNCACB 3D 스펙트럼에서 관심 피크리스트 파일의 화학 쉬프트 값을 추가하기 위해, 추가의 피크를 찾기 /.
    1. 공지 CA의 값과 pSer pThr 17 CB 화학 시프트에 피크리스트의 화학적 이동과 비교하여 상기 잔기 I 유형 또는 pSer pThr 식별.
    2. 추가적인 특성이 PPM 시프트 O로 I + 1 위치에서 프로 잔기의 존재를 확인하여 CA 케미컬 시프트 값 18 F.
    3. 제 i-1 위치에서의 잔기의 특성을 식별하는 타우의 아미노산 잔기 19에 대한 예측 된 화학적 이동의 테이블에 I-1 잔류에 대응하는 CA와 CB 공명의 화학적 시프트 값을 비교한다.
  5. HNCANNH 스펙트럼에 대한 관심의 각 [1 H, 15 N] 공명의 공명 (가) '난'의 15 N 핵의 주파수와 'I-1'잔류를 선택합니다.
  6. 23 - 타우 단백질 (20)의 화학적 이동 할당에 15 N의 화학 시프트 값을 비교한다.
  7. 시퀀스의 특정 할당을 정의하는 타우 시퀀스 식별 디 펩티드를 비교한다.

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Representative Results

도 3a는 용출 구배 중 관찰 된 280 nm에서 큰 흡수 피크를 나타낸다. 크로마토 그램 상기 아크릴 아마이드 겔에서 볼 때이 피크는 정제 된 타우 단백질에 해당한다. 도 3b는 단백질의 탈염이 효율적으로 보장, 280 nm의 전도도의 피크에서 잘 분리 흡수 피크를 보여줍니다. 도 4는 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 여러 단백질 인산화 (16)의 특성을 관찰 겔 - 시프트 (비교 레인 2 및 3).을 나타낸다 도 6은 (마이크로 초 단위)의 펄스 길이의 증가에 양성자 (H 1)의 1D 스펙트럼의 시리즈를 보여준다. 이 신호를 최소화함으로써 보정 쉽다로 설정하는 펄스가 360 ° 회전에 대응하여 90 ° H 스핀 자화를 회전 할 펄스의 길이는, 실제로 사용된다. 360 ° 펄스 길이가 적절하게 정의 할 때 물 양자의 신호는 null입니다. 360에 대응하는 값(76); 회전 후 본 실험 4 (P1)에 의해 분할된다 10.5 마이크로 초이다. 확대 영역 : 잔차 신호의 주파수는 (1 H 주파수 오프셋)를 o1p 파라미터를 정의하는데 사용된다. 도 7 (A)는 NMR 신호가 검출 될 수 있도록 시각화 한 자유 유도 붕괴 (FID)를 나타낸다. 도 7b. 비대칭 피크가 나타나는 공진에 의해 볼 수 있듯이, 잘못된 위상을 가진 1D 1 H 스펙트럼을 나타낸다. 도 7C는 기본 획득 파라미터 설정이 정확하고, 단백질 샘플의 신호가 검출 될 수 있다는 것을 나타내는 잡음비 양호한 신호와 1D 1 H 스펙트럼을 나타낸다. 그림 8은 2D 1 H, 900 MHz에서 재조합 (15) N-타우의 15 N HSQC 스펙트럼을 보여줍니다; 좋은 감도와 해상도 및도 8b와도 8a. 샘플의 단백질 분해의 검출을 추가 체육의 모양으로 볼 때스펙트럼 (파란색 상자)에 AKS. 그림 9는 좋은 감도 있지만,도 8a에 비해 낮은 해상도로 2D 1 H, 600 MHz에서 재조합 (15) N-타우도 9a의 15 N HSQC 스펙트럼을 보여줍니다. 600 MHz에서 그림 9b는, 인산화 된 잔류 물 (빨간색 상자)에 해당하는 스펙트럼에서 추가 피크의 모양을 보여줍니다. 900 MHz에서 그림 9c는, 인산화 된 잔류 물 (빨간색 상자)에 해당하는 스펙트럼에서 피크를 보여줍니다. 해상도도 9b보다 낫다. 도 10 A는 성공적인 실험을 평가하는 데 사용되는 3D NMR 스펙트럼으로부터 돌출부를 나타낸다. 도 10b는 양호한 신호 강도 I 및 I-1 13 C 잔기로부터 신호를 검출 할 수 있도록 함께 H- 15 N- 13 C 3D 스펙트럼으로부터 추출한 1 H- 13 C면을 나타낸다.


