本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally
Published 12/27/2016
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Biochemistry

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Summary

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Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

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Abstract

Introduction

21世紀の医療の主な課題の1つは、アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患です。タウは、微小管(MT)の形成を刺激する微小管結合タンパク質です。タウは、最もよく知られている、いわゆるタウオパチーは、ADである、いくつかの神経変性疾患においても同様に関与しています。これらの疾患では、タウ対らせん状フィラメント(たPHF)で自己集合体とは、リン酸化の1のような翻訳後修飾(PTMを)により、多くの残基に変更された発見されました。タウタンパク質のリン酸化は、MTの安定化とADの神経細胞を特徴付ける関数の病理学的喪失のその生理学的機能の両方の調節に関与しています。

また、病気のニューロンでのPHFに統合タウタンパク質は、必ず2を過剰リン酸化されています。 2-3リン酸基を含んでいる通常のタウとは異なり、のPHF中の過リン酸化タウは、5から9 phosphatが含まれていますe基3。タウの過剰リンは、いくつかのサイトでの化学量論の増加におよびリン酸化の病理学的部位と呼ばれる追加の部位のリン酸化の両方に対応しています。しかし、オーバーラップはレベル4で量的な違いにもかかわらず、ADおよびリン酸化の正常な成人のパターンとの間に存在します。タウのどの特定のリン酸化事象の影響関数と機能障害はほとんど不明のまま。私たちは、分子レベルでのPTMによってタウ規制を解読することを目指しています。

タウの分子的側面の理解を深めるために、我々は技術的な課題に対処する必要があります。まず、タウは、溶液中で単離された本質的に無秩序なタンパク質(IDP)です。そのようなタンパク質は、生理学的条件下で十分に定義された三次元構造を欠き、その機能(複数可)および構造的特性を研究するために、特定の生物物理学的方法を必要とします。タウは、多くの場合、関連付けられた発見、国内避難民の成長クラスのパラダイムであります神経変性疾患のような病理は、したがって、それらの機能の基礎となる分子パラメータを理解するために関心が高まっ。第二に、タウのリン酸化の特徴付けは最長441アミノ酸のタウアイソフォームの配列に沿って80の潜在的なリン酸化部位で、分析的な課題です。抗体の数は、タウのリン酸化されたエピトープに対して開発されており、ニューロンまたは脳組織中の病理学的タウの検出のために使用されます。リン酸化事象は、プロリンに富む領域内に近接して、プロリン指向性キナーゼによって標的と少なくとも20のサイトにそれらのほとんどを行うことができます。定性(どのサイト?)および定量的(どの化学量論?)キャラクタリゼーションは、最も最近のMS技術5により困難です。

NMR分光法は、配座のアンサンブルから構成される非常に動的なシステムである無秩序なタンパク質を研究するために使用することができます。高分解能NMR分光法は、アプリましたタウタンパク質の構造と機能の両方を調査するために編。 8 -また、タウのリン酸化プロファイルの複雑性は、リン酸化部位6を識別するためのNMRを使用して分子ツール、新しい分析法の開発につながりました。分析方法としてNMRは、リン酸取り込みの程度の全体的な方法で、タウのリン酸化部位の同定、単一の実験内のすべての単一サイトの変更の可視化、定量化を可能にします。タウ上のリン酸化研究は文献にあふれているが、それらのほとんどは、リン酸化の完全なプロファイルの不確実性の大きな程度のため、個々のリン酸化事象の真のインパクトを残して、抗体を用いて行われてきたので、この点は必須です。 PKA、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)、サイクリン依存性キナーゼ2 /サイクリンA(CDK2 / CycA)、サイクリン依存性キナーゼ5(CDK5)/ P25の行為を含む組換えキナーゼタウ向かっリン酸化活性を示すivatorタンパク質、細胞外シグナル調節キナーゼ2(ERK2)と微小管親和性調節キナーゼ(MARK)は、活性形態で調製することができます。また、十分に特徴付けられたリン酸化パターンと特定のタウタンパク質アイソフォームの生成を可能にするタウ変異体は、タウのリン酸化のコードを解読するために使用されます。 8 - NMR分光法は次に酵素的に修飾されたタウのサンプル6を特徴付けるために使用されます。タウのin vitroリン酸化は、このようなグルタミン酸(Gluの)残基に選択されたセリン/スレオニンの変異などによって擬似リン酸化よりも困難ではあるが、このアプローチは、そのメリットがあります。実際に、リン酸化のいずれも構造的な影響も相互作用パラメータは、常にグルタミン酸によって模倣することができます。例では、Gluの突然変異9で再現されていないホスホセリン202(pSer202)の周りに観察ターンモチーフ/ホスホトレオニン205(pThr205)、です。

