आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
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Biochemistry

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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Abstract

Introduction

21 वीं सदी में स्वास्थ्य सेवा की मुख्य चुनौतियों में से एक ऐसे अल्जाइमर रोग (ई) के रूप में neurodegenerative रोगों कर रहे हैं। ताउ एक microtubule जुड़े प्रोटीन है कि उत्तेजित microtubule (एमटी) गठन है। ताऊ समान रूप से, कई neurodegenerative विकारों में शामिल है तथाकथित tauopathies, जिनमें से सबसे अच्छा ज्ञात विज्ञापन है। इन विकारों में, बनती पेचदार तंतु (PHFs) में ताऊ आत्म-समुच्चय और पाया जाता है जैसे कि फोस्फोराइलेशन 1 के रूप में posttranslational संशोधनों (PTMs) द्वारा कई अवशेषों पर संशोधित। ताउ प्रोटीन की Phosphorylation मीट्रिक टन स्थिरीकरण और उस विज्ञापन न्यूरॉन्स की विशेषता समारोह के रोग नुकसान की अपनी शारीरिक समारोह के दोनों नियमन में फंसा है।

इसके अलावा, ताउ प्रोटीन, जब रोगग्रस्त न्यूरॉन्स में PHFs में एकीकृत, सदा ही 2 hyperphosphorylated है। सामान्य ताउ कि 2-3 फॉस्फेट समूहों में शामिल है के विपरीत, PHFs में hyperphosphorylated ताउ शामिल करने के लिए 5 9 phosphatई समूहों 3। ताऊ की Hyperphosphorylation दोनों कुछ स्थलों पर और अतिरिक्त साइटों है कि फोस्फोराइलेशन के रोग साइटों कहा जाता है के फोस्फोराइलेशन को stoichiometry की वृद्धि से मेल खाती है। हालांकि, ओवरलैप स्तर 4 में मात्रात्मक मतभेदों के बावजूद, विज्ञापन और फोस्फोराइलेशन के सामान्य वयस्क पैटर्न के बीच मौजूद है। कैसे विशिष्ट फोस्फोराइलेशन घटनाओं को प्रभावित समारोह और ताऊ की शिथिलता काफी हद तक अनजान बनी हुई है। हम आणविक स्तर पर PTMs द्वारा ताउ विनियमन समझने के लिए लक्ष्य।

ताऊ की आणविक पहलुओं की समझ को गहरा करने के लिए, हम तकनीकी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। सबसे पहले, ताऊ एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन (आईडीपी) जब समाधान में अलग है। इस तरह के प्रोटीन शारीरिक शर्तों के तहत अच्छी तरह से परिभाषित तीन आयामी संरचना की कमी है और उनके कार्य (एस) और संरचनात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से biophysical तरीकों की आवश्यकता है। ताऊ विस्थापितों की बढ़ती वर्ग के लिए एक प्रतिमान है, अक्सर के साथ जुड़े पायाऐसे neurodegenerative रोगों के रूप में विकृतियों, इसलिए ब्याज बढ़ रही है उनके कार्यों अंतर्निहित आणविक मानकों को समझने के लिए। दूसरे, ताऊ फोस्फोराइलेशन के लक्षण वर्णन के सबसे लंबे समय तक 441 अमीनो एसिड ताउ isoform के अनुक्रम के साथ 80 संभावित फोस्फोराइलेशन साइटों के साथ, एक विश्लेषणात्मक चुनौती है। एंटीबॉडी के एक नंबर ताउ के फॉस्फोरिलेटेड epitopes के खिलाफ विकसित किया गया है और न्यूरॉन्स या मस्तिष्क के ऊतकों में रोग ताऊ का पता लगाने के लिए किया जाता है। Phosphorylation घटनाओं प्रोलाइन समृद्ध क्षेत्र के भीतर करीब निकटता में उनमें से ज्यादातर कम से कम 20 साइटों प्रोलाइन निर्देशित kinases द्वारा लक्षित पर जगह ले सकते हैं। गुणात्मक (जो साइटों?) और मात्रात्मक (क्या stoichiometry?) लक्षण वर्णन भी सबसे हाल ही में एमएस तकनीक 5 से मुश्किल है।

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी अव्यवस्थित प्रोटीन है कि अत्यधिक गतिशील conformers की टुकड़ियों की व्यवस्था कर रहे हैं गठित जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी appli थाएड दोनों संरचना और ताउ प्रोटीन के समारोह में जांच करने के लिए। 8 - इसके अलावा, ताऊ के फोस्फोराइलेशन प्रोफ़ाइल की जटिलता आणविक उपकरण और नई विश्लेषणात्मक तरीकों फोस्फोराइलेशन साइटों 6 की पहचान के लिए एनएमआर का उपयोग कर के विकास के लिए नेतृत्व किया। एक विश्लेषणात्मक पद्धति के रूप में एनएमआर एक वैश्विक ढंग से ताउ फोस्फोराइलेशन साइटों की पहचान, एक ही प्रयोग में सभी एकल साइट संशोधनों के दृश्य, और फॉस्फेट समावेश की हद तक की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इस बिंदु के बाद से आवश्यक हालांकि ताउ पर फोस्फोराइलेशन पढ़ाई के साहित्य में जाना लाजिमी है, उनमें से ज्यादातर एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया है, एक बड़े फोस्फोराइलेशन का पूरा प्रोफ़ाइल से अधिक व्यक्ति फोस्फोराइलेशन घटनाओं का असली प्रभाव अनिश्चितता की डिग्री है और इस प्रकार जा रही है। PKA, ग्लाइकोजन-synthase काइनेज 3β (Gsk3β), Cyclin निर्भर काइनेज 2 / cyclin एक (CDK2 / CycA), Cyclin निर्भर काइनेज 5 (CDK5) / P25 अधिनियम सहित संयोजक kinasesivator प्रोटीन, बाह्य संकेत विनियमित काइनेज 2 (ERK2) और microtubule आत्मीयता विनियमन काइनेज (मार्क), जो ताऊ की ओर फोस्फोराइलेशन गतिविधि दिखाने के लिए, एक सक्रिय रूप में तैयार किया जा सकता है। इसके अलावा, ताऊ म्यूटेंट कि अच्छी तरह से विशेषता फोस्फोराइलेशन पैटर्न के साथ विशिष्ट ताउ प्रोटीन isoforms पैदा करने के लिए अनुमति देने के ताऊ के फोस्फोराइलेशन कोड समझने के लिए उपयोग किया जाता है। 8 - एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी तो enzymatically संशोधित ताउ नमूने 6 को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि ताऊ की इन विट्रो phosphorylation ऐसे glutamic एसिड (ग्लू) अवशेषों में चयनित सर्विसेज / Thr के उत्परिवर्तन के रूप में छद्म फोस्फोराइलेशन से ज्यादा चुनौतीपूर्ण है, इस दृष्टिकोण अपने गुण है। दरअसल, फोस्फोराइलेशन से न तो संरचनात्मक प्रभाव है और न ही बातचीत के मानकों को हमेशा glutamic एसिड से मजाक उड़ाया जा सकता है। एक उदाहरण मोड़ के आसपास phosphoserine 202 (pSer202) मनाया मूल भाव / phosphothreonine 205 (pThr205), जो ग्लू म्यूटेशन 9 के साथ reproduced नहीं है।