그림 1 : 재조합 단백질 생산 및 동위 원소 라벨의 주요 단계의 계획. 프로토콜의 제 1 항에 기술 된 바와 같이 재조합 단백질 생산에 박테리아 변환의 단계가 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 재조합 타우 단백질 정제의 주요 단계의 계획. 박테리아 세포에서 단계 프로토콜의 제 2 항에 기술 된 바와 같이 설명되어 재조합 단백질 정제에 용해. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

그림 3
그림 3 : 프로토콜의 액체 크로마토 그래피 단계. 가열 박테리아 추출물 (A) 양이온 교환 크로마토 그래피 분별. 280 nm의, 260 nm의 전도도에서의 흡광도는 고체와 점선 블랙 라인과 빨간 점선 라인에 각각 해당합니다. 수집 된 분획을 12 % SDS-PAGE 분석 크로마토 그램 위에 표시된다. 동결 건조에 적합한 버퍼에 타우 단백질의 (B) 탈염. 피크 면적 (2260 MAU * ml로) 추정 정제 된 타우 단백질의 양은 타우 16 mg이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 그림 4 : 타우의 12 % SDS-PAGE 분석. 레인 1 : 분자량 마커; 레인 2, 타우의 10 μg의; 레인 3, ERK 인산화 타우의 10 μg의. 타우, 다른 실향민으로, 약 60 kDa의 겉보기 분자량 대신 예상되는 46 kDa의에서, SDS-PAGE에 비정상적인 방법으로 실행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5 : NMR 시료 준비, NMR 분광 데이터 수집 및 데이터 처리를위한 기본 단계의 반응식. 프로토콜의 제 4 항에 기술 된 바와 같이 데이터 수집 및 처리 NMR 시료 준비의 단계가 설명되어 있습니다. 더 큰 버전?을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 N.