インビトロでのリン酸化タウの詳細なプロトコルが提示されています。 12 - ERK2は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/ ERKキナーゼ(MEK)10によるリン酸化によって活性化されます。修飾された、同位体標識されたタウタンパク質の調製に加えて、のPTMの同定のために使用されるNMR戦略が記載されています。

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Protocol

15 N、13 C-タウ(図1)の1.生産

  1. BL21にをpET15b-タウ組換えT7発現プラスミド13,14を変換(DE3)コンピテント大腸菌細菌細胞15。
    注:最長(441アミノ酸残基)タウアイソフォームをコードするcDNAは、たpET15bプラスミド中にNcoIおよびXhoI制限部位の間にクローニングされています。
    1. 有能BL21 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに100ngのプラスミドDNAとプラスミドDNAのμgのあたり1-5×10 7個のコロニーを形成する(DE3)細胞の穏やか50μlのを混ぜます。
      注:真核生物のcDNA発現のためのコドン使用最適化された細菌株は、ヒトのタウを生成するために必須ではありません。
    2. 30分間氷上で細胞混合物を配置し、42℃で10秒間ヒートショック。バック氷上で5分間チューブを置き、室温LB(Luria-Bertani)培地の1ミリリットルを追加します。穏やかな下37℃で30分間細菌懸濁液をインキュベート攪拌。
  2. アンピシリン抗生物質の100μg/ mlを含むLB培地の寒天プレート上に白金耳に均等に100μlの細胞懸濁液を用いて拡散。
  3. 37℃で15時間、選択プレートをインキュベートします。
  4. 約2週間の最大のために、培養工程に進むまで4℃で選択プレートを保管してください。
    注:細菌培養液(50%グリセロール)のグリセロールストックを、-80℃で保存されたが、後の段階で培養を開始するために調製することができます。
  5. オートクレーブ処理M9塩の1 L(6グラム Na 2にHPO 4、3グラムのKH 2 PO 4をミリリットルの100mMのCaCl 2、10ミリリットル100倍のMEMビタミン補数1ミリリットルの1MのMgSO 4、1、1ミリリットルを100mg / mlのアンピシリンを追加します。 、0.5グラムのNaCl)。
    注:白色の沈殿物はすぐに消散M9塩へのCaCl 2溶液の添加時に形成することになります。
  6. 15 Nの300mgを、13 C-完全培地、15 1gを溶解NH 4 ClおよびM9培地10mlで13 C 6 -グルコースの2グラム。フィルター滅菌直接M9培地に、0.2μmのフィルターを用いた同位体ソリューションを。
  7. 100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB培地20mlに選択プレートから細菌を形質転換したpET15b-タウの接種ループ1コロニーを使用して一時停止します。
  8. 約6時間、37℃で接種した培地をインキュベートします。
  9. プラスチック製の分光計のキュベット中の細菌培養物の10倍希釈の1ミリリットルで600 nmで(OD 600)での光学密度を測定します。
    注:3.0から4.0の600を ODに対応する細菌培養物の濁度は、飽和増殖期に到達したことを示しています。
  10. 2 Lの三角プラスチックバッフル付き培養フラスコに、アンピシリン(100μg/ mlの最終濃度)を補充したM9成長培地の1Lに飽和LB培地20 mLを加え。
  11. 10°に設定し、プログラム可能なインキュベーターで培養フラスコを配置Cと50 rpmで。次の日の朝早く200rpmで、37℃に切り替えるにはインキュベーターをプログラムします。
  12. プラスチック製の分光計キュベット中の細菌培養物1ml 1のOD 600を測定ます。 OD 600は、組換えタウタンパク質の発現を誘導するために、約1.0の値に達すると(-20℃に保たれ)1 M IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)ストック溶液の400μlのを追加します。
  13. さらに3時間37℃でインキュベーションを続けます。 20分間、5000×gでの遠心分離によって菌体を回収。
  14. -20℃で細菌ペレットを凍結します。必要に応じて長時間、精製工程まで凍結保管してください。