इन विट्रो phosphorylation में ताऊ की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। 12 - ERK2 माइटोजन सक्रिय प्रोटीन काइनेज / ERK काइनेज (खल्क) 10 से फोस्फोराइलेशन से सक्रिय है। संशोधित, isotopically लेबल ताउ प्रोटीन की तैयारी के अलावा, PTMs की पहचान के लिए इस्तेमाल किया एनएमआर रणनीति में वर्णित है।

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Protocol

1. 15 एन के उत्पादन, 13 सी-ताउ (चित्रा 1)

  1. BL21 में pET15b-ताऊ पुनः संयोजक T7 प्लाज्मिड अभिव्यक्ति 13,14 रूपांतरण (DE3) सक्षम कोलाई बैक्टीरिया का 15 कोशिकाओं।
    नोट: सबसे लंबे समय तक (441 अमीनो एसिड के अवशेष) ताउ isoform के लिए सीडीएनए कोडिंग pET15b प्लाज्मिड में NcoI और XhoI प्रतिबंध साइटों के बीच क्लोन है।
    1. सक्षम BL21 (DE3) कोशिकाओं, एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में प्लास्मिड डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति 1-5 10 x 7 कालोनियों प्लास्मिड डीएनए के 100 एनजी के साथ बनाने की धीरे 50 μl मिक्स।
      नोट: कोडोन-उपयोग अनुकूलित सीडीएनए अभिव्यक्ति के लिए जीवाणु उपभेदों मानव ताउ के उत्पादन के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं।
    2. 42 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के लिए 30 मिनट के लिए और फिर गर्मी झटका के लिए बर्फ पर सेल मिश्रण रखें। ट्यूब बर्फ पर वापस 5 मिनट के लिए रखें और कमरे के तापमान पौंड (Luria-Bertani) के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल के तहत 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु निलंबन सेतेआंदोलन।
  2. एम्पीसिलीन एंटीबायोटिक के 100 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त लेग माध्यम से एक अगर प्लेट पर एक टीका पाश सेल निलंबन समान रूप से 100 μl का उपयोग कर बिखरा हुआ है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 घंटे के लिए चयन थाली सेते हैं।
  4. संस्कृति कदम को आगे बढ़ने से, लगभग 2 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर चयन की थाली रखें।
    नोट: जीवाणु संस्कृति (50% ग्लिसरॉल) के एक ग्लिसरॉल स्टॉक, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, एक बाद में मंच पर संस्कृति शुरू करने के लिए तैयार किया जा सकता है।
  5. Autoclaved M9 लवण की 1 एल (6 ग्राम ना 2 के लिए 1 एमएल 1 एम MgSO 4, 1 एमएल 100 मिमी CaCl 2, 10 मिलीलीटर 100x सदस्य विटामिन पूरक, 1 मिलीलीटर 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन जोड़े HPO 4, 3 जी 2 के.एच. पीओ 4 , 0.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड)।
    ध्यान दें: एक सफेद वेग M9 लवण है कि जल्दी dissipates के लिए 2 CaCl समाधान के अलावा पर बनेगी।
  6. 13 सी-पूरा मध्यम 15 एन के 300 मिलीग्राम, 15 की 1 ग्राम solubilizeएनएच 4 सीएल और 13 सी M9 माध्यम के 6 से 10 में -glucose मिलीलीटर के 2 जी। फिल्टर बाँझ सीधे M9 माध्यम में, एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग आइसोटोप समाधान।
  7. pET15b-ताऊ का एक टीका पाश एक कॉलोनी का उपयोग करते हुए निलंबित एम्पीसिलीन के 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक लेग माध्यम के 20 मिलीलीटर में चयन थाली से बैक्टीरिया को बदल दिया।
  8. के बारे में 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका मध्यम सेते हैं।
  9. एक प्लास्टिक स्पेक्ट्रोमीटर क्युवेट में जीवाणु संस्कृति की एक दस गुना कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर पर 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने।
    नोट: जीवाणु संस्कृति 3.0-4.0 के 600 आयुध डिपो के लिए इसी की गंदगी को इंगित करता है कि संतृप्ति विकास के चरण पर पहुंच गया है।
  10. 2 एल Erlenmeyer प्लास्टिक चकित संस्कृति फ्लास्क में, एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक M9 मध्यम विकास के 1 एल को संतृप्त पौंड संस्कृति के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
  11. एक प्रोग्राम इनक्यूबेटर 10 डिग्री करने के लिए सेट में संस्कृति कुप्पी की जगहसी और 50 आरपीएम। इनक्यूबेटर कार्यक्रम 200 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए अगले दिन की सुबह जल्दी स्विच करने के लिए।
  12. एक प्लास्टिक स्पेक्ट्रोमीटर क्युवेट में जीवाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर पर उपाय आयुध डिपो के 600। 1 एम IPTG के 400 μl (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) शेयर समाधान (-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा) जब 600 आयुध डिपो पुनः संयोजक ताउ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के बारे में 1.0 की एक मूल्य तक पहुँच जोड़ें।
  13. एक और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें। 20 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा बैक्टीरियल कोशिकाओं को ले लीजिए।
  14. -20 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया गोली रुक। , शुद्धि चरण तक जमे हुए रखें एक विस्तारित अवधि के लिए अगर जरूरत है।

2. 15 एन की शुद्धि, 13 सी-ताउ (चित्रा 2)