그림 6
그림 6 : NMR 데이터 수집에 대한 P1 매개 변수의 설정입니다. 이 매개 변수는 샘플 사이에 다른 소금 농도에 주로 의존한다. D 2 O의 80 % H 2 O에 대한 표준 1 H의 장동 곡선이 표시됩니다. 30 초의 재활용 지연 싱글 스캔 스펙트럼 수집 및 수평으로 그려졌다. 펄스 (P1)는 1 마이크로 초 단계 1 마이크로 초 내지 55 마이크로 초까지 변화시켰다. 이론적으로, 상기 신호는 90 °의 최대 펄스와 180 ° 펄스 제로와 동일 할 것이다. 그러나, 실제로, 방사선 감쇠 어려운 직접 90 ° 또는 180 ° 펄스를 결정할 수 있도록 비대칭 위상 왜곡 문제를 일으킨다. 두 번째 널 포인트는 360 ° 펄스 지속 시간에 해당한다. 확대 된 영역은 360 °를위한 잔여 신호를 보여줍니다 o1p 주파수 매개 변수를 정의하는 데 사용됩니다 펄스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
도 7 : NMR 데이터 처리. (A) 시간 영역에서 자유 유도 감쇠 신호. (PHC0 -206 °) 주파수 영역으로 패널 (A)에서 FID의 푸리에 변환의 부정확하지만 위상 생성 1D 양성자 스펙트럼 (B). (C) 위상 (PHC0 -113 °) 및 참조 (0 ppm에서 TMSP 신호). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8 : 2D 1 H, 900 MHz에서 재조합 (15) N-타우의 15 N HSQC 스펙트럼. 3072 및 416 획득 데이터 포인트가 각각 스펙트럼 (14)의 폭은 1 H (F2) 15 N (F1) 차원에서 25 PPM을 사용하여 기록 하였다. (16) 검사는 4 시간 30 분의 실험 기간을 선도, F1 증가에 따라 기록 하였다. 스펙트럼 (높은 분야 1 H, 낮은 필드 (15) N)의 특정 영역에 추가 공명의 모양에 의해 계시 (A) 좋은 품질의 타우 샘플 (B) 타우 샘플 저하를 보여주는, 여기에 파란색 박스. 이 마지막 샘플은 프로테아제 억제제없이 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9 : 2D 1 H, 재조합 15 N-타우의 15 N HSQC 스펙트럼. (A) unphosphorylated 타우 600 MHz의 스펙트럼 (B)은 타우는 600 MHz의 주파수와 (C)는 타우, 900 MHz의 주파수를 인산화 인산화. 스펙트럼의 특정 지역에 추가 공명이, 여기에 빨간색으로 박스, 인산화 된 타우 스펙트럼에서 관찰된다. 양성자 아미드 (1 H-15 N) pSer 및 pThr 잔류의 상관 관계에 해당하는이 공명은 쉽게 대량의 외부 주위 8.5 1 H 9.5 ppm으로 15 N에 대한 117-125 ppm으로 지역의 시각입니다 1 H 상기 unphosphorylated 타우 스펙트럼의 15 N 상관. (AB)는 600 MHz의 14, 25 PPM의 스펙트럼 폭 2048에서 256 데이터 포인트가 각각 H (F2) 15 N (F1) 사이즈로 기록되었다에서 취득 된 스펙트럼에 해당한다.32 스캔을 사용하여, 취득 된 총 시간은 2 시간 44 분 및 14의 스펙트럼 폭에 3,072 416 데이터 포인트 25 PPM은 1 H (F2)에 기록하고, 900 MHz 및 15 N에서 (C) (이었다 각각 F1) 치수. 48 스캔을 사용하여, 취득 된 총 시간은 6 시간 37 분이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : 3D 1 H 15 N, 13 C NMR 스펙트럼, 예측 및 추출 된 2 차원 평면. 2048, 72, 256 데이터 포인트는 각각 차원을 1 H (F3) 15 N (F2)에 기록하고, 13 C (F1) 하였다. 스펙트럼 폭은 4.7 (119)를 중심으로 14, 25, 및 61 ppm으로하고, 1 H 41 PPM각각 15 N 13 C 치수. 16 스캔을 사용하여 취득 기간 4 일 및 6 시간이다. 푸리에에 해당하는 (A) 큐브 표현은 ERK 인산화 타우의 HNCACB 스펙트럼의 3D 데이터 세트는 600 MHz에서 얻어진 형질 전환. 차원 1 H 15 N은 1 H는 13 C 평면은 각각 3D 13 C를 따라 데이터 (15) N 차원의 투영에 의해 얻어진다. 데이터 처리 및 표현 NMR 수집 및 처리 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. (B) 2D 1 H, 차원 1 H로부터 추출 된 13 C면, 15 N, 121.8 ppm으로 15 N 화학 시프트에서 13 C NMR 데이터 세트. (오른쪽) 줌은 모두 잔류 내가 (pThr153) 및 I-1 (Ala152)의 13 CA 13 CB 공명을 보여줍니다 9.38 ppm으로의 1 H 화학 변화를 중심으로. 13 CB 공진이 (S)의 폭으로 인해 앨리어싱되고pectral 창. 그래픽 표현 피크 피킹은 NMR 분석 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 효소 변성 타우 샘플의 특성을 NMR 분광 분석을 사용 하였다. 재조합 발현과 전장 사람 타우 단백질 여기 기재된 정제 마찬가지로 돌연변이 또는 타우 타우 도메인을 생성하는데 사용될 수있다. 동위 원소 적으로 농축 된 단백질의 재조합 발현을 필요로, NMR 분광법 필요하다. 인산화 사이트의 식별 공명 할당 및 15 N, 13 C 이중 표지 단백질을 필요로한다. 동위 원소의 가격을 감안할 때, 양호한 수율은 재조합 발현 단계에서 요구된다. 따라서 포도당 (13) C (6) 글루코스의 양이 수율을 향상시키기 위해 성장 배지 리터 당 4 g으로 증가 될 수 M9 배지에서 세균의 성장을위한 제한 인자가된다. 완전 배지 및 MEM 비타민의 추가는 필수는 아니지만 수율 성장을 촉진하고 개선하는 데 도움이됩니다. 완전한 표지 매체의 높은 가격을 감안할 때, 본 제품은 성장 배지로 사용 supplemen티. 세균의 성장은 M9 배지에서 느립니다. 일반적으로, M9 매체를 사용하여 세균 배양 배양 약 4 시간 후 유도의 3 % 완전 배지 도달 시간 보충. OD 1.6-1.8 (600)은 일반적으로 배양의 마지막에 수득된다. 재조합 타우 단백질의 예상 수익률은 세균성 문화의 리터 당 약 15 mg을합니다. 프로그램 인큐베이터의 사용은 편리하게 작업 일 시간 동안 단백질 생산, 세균 펠릿 및 단백질 생산의 분석 컨트롤의 컬렉션을 예약 할 수 있습니다.