15 Nの2精製、13 C-タウ(図2)

  1. 20分間、15 psiの下、121℃でオートクレーブ陽イオン交換(CEX)精製バッファー。 4°Cで保存するバッファ。
  2. 細菌細胞ペレットを解凍し、45ミリリットルで徹底的に再懸濁抽出CEX新たにプロテアーゼ阻害剤カクテル1×(1錠)及びDNアーゼI(2,000単位)を補充した緩衝液(50mMのNaPi緩衝液pH 6.5、1 mMのEDTA)の。
  3. 20,000psiで高圧ホモジナイザーを使用して、細菌細胞を破壊します。 3-4パスが必要です。不溶性物質を除去するために40分間20,000×gで遠心分離します。
  4. 水浴を用いて75℃で15分間、細菌細胞抽出物を加熱します。
    注:白色沈殿物が数分後に観察されます。
  5. 20分間、15,000×gで遠心分離し、熱安定性タウ蛋白質を含有する上清を保ちます。
  6. 次の精製工程まで-20°Cで保存し、必要に応じて。
  7. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システム( 図3A)を用いて、5 mlの床カラムとしてパック強いCEX樹脂の陽イオン交換クロマトグラフィーを行います。
    1. 2.5ミリリットル/分に設定流量。
    2. バッファCEXカラムを平衡化
    3. 60〜70ミリリットルhea​​ted-をロードタウは、試料ポンプを使用して含有する抽出物、あるいはシステムに応じて、ポンプ。フロースルータウタンパク質を効率的に(2.8を参照)を樹脂に結合されていることを確認するための分析のために収集します。
    4. 280nmでの吸光度がベースラインに戻る値になるまで、CEX A緩衝液で樹脂を洗浄します。
    5. CEX Bバッファー(1 M NaClでCEX緩衝液)の緩やかな増加により得られた三段階NaCl勾配を用いてカラムから溶出タウ。プログラムFPLC次のように250mMの塩化ナトリウム、500mMのNaClに到達する5 CV 50%CEX Bのバッファに第二工程、第三工程に到達する10カラム容量(CV)で25%CEX Bバッファに傾斜する第一の工程と2 CVで100%CEX B緩衝液は、1MのNaClに到達します。溶出工程の間に1.5ミリリットルの画分を収集します。
  8. SDS-PAGE(12%SDSアクリルアミドゲル)により溶出工程とクマシー染色( 図3 A)16の間に収集された画分の10μLを分析します。 ANALYによってだけでなく、カラムに負荷ステップをチェックフロースルーを10μlシュッ。
  9. タウを含む画分を選択し、次のステップのためにこれらの画分をプール。
  10. タウ含有プールされた画分( 図3 B)に緩衝液交換を行います。
    1. FPLCシステムを用いて、50mMの重炭酸アンモニウム(揮発性緩衝液)中で53ミリリットルG25樹脂充填床(26×10センチ)の脱塩カラムを平衡化します。
    2. 5ミリリットル/分に設定流量。 5ミリリットル注入ループを介してカラム上のタウのサンプルを注入します。 280nmの吸収ピークに対応する画分を収集します。
    3. 初期CEXプールのボリュームに応じて、注射を3-4回繰り返します。
  11. (タウ1mgの140 MAU * mlに相当する)、280nmでのクロマトグラムのピーク面積を用いて精製したタウタンパク質の量を計算します。
    注:280 nmにおけるタウタンパク質の吸光係数は、7550 M -1 -1です。タウは、任意のTrp残基が含まれていません。
  12. プールは、すべてのタウ画分。
  13. Aliquoタウの1〜5ミリグラムと同等のものを含むチューブにサンプルトン。溶液の体積は、チューブ(50mlチューブ中の溶液を、例えば、5ml)中の容積に比べて小さいように、これらのチューブを選択します。
  14. 針を用いて、チューブキャップに穴をパンチ。 -80℃で凍結タウサンプル。
  15. 凍結乾燥タウサンプル。凍結乾燥されたタウタンパク質は、長期間-20℃で保存することができます。