  1. 20 मिनट के लिए 15 साई के तहत 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव कटियन एक्सचेंज (CEX) शुद्धि बफ़र्स। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर बफ़र्स।
  2. बैक्टीरिया कोशिका गोली गला लें और 45 मिलीलीटर में अच्छी तरह से resuspendनिकासी CEX के एक बफर (50 मिमी NAPI बफर पीएच 6.5, 1 मिमी EDTA) हौसले protease अवरोध कॉकटेल 1x (1 गोली) और DNAseI (2,000 इकाइयों) के साथ पूरक।
  3. 20,000 साई में एक उच्च दबाव homogenizer का उपयोग बैक्टीरियल कोशिकाओं को बाधित। 3-4 गुजरता जरूरी हैं। 40 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र अघुलनशील सामग्री हटा दें।
  4. 75 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए बैक्टीरिया कोशिका निकालने गर्मी एक पानी के स्नान का उपयोग कर।
    ध्यान दें: एक सफेद वेग कुछ ही मिनटों के बाद मनाया जाता है।
  5. 20 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला गर्मी स्थिर ताउ प्रोटीन युक्त रहते हैं।
  6. निम्नलिखित शुद्धि कदम जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, अगर जरूरत है।
  7. एक 5 मिलीलीटर बिस्तर एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली (चित्रा 3 ए) का उपयोग करते हुए स्तंभ के रूप में पैक एक मजबूत CEX राल पर एक कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करना।
    1. प्रवाह 2.5 मिलीग्राम / मिनट की दर निर्धारित करें।
    2. CEX में स्तंभ संतुलित करना एक बफर
    3. 60-70 मिलीलीटर heated- लोडयुक्त ताउ एक नमूना पंप का उपयोग कर निकालने, या वैकल्पिक रूप से एक पंप, सिस्टम के आधार पर। प्रवाह के माध्यम से सत्यापित करने के लिए विश्लेषण है कि ताउ प्रोटीन कुशलता राल के लिए बाध्य किया जाता है (2.8 देखें) के लिए ले लीजिए।
    4. 280 पर absorbance वापस आधारभूत मूल्य है एनएम तक CEX के साथ राल धोने एक बफर।
    5. स्तंभ एक तीन कदम NaCl ढाल CEX बी बफर की क्रमिक वृद्धि के द्वारा प्राप्त का उपयोग करने से Elute ताउ (CEX 1 एम NaCl के साथ एक बफर)। कार्यक्रम FPLC इस प्रकार है: 10 कॉलम की मात्रा (सीवी) में 25% CEX बी बफर करने के लिए ढाल 5 CV में 250 मिमी NaCl, 50% CEX बी बफर के लिए दूसरे चरण तक पहुंचने के लिए 500 मिमी NaCl तक पहुँचने के लिए पहला कदम है, और तीसरे चरण 2 सीवी में 100% CEX बी बफर 1 एम NaCl तक पहुंचने के लिए। क्षालन चरणों के दौरान 1.5 मिलीलीटर अंशों लीजिए।
  8. एसडीएस पृष्ठ (12% एसडीएस acrylamide जेल) और Coomassie धुंधला (चित्रा 3 ए) 16 से क्षालन चरण के दौरान एकत्र भिन्न के 10 μl का विश्लेषण। स्तंभ पर लोड कदम analy द्वारा के रूप में अच्छी तरह से चेकप्रवाह के माध्यम से 10 μl zing।
  9. ताऊ युक्त भिन्न चुनते हैं और अगले कदम के लिए इन अंशों पूल।
  10. ताऊ युक्त जमा भिन्न (चित्रा 3 बी) पर एक बफर विनिमय प्रदर्शन।
    1. 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (अस्थिर बफर) में 53 मिलीलीटर G25 राल पैक बिस्तर (26 x 10 सेमी) के एक desalting स्तंभ एक FPLC प्रणाली का उपयोग कर संतुलित करना।
    2. प्रवाह 5 मिलीग्राम / मिनट की दर निर्धारित किया। एक 5 मिलीलीटर इंजेक्शन के माध्यम से पाश स्तंभ पर ताऊ नमूना इंजेक्षन। 280 एनएम पर अवशोषण शिखर को इसी अंशों लीजिए।
    3. इंजेक्शन दोहराएँ 3-4 बार प्रारंभिक CEX पूल की मात्रा पर निर्भर करता है।
  11. 280 एनएम (ताऊ के 1 मिलीग्राम 140 मऊ * मिलीलीटर से मेल खाती है) पर chromatogram के शिखर क्षेत्र का उपयोग करके शुद्ध ताउ प्रोटीन की मात्रा की गणना।
    नोट: 280 एनएम पर ताउ प्रोटीन के विलुप्त होने के गुणांक 7550 एम -1 -1 सेमी है। ताऊ किसी भी टीआरपी के अवशेष शामिल नहीं है।
  12. पूल सभी ताउ अंशों।
  13. Aliquoताऊ की 1 से 5 मिलीग्राम के बराबर युक्त ट्यूबों में नमूना टी। इन ट्यूबों चुनें ताकि समाधान की मात्रा ट्यूब (एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान के उदाहरण के लिए 5 मिलीलीटर) की मात्रा की तुलना में छोटा है।
  14. एक सुई का उपयोग ट्यूब टोपी में छेद पंच। -80 डिग्री सेल्सियस पर ताऊ नमूने रुक।
  15. Lyophilize ताउ नमूने हैं। Lyophilized ताउ प्रोटीन समय की लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।

3. इन विट्रो 15 एन-ताऊ के फोस्फोराइलेशन

  1. 500 μl फोस्फोराइलेशन बफर (50 मिमी Hepes · KOH, पीएच 8.0, 12.5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी EDTA, 50 मिमी NaCl) में lyophilized ताउ के 5 मिलीग्राम भंग।
  2. 2.5 मिमी एटीपी (100 मिमी स्टॉक समाधान के 25 μl -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा), 1 मिमी डीटीटी (1 एम स्टॉक समाधान के 1 μl -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा), 1 मिमी EGTA जोड़ें (एक 0.5 एम स्टॉक के 2 μl समाधान), 1x protease अवरोध कॉकटेल (1 मिलीलीटर फोस्फोराइलेशन बफर में एक 40x शेयर 1 गोली भंग करके प्राप्त की 25 μl) और 181, एम उनकी ERK2 सक्रिय (संरक्षण बफर में 250 μl 10 मिमी HEPES, पीएच 7.3, 1 मिमी डीटीटी, 5 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl और 10% ग्लिसरॉल, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) की कुल नमूना मात्रा में 1 मिलीलीटर।
    नोट: सक्रिय उनकी ERK2 घर में 5.8 खल्क काइनेज साथ फोस्फोराइलेशन द्वारा तैयार किया जा सकता है।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा सेते हैं।
  4. 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी ERK काइनेज निष्क्रिय करने के लिए।
  5. 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र। लीजिए और सतह पर तैरनेवाला रहते हैं।
  6. 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट में प्रोटीन नमूना 3.45 मिलीलीटर G25 राल पैक बिस्तर (1.3 x 2.6 सेमी) है, जो एक 1 मिलीलीटर नमूने के लिए उपयुक्त है का एक स्तंभ का उपयोग फीका बनाना।
  7. दोनों अपनी अखंडता और कुशल फोस्फोराइलेशन (चित्रा 4) की जांच करने के लिए प्रोटीन के नमूने के 2.5 μl के साथ एक 12% एसडीएस पृष्ठ 16 चलाएँ।
  8. फॉस्फोरिलेटेड ताउ नमूना Lyophilize। -20 डिग्री सेल्सियस पर पाउडर स्टोर।

4. एनएमआर स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण (Fiआंकड़ा 5)