샘플 농도는 양질의 스펙트럼을 얻는 것이 중요하다. 2 차원 스펙트럼에 대한 충분한 전형적인 타우 샘플 200 μL (즉, 100 μM) 타우 단백질 1 mg을 포함됩니다. 차원 스펙트럼 300 μL 적어도 200 μM이 필요한 극저온 프로브 헤드를 사용하는 것이 제공된다. 이러한 더 신호대를 제공 대상으로 사용되는 900 MHz의 수단으로 높은 전계 분광계에 대한 액세스및 시료 농도에 제약 (그림 8)을 줄일 수 있습니다. 타우 큰 무질서 단백질 인 것을 감안할 때, 그의 NMR 스펙트럼은 상당한 신호 오버랩 특징 및 높은 전계 NMR 분광계는 해상도면 (도 8)에서 최선의 선택이 될 것이다. 그럼에도 불구하고, 인산화 부위에 대응하는 공명 스펙트럼의 별개의 영역에있는 600 메가 헤르츠 분광기 심지어 검출하기 쉽다 (도 9 B9C 비교). 또한 인해 무질서 특성상 타우 단백질은 단백질 분해 (도 8B)에 민감하다.

버퍼의 살균은 타우 저하를 제한하는 것이 좋습니다. NMR의 샘플을 프로테아제 억제제의 첨가는, 일 시간에서 마지막 펄스 시퀀스에 따라 데이터를 획득 할 기간 동안 분해에 대해 타우를 보호하는 데 도움이. 낮은 pH (7.0 아래 pH는) AV 필요합니다OID 폭이 넓어 신호에 이르게 단백질 양성자와 물 양자 사이 너무 빨리 교환. 샘플의 pH는 또한 스펙트럼의 재현성을 보장하기 위해 제어되어야한다. pSer 및 pThr 중의 pKa 값은 NMR 분광법을위한 최적의 pH에 ​​근접하기 때문에 실제로 인산화 잔기의 화학적 쉬프트는 산도 변화에 매우 민감하다. NMR의 샘플의 pH의 조절은 소량에 적합한 pH를 마이크로 전극의 pH 미터를 사용하여 직접적으로 제조 될 수있다. 타우는 수용성 단백질과 표준 조건에 집계되지 않습니다. 헤파린 설페이트, 37 ° C에서 배양 같은 폴리 음이온의 첨가는 샘플 타우 응집을 개시 할 수있다. 이 경우, 상기 응집체의 고체 인 특성, 대응 NMR 스펙트럼 내의 공명 대부분 검출 넘어 확장. 심지어 인산화 타우 샘플 NMR 데이터 수집을 위해 여기에 설명 된 조건에서 집계하지 않는다.