15 N-タウのin vitroリン酸化3.

  1. 500μlのリン酸化緩衝液(50mMのHepes・KOH、pHは8.0、12.5ミリモルのMgCl 2、1mMのEDTA、50mMのNaCl)中で凍結乾燥されたタウ5mgを溶解させます。
  2. 0.5 M株式の2.5 mMのATP(100mMのストック溶液25μlを-20℃で保存)、1mMのDTT(1 Mストック溶液1μlは、-20℃で保存)、1mMのEGTAを追加(2μlの溶液)、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(1 mlのリン酸化緩衝液中に1錠を溶解した40倍ストックの25μL)および181; Mは、総サンプル体積中(保全バッファーて10mMのHepes、pHが7.3、-80℃で保存1mMのDTT、5mMのMgCl 2、100mMのNaCl、10%グリセロール、250μlの)彼の-ERK2を活性化します1ミリリットル。
    注:活性化された彼の-ERK2はMEKキナーゼでリン酸化することにより、社内で5,8調製することができます。
  3. 37℃で3時間インキュベートします。
  4. ERKキナーゼを不活性化するために15分間75℃で試料を加熱します。
  5. 15分20,000×gで遠心分離します。収集し、上清を保持します。
  6. 1ミリリットルのサンプルに適して3.45ミリリットルG25樹脂充填床(1.3×2.6センチメートル)のカラムを用いて50mMの重炭酸アンモニウムへのタンパク質試料を脱塩します。
  7. その完全性と効率的なリン酸化( 図4)の両方をチェックするためにタンパク質試料の2.5μlの12%SDS-PAGE 16を実行します
  8. リン酸化タウのサンプルを凍結乾燥。 -20℃で粉末を保管してください。

NMRスペクトルの4買収(FIグレ5)