  1. , Lyophilized 15 एन के 4 मिलीग्राम 13 सी 400 μl एनएमआर बफर में ERK-फॉस्फोरिलेटेड-ताउ (50 मिमी NAPI या 50 मिमी deuterated Tris- D11 .CL, पीएच 6.5, 30 मिमी NaCl, 2.5 मिमी EDTA और 1 मिमी डीटीटी) solubilize।
  2. एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के क्षेत्र लॉकिंग और 1 मिमी TMSP (3- (trimethylsilyl) propionic-2,2,3,3-डी 4 एसिड सोडियम नमक)) आंतरिक एनएमआर संकेत संदर्भ के रूप में के लिए 5% डी 2 हे जोड़ें। पूरा protease अवरोध कॉकटेल का एक 40x शेयर समाधान के 10 μl जोड़ें।
  3. एक लंबी सुई या पाश्चर विंदुक के साथ एक इलेक्ट्रॉनिक सिरिंज का उपयोग कर एक 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में नमूना हस्तांतरण। सवार का उपयोग कर एनएमआर ट्यूब बंद करें। किसी भी हवाई सवार आंदोलनों से सवार और तरल के बीच फंस बुलबुला निकालें।
  4. एक स्पिनर में एनएमआर ट्यूब रखें। एनएमआर जांच इस्तेमाल किया सिर के लिए उचित गेज के साथ स्पिनर में अपनी ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करें, ऐसा है कि नमूना समाधान का सबसे एनएमआर कुंडल के अंदर हो जाएगा।
  5. हवा का प्रवाह शुरू: लिफ्ट मैं क्लिक करेंn चुंबक नियंत्रण प्रणाली खिड़की। ध्यान से चुंबक बोर के शीर्ष पर airflow में ट्यूब के साथ स्पिनर जगह है। हवा का प्रवाह बंद करो (लिफ्ट क्लिक करें) और ट्यूब चुंबक में जांच सिर के अंदर जगह में उतर करते हैं।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस (298 कश्मीर) के लिए तापमान सेट करें।
  7. विद्युत पारेषण अनुकूलन करने के लिए अर्द्ध स्वचालित ट्यूनिंग और जांच सिर के मिलान प्रदर्शन करना। कमांड लाइन पर atmm टाइप करें।
  8. नमूना ड्यूटेरियम चैनल पर दर्ज की डी 2 हे संकेत का उपयोग कर स्पेक्ट्रोमीटर आवृत्ति ताला। चुंबक नियंत्रण प्रणाली विंडो में ताला क्लिक करें।
  9. shimming प्रक्रिया शुरू नमूने की स्थिति पर चुंबकीय क्षेत्र की एकरूपता का अनुकूलन करने के लिए। शिम विंडो खोलने के लिए कमांड लाइन पर जीयूआई topshim टाइप करें। शिम विंडो में शुरू क्लिक करें। सत्यापित करने के लिए कि shims इष्टतम हैं (कम से कम 2 हर्ट्ज अच्छा है) अवशिष्ट B0 मानक भिन्नता मूल्य की जाँच करें।
  10. P1 पैरामीटर (एक प्रोटॉन की लंबाई जांचनाμsec में रेडियोफ्रीक्वेंसी नाड़ी) है, जो प्रोटॉन Spins के एक 90 डिग्री रोटेशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। 360 ° पल्स पानी प्रोटॉन की एक -1 डी स्पेक्ट्रम (चित्रा 6) का उपयोग करने के लिए निशाना लगाओ।
  11. आवृत्ति -1 डी स्पेक्ट्रम में प्रोटॉन पानी आवृत्ति को o1 पैरामीटर (हर्ट्ज में) (चित्रा 6) की स्थापना द्वारा ऑफसेट समायोजित करें।
  12. एक -1 डी प्रोटॉन स्पेक्ट्रम का अधिग्रहण शुरू (पानी संकेत दमन के लिए वाटरगेट अनुक्रम के साथ पल्स अनुक्रम, उदाहरण के लिए zggpw5) नमूना (चित्रा 7) से संकेत सत्यापित करने के लिए। रिश्तेदार प्रोटीन एकाग्रता के लिए स्कैन की संख्या अनुकूलित। कमांड लाइन पर ZG अधिग्रहण शुरू करने के लिए टाइप करें।
  13. एक 2 डी के अधिग्रहण के लिए अतिरिक्त पैरामीटर सेट अप [1 एच, 15 एन] HSQC स्पेक्ट्रम (पल्स अनुक्रम hsqcetfpf3gpsi, आंकड़े 8-9)।
    1. एक 15 एन के लिए, 13 सी नमूना लेबल, 15 एन अप्रत्यक्ष विकास के दौरान 13 सी दसगुणा।
    2. 1 एच (F2) और 15 एन (एफ 1) आयामों में सेट करें।
      नोट: स्पेक्ट्रोमीटर क्षेत्र के लिए अधिग्रहण डेटा बिंदुओं की संख्या अनुकूलित बिंदु प्रति हर्ट्ज की एक समान संख्या में रखने के लिए और समय decoupling सीमित करने: 900 मेगाहर्ट्ज और 600 मेगाहर्ट्ज पर 2,048 अंक पर 3,072 अंक का उपयोग, 1 एच आयाम में।
    3. पल्स दृश्यों में अतिरिक्त पैरामीटर अनुकूलन, देरी, नाड़ी लंबाई करने के लिए इसी आवृत्तियों, सत्ता के स्तर ऑफसेट। प्रकार कमांड लाइन पर ased प्रयोग के लिए प्रासंगिक सभी मापदंडों प्रदर्शित करने के लिए।
  14. एक 3 डी के अधिग्रहण के लिए निर्धारित मापदंडों [1 एच, 15 एन, 13 सी] 600 मेगाहर्ट्ज पर HNCACB स्पेक्ट्रम (पल्स अनुक्रम hncacbgpwg3d, चित्रा 10A)।
  15. एक 3 डी [1 एच, 15 एन 15 एन] HNCANNH प्रयोग (पल्स अनुक्रम hncannhgpwg3d) 600 मेगाहर्ट्ज पर के लिए निर्धारित मापदंडों। 1 एच में 2048 अंकों की संख्या सेट और 64और दो 15 एन आयामों में 128 अंक। के रूप में 14, 25, प्रति मिलियन (पीपीएम) 25 भागों में 4.7, 119, 1 एच में 119 पीपीएम, 15 और एन 15 एन आयामों पर केंद्रित वर्णक्रमीय चौड़ाई को परिभाषित करें। 16 स्कैन के साथ अधिग्रहण की अवधि 1 दिन और 22 घंटा है।