항체 분석에 비해 NMR은 오 제공PTMS의 verall보기. 질량 분석법은 단백질 샘플의 인산화 패턴을 식별하기 위해 사용될 수있다. 동위 원소 라벨이 기술에 대한 필요는없고, 요구되는 샘플의 양은 매우 작다. 그러나, 이러한 여러 타우 인산화와 단백질의 특성화 도전 남아있다. 인접 인산화 식별의 상향식 (bottom-up) 전략 동중 펩타이드를 생성합니다. 전체 식별은 샘플 단백질 분해하여 얻은 펩타이드의 MS / MS 시퀀싱을 필요로한다. NMR의 장점은이 기술의 고유 정량적 특성에있다. 이것은, NMR 신호의 강도는 특정 부위에서 화학 그룹의 양은 연결될 수있다. 따라서 우리는 각 사이트에서 화학적 변형의 비율을 정의 할 수 있습니다. MS 응용 프로그램의 최근 진보는 그러나 타우 여러 인산화의 MS 분석도 적절한 정규화 (25) 후 정량적 인 방법으로 가능 (24) 인 것으로 나타났습니다.

여기서는 활성 ERK2로 타우 인산화를 제시하지만, 방법론은 다른 키나아제뿐만 6,7,26으로 인산화에 사용될 수 - 28. 31 - 키네틱 실험은 단백질 키나제 기판 (28)을 향해 특이성을 정의하는 데 도움이 될 수있는, 수행 될 수있다. 인산화 연구는 재조합 키나제에 한정되지 않고, 세포 또는 조직 추출물의 키나제 활성은 6,32,28을 분석 할 수있다. 흥미로운 개발은 현장 수정 33, 34에서 공부하기에 셀 NMR의 사용이다. PP2A 포스 파타 아제 (35)에 의해 인산화 타우의 탈 인산화를 공부로 표시되면서 역으로, NMR 또한, 포스 특이성을 해결하기 위해 잘 적응된다. NMR 분광법 억제제 화합물 재치 존재 차원 스펙트럼의 단백질 기질의 인산화 프로파일을 비교함으로써 키나제 억제제의 특성에 적용 할 수있다H 제어 실험 6에서 발행 스펙트럼.

더 민감한 MS 기술에 비해 NMR 분광법을 사용하는 이익은 오히려 형의 분석 능력에 비해, 여기에 설명 된 프로토콜을 이용하는 애플리케이션의 넓은 범위에서 존재한다. 그것은 주로 NMR을 이용하여 분석 하였다 구조적 또는 기능적 수정 사항 특정 인산화를 링크 할 수 인산화 부위를 확인하는 것이 중요 입증되었다. 인산화 타우 샘플의 NMR 분광법은 모두 과도 지역의 이차 구조에 수정 타우 (36, 37)의 동적 앙상블의 글로벌 재배치에 인산화의 구조에 미치는 영향을 탐색 할 수 있습니다. 기능적인 측면은 타우 인산화 (8)에 의해 단백질 파트너 7,38,39 및 집계와 타우 모두 상호 작용의 조절을 포함한다. NMR 특징 인산화 타우 샘플 추가 들어 포스 의존 상호 작용을 해독하는데 사용될 수있다14-3-3 단백질 (40) 및 조작 단백질 - 단백질 상호 작용은 예를 들어 41, 42 저해제. NMR 잔사 레벨에서 상호 작용 부위 (들)의 정의를 허용하고, 이러한 상호 작용의 인산화에의 의존성. 또한, 인산화 된 타우의 NMR 분광법은 프롤린 시스를 특징 짓는 중요한 방법은 다음과 같습니다 트랜스 이성화 핀 1, 타우 규제 (43)에 관련된 중요한 포스 의존 효소 - 45. 또한, NMR에 의한 인산화 분석 실향민뿐만 아니라 구형 단백질 (46)에도 적용 할 수있다. 마지막으로, 아세틸 화 22,40,41 같은 타우 PTMS 다른 유형의 NMR에 의해 연구 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 더 생리적, 병리 적 상태에 타우의 기능 및 구조 규정을 이해하는 것이 매우 중요 입증했다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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References

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