  1. 凍結乾燥された15 Nの4 mgを、400μlのNMRバッファ内の13 C ERKリン酸化タウ(50 mMののNaPiまたはトリス- D11 .Cl重水素化の50mM、pH6.5の、30mMの塩化ナトリウム、2.5mMのEDTAおよび1mM DTT)を可溶化します。
  2. 内部のNMR信号基準としてNMR分光計のフィールドのロックおよび1mM TMSP(3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3- D 4酸ナトリウム塩))、5%のD 2 Oを追加します。完全プロテアーゼ阻害剤カクテルの40倍ストック溶液10μlを加えます。
  3. 長い針またはパスツールピペットで電子注射器を用いて、5mmのNMRチューブにサンプルを転送します。プランジャーを使用して、NMR管を閉じます。プランジャーの動きによってプランジャと液体の間に閉じ込められた任意の気泡を除去します。
  4. スピナーでNMR管を配置します。試料溶液のほとんどは、NMRコイルの内側となるように、使用されるNMRプローブヘッドのための適切なゲージでスピナーでその垂直位置を調整します。
  5. 空気の流れを開始します。 リフト私をクリック磁石制御システムウィンドウをNです。慎重に磁石ボアの上部の気流にチューブをスピナーを置きます。空気の流れを停止します( リフトをクリックして)、チューブを磁石にプローブヘッド内部の所定の位置に降りてみましょう。
  6. 25°C(298 K)に設定された温度。
  7. 動力伝達を最適化するために、プローブヘッドの半自動チューニング及びマッチングを行います。コマンドラインでatmm入力します。
  8. 重水素チャンネルで録音したサンプルのD 2 O信号を用いた分光周波数をロックします。磁石制御システムウィンドウでロックをクリックします。
  9. 試料の位置における磁場の均一性を最適化するために、シミング手順を開始します。シム・ウィンドウを開くには、コマンドラインでtopshim GUIを入力します。シム・ウィンドウで開始 ]をクリックします。シムは(2未満Hzのが良いです)最適であることを確認するために、残留B0標準偏差値を確認してください。
  10. プロトンのP1パラメータ(長さのキャリブレーションプロトンスピンの90°の回転を得るために必要であるマイクロ秒での高周波パルス)。水プロトンの1Dスペクトル( 図6)を用いて、360°パルスを目指します。
  11. 図6)1Dスペクトルにおけるプロトン水周波数(Hz単位)O1パラメータを設定することにより、周波数オフセットを調整します。
  12. サンプル( 図7)からの信号を確認するために(例えばzggpw5のために、水信号抑圧のためのウォーターゲートの配列を有するパルス・シーケンス)1Dプロトンスペクトルの取得を開始します。相対的なタンパク質濃度にスキャン数を適応させます。取得を開始するには、コマンドラインでZG入力します。
  13. (パルスシーケンスhsqcetfpf3gpsi、8-9図 )2D [1 H、15 N] HSQCスペクトルを取得するための追加パラメータを設定します。
    1. 15 Nについては、13 C、15 N、間接的進化の間に13 Cを切り離す、サンプルを標識しました。
    2. 1 H(F2)および15 N(F1)次元での点の数とスペクトル幅(ppm)を設定します。
      注:ポイントごとヘルツ同様の数を維持し、デカップリング時間を制限するために、分光器のフィールドに取得データポイントの数を適応:1 H次元で、600 MHzで900 MHzおよび2048ポイントで3072ポイントを使用しています。
    3. 追加の遅延に対応するパルスシーケンスのパラメータ、パルス長、オフセット周波数、電力レベルを最適化します。タイプは、実験に関連するすべてのパラメータを表示するには、コマンドラインでASED。
  14. 600 MHzで3D [1 H、15 N、13 C] HNCACBスペクトル(パルスシーケンスhncacbgpwg3d、 図10A)の取得のためのパラメータを設定。
  15. 600 MHzで3D [1 H、15 N、15 N] HNCANNH実験(パルスシーケンスhncannhgpwg3d)のためのパラメータを設定。 1 Hに2048ポイントの数を設定して、64そして2 15 N次元で128点。 、25は、百万分率(ppm)25部は4.7、119、1 Hで119 ppmで、15 Nおよび15 N寸法を中心に14としてスペクトル幅を定義します。 16スキャンで取得期間は1日と22時間です。

リン酸化部位の同定5.