5. Phosphorylation साइटों की पहचान

  1. प्रक्रिया स्पेक्ट्रा अधिग्रहण और प्रसंस्करण एनएमआर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर।
    1. डेटा (चित्रा 7) के एक फूरियर परिवर्तन प्रदर्शन करना। एक -1 डी स्पेक्ट्रम के लिए टाइप फुट, एक 2 डी स्पेक्ट्रम के लिए xfb या एक 3 डी स्पेक्ट्रम के लिए ft3d, कमांड लाइन पर।
    2. चरण और संदर्भ सभी स्पेक्ट्रा (चित्रा 7C) इंटरैक्टिव खिड़कियों का उपयोग कर।
  2. 2 डी HSQC संभावित फॉस्फोरिलेटेड सर्विसेज के लिए thr के अवशेष (9 चित्रा, लाल बॉक्स) के लिए इसी में ब्याज की अनुनादों को पहचानें।
  3. निकालें विमानों से (यानी 2 डी 1 एच 13 सी स्पेक्ट्रा)3 डी 1 एच 15 एन 13 सी स्पेक्ट्रम 2 डी में ब्याज की अनुनादों के 15 एन रासायनिक बदलाव के प्रयोग से। आयाम 2 (डब्ल्यू 2) के कर्सर का प्रयोग विमान (W1-डब्ल्यू 3) को इसी 15 एन आवृत्ति देखे जा करने के लिए (चित्रा 10B) का चयन करने के लिए।
  4. प्रत्येक के लिए गूंज और (मैं अवशेषों के उन लोगों की तुलना संकेतों के कमजोर सेट) 'सीए' की आवृत्तियों और 'सीबी' 13 'मैं' के सी नाभिक 'मैं-1' के अवशेष चुनें [1 एच, 15 एन] गूंज सूचक मोड मेनू में, प्रतिध्वनि पर क्लिक करके HNCACB 3 डी स्पेक्ट्रम में ब्याज के मिल / एक चोटी सूची फ़ाइल में रासायनिक पारी मूल्य जोड़ने के लिए शिखर जोड़ें।
    1. , मैं अवशेषों प्रकार, pSer या pThr पहचानें pSer और pThr 17 की सीबी रासायनिक बदलाव के सीए के नाम से जाना जाता मूल्यों और शिखर सूची में रासायनिक पारियों की तुलना द्वारा।
    2. एक विशेषता अतिरिक्त 2 पीपीएम पारी ओ द्वारा मैं + 1 की स्थिति पर एक समर्थक अवशेषों की उपस्थिति की पहचानसीए रासायनिक पारी मूल्य 18 एफ।
    3. ताऊ अमीनो एसिड के अवशेष 19 के लिए भविष्यवाणी की मैं-1 की स्थिति पर अवशेषों की प्रकृति की पहचान करने के लिए रासायनिक पारियों में से एक मेज के लिए मैं -1 अवशेषों को इसी सीए और सीबी अनुनादों की रासायनिक पारी मूल्यों की तुलना करें।
  5. HNCANNH स्पेक्ट्रम में ब्याज की प्रत्येक [1 एच, 15 एन] गूंज के लिए और 'मैं' की 15 एन नाभिक की गूंज आवृत्तियों 'मैं-1' के अवशेष उठाओ।
  6. 23 - ताउ प्रोटीन 20 की रासायनिक पारी काम करने के लिए 15 एन रासायनिक पारी मूल्यों की तुलना करें।
  7. ताऊ अनुक्रम के साथ पहचान dipeptides तुलना अनुक्रम विशिष्ट काम को परिभाषित करने की।

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Representative Results

चित्रा 3 ए 280 एनएम क्षालन ढाल के दौरान मनाया में एक प्रमुख अवशोषण शिखर से पता चलता है। के रूप में वर्णलेख ऊपर acrylamide जेल पर देखा इस शिखर शुद्ध ताउ प्रोटीन से मेल खाती है। चित्रा 3 बी 280 एनएम और चालकता के चरम पर एक अच्छी तरह से अलग अवशोषण शिखर से पता चलता है, यह सुनिश्चित करना है कि प्रोटीन की desalting कुशल है। चित्रा 4 प्रोटीन जेल शिफ्ट एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण से मनाया कई प्रोटीन phosphorylation 16 विशेषता (तुलना गलियों 2 और 3)। पता चलता है चित्रा 6 पल्स लंबाई में वृद्धि (μsec में) के साथ प्रोटॉन (1 एच) 1 डी स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला से पता चलता है। सेटअप करने के लिए पल्स कि 90 डिग्री से 1 एच स्पिन संस्कार बारी बारी से होगा, एक पल्स एक 360 डिग्री रोटेशन के लिए इसी की लंबाई, व्यवहार में उपयोग किया जाता है के रूप में यह जांच करने के लिए आसान संकेत कम करके है। पानी प्रोटॉनों के संकेत जब 360 ° पल्स लंबाई पर्याप्त रूप से परिभाषित किया गया है रिक्त है। मूल्य 360 के लिए इसी76; रोटेशन तो इस प्रयोग में 4. P1 से विभाजित है 10.5 μsec है। बढ़े क्षेत्र: अवशिष्ट संकेत की आवृत्ति o1p पैरामीटर (आवृत्ति 1 घंटे के लिए ऑफसेट) को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्रा 7 एक नि: शुल्क प्रेरण क्षय (खूंटी), यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक एनएमआर संकेत का पता चला है कल्पना कर पता चलता है। चित्रा 7B। के रूप में के रूप में विषम चोटियों दिखने अनुनादों द्वारा देखा, एक गलत चरण के साथ एक -1 डी 1 एच स्पेक्ट्रम से पता चलता है। चित्रा 7C यह दर्शाता है कि बुनियादी अधिग्रहण पैरामीटर सही ढंग से स्थापित किया गया और प्रोटीन के नमूने से एक संकेत का पता लगाया जा सकता है, शोर अनुपात करने के लिए अच्छा संकेत के साथ एक -1 डी 1 एच स्पेक्ट्रम से पता चलता है। 8 चित्रा 2 डी एच 1, 900 मेगाहर्ट्ज पर पुनः संयोजक 15 एन-ताऊ के 15 एन HSQC स्पेक्ट्रा पता चलता है; अच्छा संवेदनशीलता और संकल्प और चित्रा 8B के साथ चित्रा 8A। नमूने में प्रोटियोलिसिस का पता लगाने के साथ, अतिरिक्त पीई की उपस्थिति से देखा के रूप मेंस्पेक्ट्रम (नीले बॉक्स) में अक्स। 9 चित्रा 2 डी एच 1, 600 मेगाहर्ट्ज पर पुनः संयोजक 15 एन-ताऊ चित्रा 9 ए के 15 एन HSQC स्पेक्ट्रा, अच्छा संवेदनशीलता लेकिन कम संकल्प 8A आंकड़ा की तुलना के साथ दिखाता है। 600 मेगाहर्ट्ज पर चित्रा 9B, फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों (लाल बॉक्स) के लिए इसी स्पेक्ट्रम में अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति से पता चलता है। 900 मेगाहर्ट्ज पर चित्रा 9, फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों (लाल बॉक्स) के लिए इसी स्पेक्ट्रम में चोटियों से पता चलता है। संकल्प चित्रा 9B की तुलना में बेहतर है। चित्रा 10 एक एक सफल प्रयोग का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल 3 डी एनएमआर स्पेक्ट्रम से अनुमानों से पता चलता है। चित्रा 10B एक 1 एच 13 सी विमान अच्छा संकेत तीव्रता दोनों मैं और मैं -1 अवशेषों से 13 सी संकेतों का पता लगाने के लिए अनुमति देने के साथ 1 एच 15 एन 13 सी 3 डी स्पेक्ट्रम से निकाला पता चलता है।