  1. 収集処理NMRソフトウェアを使用して処理スペクトル。
    1. データ( 図7)のフーリエ変換を実行します。 1Dスペクトルの型フィート 、2DスペクトルのためのXFBまたはコマンドラインで、3Dスペクトルをft3d。
    2. 対話型のウィンドウを使用して位相およびリファレンスすべてのスペクトル( 図7C)。
  2. 2D HSQCが潜在的リン酸化のSerおよびThr残基( 図9、赤いボックス)に対応するの関心の共振を特定します。
  3. 抽出面からの( すなわち 、2D 1 H- 13 Cスペクトル)2Dにおける関心の共鳴の15 N化学シフトを用いた3次元1 H- 15 N- 13 Cスペクトル。可視化する面(W1-W3)に対応した15 Nの周波数( 図10B)を選択する次元2(W2)のカーソルを使用してください。
  4. 「CA」の共振周波数を選択し、それぞれの[1 H、15 N]共鳴のための「私」と「I-1」残基(I残基のものに比べて信号の弱い組)の「CB」13 C核ポインタモードメニューで、共振をクリックしてHNCACB 3Dスペクトルの関心のピークリストファイルに化学シフト値を追加するには、ピークを追加/見つけます。
    1. pSerおよびPTHR 17のCAとCB化学シフトの既知の値にピークリスト内の化学シフトを比較することによって、私の残基の種類、のpSerまたはPTHRを識別します。
    2. 特徴的な追加の2 ppmのシフトOによってI + 1位のPro残基の存在を特定しますCAの化学シフト値18 F。
    3. 化学シフトの表に、I-1残基に対応するCAとCB共鳴の化学シフト値を比較し、I-1位の残基の性質を識別するために、タウのアミノ酸残基19を予測しました
  5. 'i'はHNCANNHスペクトルの関心の各[1 H、15 N]共鳴のためにと「I-1」残基の15 N核の共鳴周波数を選択してください。
  6. 23 -タウタンパク質20の化学シフトの割り当てに15 N化学シフト値を比較します。
  7. 配列特異的な割り当てを定義するにはタウ・シーケンスで識別ジペプチドを比較してください。

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Representative Results

図3Aは、溶出勾配の間に観察された280nmの主要な吸収ピークを示します。クロマトグラム以上のアクリルアミドゲル上で見られるように、このピークは、精製されたタウタンパク質に相当します。 図3Bは、タンパク質の脱塩が効率的であることを確認して、280 nmおよび導電率のピーク時によく分離吸収ピークを示しています。 図4は、タンパク質のSDS-PAGE分析により、複数のタンパク質のリン酸化の16の特性を観察したゲルシフト(比較レーン2及び3)を示します図6は、(マイクロ秒単位)パルス長の増加とともにプロトン(1 H)1Dの一連のスペクトルを示しています。信号を最小化することによって較正することが容易であるように設定に90°1 Hスピン磁化を回転させるパルスの長さは、360°の回転に対応するパルスは、実際に使用されます。 360°パルスの長さが適切に定義されているときに水プロトンの信号はnullです。 360に対応した値76;回転は、この実験では4 p1で分割さ10.5マイクロ秒です。拡大領域:残差信号の周波数(1 Hオフセット周波数)o1pパラメータを定義するために使用されます。 図7 A.は、NMR信号が検出されることを確実にするために可視化自由誘導減衰(FID)を示します。 図7B。非対称のピークとして現れる共振によって見られるように、誤った位相の1D 1 Hスペクトルを示します。 図7Cは、基本的な取得パラメータが正しく設定され、タンパク質試料からの信号を検出することができることを示し、良好な信号対雑音比との1D 1 Hスペクトルを示します。 図8は、2D 1 H、900 MHzの組換え15 N-タウの15 N HSQCスペクトルを示します。良好な感度と分解能と図8B8A。サンプル中のタンパク質分解を検出すると、付加的なPEの出現によって見られるようにスペクトル(青箱)でAKS。 図9は、 図8(a)に比べて良好な感度が、あまり解像度で、600 MHzでの組換え15 N-タウ図9A15 N HSQCスペクトル、2D 1 Hを示しています。 600 MHzで図9Bは 、リン酸化残基(赤いボックス)に対応するスペクトルにおける追加のピークの出現を示しています。 900 MHzの図9Cは 、リン酸化残基(赤いボックス)に対応するスペクトルのピークを示しています。解像度は、 図9(B)よりも良好です。 図10 Aが成功した実験を評価するために使用される3D NMRスペクトルから予測を示しています。 図10Bは、良好な信号強度の両方IおよびI-1の残基13からC信号を検出することを可能にする1 H- 15 N- 13 C次元スペクトルから抽出した1 H- 13 C面を示します。


図1:組換えタンパク質生産および同位体標識の主要なステップのスキーム。プロトコルの第1項で説明したように、組換えタンパク質の生産に細菌の形質転換からのステップが概説されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 組換えタウタンパク質の精製の主なステップのスキーム。プロトコルの第2項で説明したように、組換えタンパク質の精製に細菌細胞の溶解からのステップが概説されています。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

図3
図3:プロトコルの液体クロマトグラフィー工程。加熱された細菌抽出物の(A)陽イオン交換クロマトグラフィー分画。 280 nmで、260 nmおよび導電率の吸光度は、固体と破線の黒い線と赤い点線にそれぞれ対応します。集めた画分の12%のSDS-PAGE分析は、クロマトグラム上に示されています。 (B)凍結乾燥に適したバッファにタウタンパク質の脱塩。ピーク面積(2260 MAU *のミリリットル)から推定した精製タウタンパク質の量は、タウの16 mgです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4 図4:タウの12%SDS-PAGE分析。レーン1、分子量マーカー。レーン2、タウの10μgの。レーン3、ERKリン酸化タウの10μgの。タウは、他の国内避難民として、約60キロダルトンの代わりに予想される46kDaの見かけの分子量で、SDS-PAGEで変則的な方法で実行されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:NMR試料調製、NMR分光データ取得およびデータ処理のための主な手順のスキーム。プロトコルの第4項で説明したようにNMR試料調製からのデータ取得および処理の手順を概説します。 大きい版?をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図のn個。