चित्रा 1: पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन और समस्थानिक लेबलिंग के मुख्य कदम की योजना। प्रोटोकॉल के पैरा 1 में वर्णित के रूप में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए बैक्टीरिया परिवर्तन से कदम रेखांकित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पुनः संयोजक प्रोटीन ताउ शुद्धि के मुख्य कदम की योजना। बैक्टीरियल कोशिकाओं से कदम पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्धि के लिए lysis प्रोटोकॉल के पैरा 2 में वर्णित के रूप में रेखांकित कर रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रोटोकॉल के तरल क्रोमैटोग्राफी कदम। गर्म बैक्टीरियल निकालने की (ए) कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी विभाजन। 280 एनएम, 260 एनएम और चालकता पर absorbance ठोस और धराशायी काले लाइनों और बिंदीदार लाल रेखा को क्रमश अनुरूप हैं। 12% एकत्र भिन्न के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण वर्णलेख ऊपर दिखाया गया है। (बी) lyophilization के लिए उपयुक्त एक बफर में ताउ प्रोटीन की Desalting। शुद्ध ताउ प्रोटीन की मात्रा शिखर क्षेत्र (2,260 मऊ * एमएल) से अनुमान लगाया ताऊ के 16 मिलीग्राम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 चित्रा 4: 12% ताउ के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण। लेन 1, आणविक वजन मार्कर; 2 लेन, ताऊ के 10 माइक्रोग्राम; 3 लेन, ERK-phosphorylated ताऊ के 10 माइक्रोग्राम। ताउ, अन्य विस्थापितों के रूप में, एसडीएस पृष्ठ पर एक विषम ढंग से चलाता है एक स्पष्ट आणविक बजाय उम्मीद 46 केडीए के बारे में 60 केडीए के वजन पर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: एनएमआर नमूना तैयार करने, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी डाटा अधिग्रहण और डाटा प्रोसेसिंग के लिए मुख्य कदम की योजना। प्रोटोकॉल के पैरा 4 में वर्णित के रूप में डाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए एनएमआर नमूना तैयार करने से कदम रेखांकित कर रहे हैं। एक बड़ा versio देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के एन।

चित्रा 6
चित्रा 6: एनएमआर डाटा अधिग्रहण के लिए P1 पैरामीटर के सेट-अप। यह पैरामीटर नमूनों के बीच अलग है और मुख्य रूप से नमक एकाग्रता पर निर्भर है। डी 2 ओ में 80% एच 2 ओ के लिए एक मानक 1 एच शिखावर्तन की अवस्था में दिखाया गया है। 30 सेकंड की देरी के साथ रीसायकल स्पेक्ट्रा एकल-स्कैन एकत्र की है और क्षैतिज प्लॉट किए जाते थे। नाड़ी (P1) 1 μsec के चरणों में 1 μsec 55 μsec से अलग किया गया था। सिद्धांत रूप में, संकेत एक 90 डिग्री नाड़ी के लिए अधिक से अधिक है और एक 180 डिग्री नाड़ी के लिए शून्य के बराबर होना चाहिए। हालाँकि, व्यवहार में, विकिरण भिगोना जो मुश्किल से 90 डिग्री या 180 डिग्री दालों सीधे निर्धारित करने के लिए बनाने विषमता और चरण विरूपण समस्याओं का कारण बनता है। दूसरी अशक्त बिंदु एक 360 डिग्री पल्स अवधि से मेल खाती है। बढ़े हुए क्षेत्र एक 360 डिग्री के लिए एक अवशिष्ट संकेत से पता चलता है नाड़ी कि o1p आवृत्ति पैरामीटर परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: एनएमआर डाटा प्रोसेसिंग। (ए) समय क्षेत्र में फ्री प्रेरण संकेत क्षय। -1 डी प्रोटॉन स्पेक्ट्रा (बी) (PHC0 -206 °) आवृत्ति डोमेन में पैनल से खूंटी के फूरियर परिवर्तन से, लेकिन गलत चरण के साथ हो जाती है। (सी) चरणबद्ध (PHC0 -113 °) और संदर्भित (0 पीपीएम पर TMSP संकेत)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"/>
चित्रा 8: 2 डी एच 1, 900 मेगाहर्ट्ज पर पुनः संयोजक 15 एन-ताऊ के 15 एन HSQC स्पेक्ट्रा। 3,072 और 416 अधिग्रहण डेटा अंक 14 के वर्णक्रमीय चौड़ाई और 1 एच (F2) और 15 एन (एफ 1) आयामों में 25 पीपीएम का उपयोग कर, क्रमशः दर्ज किए गए। 16 स्कैन F1 वेतन वृद्धि प्रति दर्ज किए गए, 4 घंटा 30 मिनट का प्रयोग की अवधि के लिए अग्रणी। (ए) अच्छी गुणवत्ता ताउ नमूना (बी) ताउ नमूना गिरावट के रूप में स्पेक्ट्रम (उच्च क्षेत्र 1 एच, कम क्षेत्र 15 एन) की एक विशेष क्षेत्र में अतिरिक्त अनुनादों की उपस्थिति से पता चला दिखा रहा है, यहां नीले रंग में बॉक्सिंग। यह पिछले नमूना प्रोटीज अवरोधकों के बिना तैयार किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा 9: 2 डी 1 एच, 15 एन HSQC पुनः संयोजक 15 एन-ताऊ के स्पेक्ट्रा। (ए) unphosphorylated ताउ, 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रम (बी) phosphorylated ताउ, 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रम और (सी) phosphorylated ताउ, 900 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रम। स्पेक्ट्रम के एक विशेष क्षेत्र में अतिरिक्त अनुनादों, यहाँ लाल रंग में बॉक्सिंग, फॉस्फोरिलेटेड ताउ स्पेक्ट्रा में मनाया जाता है। ये अनुनादों, जो प्रोटॉन एमाइड (1 एच 15 एन) pSer और pThr अवशेषों की सह-संबंध के अनुरूप है, आसानी से, चारों ओर 8.5 1 घंटे के लिए 9.5 पीपीएम और 15 एन 117 के लिए 125 पीपीएम से क्षेत्र में कल्पना कर रहे हैं के थोक बाहर 1 एच, unphosphorylated ताउ स्पेक्ट्रम के 15 एन सहसंबंध। (ए और बी) 600 मेगाहर्ट्ज, 14 और 25 पीपीएम के वर्णक्रमीय चौड़ाई में 2,048 और 256 डेटा अंक, 1 एच (F2) और 15 एन (एफ 1) आयामों में दर्ज किए गए क्रमशः पर हासिल स्पेक्ट्रा के अनुरूप हैं।32 स्कैन का इस्तेमाल किया गया है, और अधिग्रहण की कुल अवधि 2 घंटा 44 मिनट और (सी) 900 मेगाहर्ट्ज, 14 के वर्णक्रमीय चौड़ाई में 3,072 और 416 डेटा अंक और 25 पीपीएम 1 एच (F2) में दर्ज किए गए और 15 एन में (गया था एफ 1) आयाम, क्रमशः। 48 स्कैन का इस्तेमाल किया गया है, और अधिग्रहण की कुल अवधि 6 घंटा 37 मिनट था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10: 3 डी 1 एच, 15 एन, 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम, अनुमानों और निकाले 2 डी विमानों। 2,048, 72, और 256 डेटा बिंदुओं 1 एच (F3), 15 एन (F2) में दर्ज किए गए, और 13 सी (एफ 1) आयाम, क्रमशः। स्पेक्ट्रल चौड़ाई 14, 25, और 61 पीपीएम कर रहे हैं, 4.7, 119 पर केंद्रित है, और एच 1 में 41 पीपीएम,15 एन और 13 सी आयाम, क्रमशः। अधिग्रहण के 16 स्कैन का उपयोग करने की अवधि 4 दिन और 6 घंटा है। (ए) घन प्रतिनिधित्व फूरियर करने के लिए इसी तब्दील ERK-phosphorylated ताउ के एक HNCACB स्पेक्ट्रम के 3 डी डाटासेट 600 मेगाहर्ट्ज पर प्राप्त की। 2 डी एच 1, 15 और एन 1 एच, 13 सी विमानों क्रमश: 13 सी के साथ 3 डी डेटा और 15 एन आयाम के प्रक्षेपण से प्राप्त कर रहे हैं। डाटा प्रोसेसिंग और प्रतिनिधित्व एनएमआर अधिग्रहण और प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। (बी) 2 डी 1 एच, 13 सी विमान 3 डी 1 एच से निकाले गए, 15 एन, 121.8 पीपीएम के एक 15 एन रासायनिक पारी में 13 सी एनएमआर डाटासेट। (दाईं ओर) एक जूम 9.38 पीपीएम के 1 एच रासायनिक बदलाव पर केंद्रित दोनों अवशेषों मैं (pThr153) और मैं -1 (Ala152) का 13 सीए और 13 सीबी अनुनादों पता चलता है। 13 सीबी गूंज एस की चौड़ाई के कारण एलियास हैpectral खिड़की। ग्राफिकल प्रतिनिधित्व और शिखर उठा एनएमआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है enzymatically संशोधित ताउ नमूनों को चिह्नित करने के लिए। पुनः संयोजक अभिव्यक्ति और यहाँ पूर्ण लंबाई मानव ताउ प्रोटीन के लिए वर्णित शुद्धि इसी तरह उत्परिवर्ती ताउ या ताऊ डोमेन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Isotopically समृद्ध प्रोटीन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है, पुनः संयोजक अभिव्यक्ति की जरूरत महसूस। फोस्फोराइलेशन साइटों की पहचान गूंज काम और एक 15 एन, 13 सी दोगुना लेबल प्रोटीन की आवश्यकता है। आइसोटोप की लागत को देखते हुए, अच्छी उपज पुनः संयोजक अभिव्यक्ति कदम में आवश्यक है। ग्लूकोज M9 मध्यम में बैक्टीरिया विकास इसलिए 13 सी 6 -glucose की राशि उपज में सुधार करने के लिए प्रति लीटर की वृद्धि मध्यम 4 जी के लिए बढ़ाया जा सकता है के लिए सीमित कारक है। पूरा मध्यम और सदस्य विटामिन के अलावा अनिवार्य नहीं हैं, लेकिन विकास को प्रोत्साहित और उपज में सुधार करने के लिए मदद करते हैं। पूरा लेबल माध्यम की उच्च लागत को देखते हुए, इस उत्पाद को केवल एक मध्यम विकास supplemen के रूप में प्रयोग किया जाता हैटी। बैक्टीरियल विकास M9 मध्यम में धीमी है। आम तौर पर, M9 मीडिया का उपयोग बैक्टीरियल संस्कृतियों ऊष्मायन के बारे में 4 घंटे के बाद प्रेरण के 3% पूरा मध्यम पहुंच समय के साथ पूरक। एक आयुध डिपो के 600 1.6-1.8 आमतौर पर संस्कृति के अंत में प्राप्त की है। पुनः संयोजक ताउ प्रोटीन की उम्मीद की उपज प्रति जीवाणु संस्कृति की लीटर के बारे में 15 मिलीग्राम है। एक प्रोग्राम इनक्यूबेटर का उपयोग आसानी से दिन के समय तक काम के दौरान प्रोटीन के उत्पादन, बैक्टीरिया गोली और प्रोटीन के उत्पादन के विश्लेषणात्मक नियंत्रण के संग्रह का समय निर्धारित करने की अनुमति देता है।

नमूना एकाग्रता एक अच्छी गुणवत्ता वाले स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक ठेठ ताउ नमूना एक 2 डी स्पेक्ट्रम के लिए पर्याप्त 200 μl (यानी 100 माइक्रोन) के ताउ प्रोटीन में 1 मिलीग्राम शामिल होगा। एक 3 डी स्पेक्ट्रम के लिए, 300 μl में कम से कम 200 सुक्ष्ममापी, आवश्यक हैं बशर्ते कि एक क्रायोजेनिक जांच सिर प्रयोग किया जाता है। इस तरह 900 मेगाहर्ट्ज इस अध्ययन में इस्तेमाल साधन बेहतर संकेत करने वाली शोर प्रदान करेगा के रूप में एक उच्च क्षेत्र स्पेक्ट्रोमीटर के लिए प्रवेश,और (8 चित्रा) नमूना एकाग्रता पर बाधाओं को कम। यह देखते हुए कि ताऊ एक बड़ी अव्यवस्थित प्रोटीन होता है, इसके एनएमआर स्पेक्ट्रा काफी संकेत ओवरलैप की विशेषता है, और एक उच्च-क्षेत्र एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर भी (8 चित्रा) संकल्प के मामले में सबसे अच्छा विकल्प होगा। फिर भी, अनुनादों फोस्फोराइलेशन साइटों के लिए इसी स्पेक्ट्रम की एक विशिष्ट क्षेत्र में हैं और एक 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर के साथ भी पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं (आंकड़े 9 बी और 9 की तुलना करें)। इसके अलावा, अपने अव्यवस्थित प्रकृति के कारण, ताउ प्रोटीन प्रोटियोलिसिस (आंकड़े 8B) के प्रति संवेदनशील है।

buffers की नसबंदी ताउ गिरावट को सीमित करने की सलाह दी है। एनएमआर नमूने के लिए प्रोटीज inhibitors के अलावा डाटा अधिग्रहण समय है कि नाड़ी क्रम पर निर्भर करता है, दिनों घंटे से पिछले कर सकते हैं दौरान गिरावट के खिलाफ ताऊ की रक्षा के लिए मदद करता है। कम पीएच (7.0 नीचे यानी पीएच) ए वी के लिए आवश्यक हैOID प्रोटीन प्रोटॉन और पानी प्रोटॉन, विस्तार का संकेत की ओर जाता है, जो बीच में भी तेजी से आदान-प्रदान। नमूना पीएच भी अच्छी तरह से स्पेक्ट्रा के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए। दरअसल, जब से pSer और pThr के pKa मूल्यों एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए इष्टतम पीएच के करीब हैं, फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों की रासायनिक पारियों पीएच बदलाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं। एनएमआर नमूने की पीएच का समायोजन एक पीएच सूक्ष्म इलेक्ट्रोड के साथ एक पीएच मीटर, छोटे संस्करणों के लिए अनुकूलित का उपयोग कर सीधे बनाया जा सकता है। ताउ एक घुलनशील प्रोटीन और मानक स्थितियों में कुल नहीं है। ऐसे हेपरिन सल्फेट, और 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के रूप में polyanions के अलावा ताऊ नमूनों में एकत्रीकरण आरंभ कर सकते हैं। इस मामले में, समुच्चय के ठोस प्रकृति को देखते हुए, इसी एनएमआर स्पेक्ट्रम में अनुनादों के सबसे पता लगाने से परे व्यापक। यहाँ तक कि फॉस्फोरिलेटेड ताउ के नमूनों की स्थिति यहां एनएमआर डाटा अधिग्रहण के लिए वर्णित में कुल नहीं है।

एंटीबॉडी विश्लेषण की तुलना में, एनएमआर एक हे प्रदान करता हैPTMs की verall देखें। मास स्पेक्ट्रोमेट्री भी एक प्रोटीन के नमूने के फोस्फोराइलेशन पैटर्न की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। समस्थानिक लेबलिंग इस तकनीक के लिए आवश्यक नहीं है, और आवश्यक नमूना मात्रा बहुत छोटे होते हैं। हालांकि, इस तरह के रूप में कई ताउ phosphorylations, के साथ एक प्रोटीन के लक्षण वर्णन, चुनौती बनी हुई है। निकटस्थ phosphorylations पहचान के नीचे अप रणनीतियों में समदाब रेखीय पेप्टाइड्स का उत्पादन होगा। पूरी पहचान तो नमूना प्रोटियोलिसिस द्वारा प्राप्त पेप्टाइड्स के एमएस / एमएस अनुक्रमण की जरूरत है। एनएमआर का एक लाभ यह तकनीक के आंतरिक मात्रात्मक प्रकृति में होते हैं। एक एनएमआर संकेत की तीव्रता एक विशिष्ट साइट पर रासायनिक समूह वर्तमान की राशि से जोड़ा जा सकता है। हम इस प्रकार प्रत्येक स्थल पर रासायनिक संशोधन के अनुपात में परिभाषित कर सकते हैं। एमएस अनुप्रयोगों में सबसे हाल ही प्रगति हालांकि पता चला है कि ताउ कई फोस्फोराइलेशन के एमएस विश्लेषण संभव 24 है, यहां तक कि उचित सामान्यीकरण 25 के बाद एक मात्रात्मक तरीके से।

यहाँ, हम सक्रिय ERK2 द्वारा ताउ फोस्फोराइलेशन प्रस्तुत किया, लेकिन कार्यप्रणाली अन्य kinases के रूप में अच्छी तरह से 6,7,26 साथ फोस्फोराइलेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - 28। काइनेटिक प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा सकता है, जो एक प्रोटीन सब्सट्रेट 28 की ओर काइनेज विशिष्टता को परिभाषित करने में मदद कर सकते हैं - 31। Phosphorylation अध्ययनों पुनः संयोजक kinases तक सीमित नहीं हैं, और सेल या ऊतक के अर्क के kinase गतिविधि 6,32,28 का विश्लेषण किया जा सकता है। एक दिलचस्प विकास में सेल एनएमआर का उपयोग सीटू संशोधनों 33,34 में अध्ययन करने के लिए है। इसके विपरीत, एनएमआर भी फॉस्फेट विशिष्टता को संबोधित करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है, के रूप में PP2A फॉस्फेट 35 से फॉस्फोरिलेटेड ताउ के dephosphorylation का अध्ययन करके दिखाया गया था। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी अवरोध यौगिक बुद्धि की उपस्थिति में एक 2 डी स्पेक्ट्रम में प्रोटीन सब्सट्रेट के फोस्फोराइलेशन प्रोफ़ाइल तुलना द्वारा काइनेज अवरोधकों के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता हैज स्पेक्ट्रम एक नियंत्रण प्रयोग 6 से जारी किए हैं।

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने का ब्याज, और अधिक संवेदनशील एमएस तकनीकों की तुलना में, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, बल्कि अकेले अपनी विश्लेषणात्मक क्षमता पर से शोषण आवेदनों की विस्तृत श्रृंखला में रहता है। यह फोस्फोराइलेशन साइटों की पहचान करने के लिए संरचनात्मक या कार्यात्मक संशोधनों है कि मुख्य रूप से एनएमआर का उपयोग कर अध्ययन कर रहे थे के साथ विशिष्ट phosphorylations से जोड़ने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण साबित किया है। फॉस्फोरिलेटेड ताउ नमूनों की एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी दोनों क्षणिक स्थानीय माध्यमिक संरचनाओं पर और संशोधित ताउ 36,37 के गतिशील कलाकारों की टुकड़ी के वैश्विक पुनर्व्यवस्था पर फोस्फोराइलेशन के संरचनात्मक प्रभाव का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। कार्यात्मक पहलुओं ताउ फोस्फोराइलेशन 8 से प्रोटीन भागीदारों के 7,38,39 और एकत्रीकरण के साथ ताऊ के दोनों बातचीत के विनियमन शामिल हैं। फॉस्फोरिलेटेड ताउ नमूना एनएमआर की विशेषता आगे के लिए, phospho निर्भर बातचीत समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता14-3-3 प्रोटीन 40, और इंजीनियर प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के साथ उदाहरण 41,42 inhibitors। एनएमआर अवशेषों के स्तर पर बातचीत साइट (ओं) की परिभाषा की अनुमति देता है, और फोस्फोराइलेशन पर इस बातचीत की निर्भरता की। इसके अतिरिक्त, फॉस्फोरिलेटेड ताउ के एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोलाइन सीआईएस को चिह्नित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति है: ट्रांस आइसोमेरेस Pin1, एक महत्वपूर्ण phospho निर्भर एंजाइम ताउ विनियमन 43 में शामिल - 45। इसके अलावा, एनएमआर द्वारा फोस्फोराइलेशन विश्लेषण विस्थापितों के लिए बल्कि गोलाकार प्रोटीन 46 को न केवल लागू किया जा सकता है। अंत में, इस तरह के acetylations 22,40,41 के रूप में ताऊ PTMs के अन्य प्रकार एनएमआर द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित महत्वपूर्ण सिद्ध कर दिया है बेहतर शारीरिक और रोग की स्थिति में ताऊ के कार्यात्मक और संरचनात्मक विनियमन समझने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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References

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