図6
6:NMR データ取得のためのP1パラメータのセットアップ。このパラメータは、サンプル間で異なると塩濃度に主に依存しています。 D 2 O中80%H 2 Oのための標準的な1 Hの章動曲線が示されています。 30秒のリサイクルディレイ付きシングルスキャンスペクトルを収集し、水平方向にプロットしました。パルス(P1)は、1マイクロ秒のステップで1マイクロ秒マイクロ秒から55まで変化させました。理論的には、信号は、90°パルスのための最大および180°パルスはゼロに等しくなければなりません。しかし、実際には、放射線の減衰が困難直接的90°または180°のパルスを決定することを可能にする非対称および位相歪みの問題を引き起こします。第二のヌル点は360°パルスの持続時間に相当します。拡大領域は、360°の残差信号を示しています o1p周波数パラメータを定義するために使用されるパルス。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7:NMRデータ処理。 (A)時間領域における自由誘導減衰信号。周波数領域に誤った位相(PHC0 -206°)で、パネルAからのFIDのフーリエ変換から得られる1次元プロトンスペクトル(B)。 (C)段階的(PHC0 -113°)と参照(0 ppmのTMSP信号)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図8:2D 1 H、組換え15 N-タウの15 N HSQCスペクトルは900 MHzで。 3,072及び416収集データ点は、それぞれ、スペクトル14の幅及び1 H(F2)および15 N(F1)次元で25 ppmのを使用して記録しました。 16スキャンが4時間30分の実験の期間につながる、F1の増分ごとに記録しました。スペクトルの特定の領域(高磁場1 H、低電界15 N)におけるさらなる共鳴の出現によって明らかにされたように、分解を示す(A)の良い品質のTauのサンプル(B)タウサンプル、ここでは青色で箱入り。この最後のサンプルは、プロテアーゼ阻害剤なしで調製しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
図9:2D 1 H、組換え15 N-タウの15 N HSQCスペクトル。 (A)は、タウのリン酸化されていない、600MHzのスペクトル(B)は、600メガヘルツのスペクトルと、(C)、タウをリン酸化900MHzのスペクトル、タウのリン酸化。スペクトルの特定の領域におけるさらなる共鳴は、ここでは赤で箱入り、リン酸化タウスペクトルで観察されています。 pSerおよびPTHR残基のアミド(1 H- 15 N)の相関をプロトンに対応するこれらの共鳴は、簡単に大量の外に、15 Nの1 Hおよび117〜125 ppmの8.5〜9.5 ppmの周囲の領域で可視化されています1 H、非リン酸化タウスペクトルの15 N相関。 (A及びB)600 MHzで取得したスペクトルと一致するが、14および25 ppmとスペクトル幅で2048と256のデータ点は、それぞれ、1 H(F2)および15 N(F1)次元で記録しました。32スキャンを使用し、取得の全持続時間は900 MHzで2時間44分であり、(C)であり、14および25ppmでのスペクトル幅で3,072と416のデータポイント(1 H(F2)に記録され、15 Nしました。それぞれF1)の寸法、。 48スキャンを使用し、取得の合計時間は6時間37分でした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10
図10:3D 1 H、15 N、13 C NMRスペクトル、突起及び2Dの平面を抽出しました。 2048、72、256のデータ点は、それぞれ、15 N(F2)、1 H(F3)で記録し、13 C(F1)の寸法ました。スペクトル幅は、4.7、119を中心に、14、25、および61 ppmであり、1 Hで41 ppmのそれぞれ15 Nおよび13 Cの寸法。 16スキャンを用いて取得期間は4日と6時間です。フーリエ変換に対応する(A)キューブ表現は、ERKリン酸化タウのHNCACBスペクトルの3Dデータセットは、600 MHzで得られた形質転換しました。 2D 1 H、15 N及び1 H、13 Cプレーンは、それぞれ、13 Cおよび15 Nの次元に沿って3次元データを投影することによって得られます。データ処理及び表示は、NMRの取得及び処理ソフトウェアを用いて行きました。 (B)2D 1 H、3D 1 H、15 N、121.8 ppmでの15 N化学シフトの13 C NMRデータセットから抽出された13 Cプレーン。 (右)ズームは9.38 ppmでの1 H化学シフトを中心に両方の残留物I(pThr153)の13 CAと13 CB共鳴を示し、I-1(Ala152)。 13 CB共鳴は、sの幅に起因するエイリアスされpectralウィンドウ。グラフィカルピークピッキングを、NMR分析ソフトウェアを用いて行きました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

私たちは、酵素的に修飾タウサンプルを特徴づけるためにNMR分光法を使用しています。全長ヒトタウタンパク質のためにここに記載の組換え発現および精製は、同様に変異タウまたはタウドメインを生成することができます。同位体濃縮されたタンパク質は、組換え発現を必要とする、NMR分光法のために必要とされます。リン酸化部位の同定は、共鳴の割り当てと15 N、13 C二重標識したタンパク質を必要とします。同位体のコストを考えると、良好な収率は、組換え発現工程で必要とされます。グルコースは、したがって、13 C 6 -グルコースの量は、収率を改善するために、増殖培地のリットルにつき4 gまで増加させることができるM9培地における細菌の増殖を制限する要因です。完全培地およびMEMビタミンの添加は必須ではないですが、成長を刺激し、歩留まりを改善するのに役立ちます。完全なラベルされた媒体の高コストを考えると、この製品は、唯一の成長培地として使用されているsupplemenトン。細菌の増殖は、M9培地に遅いです。一般的に、M9培地を用いて細菌培養物は、インキュベーションの約4時間後の誘導の3%完全培地到達時間を補いました。 1.6〜1.8のOD 600は、通常、培養の終わりに得られます。組換えタウタンパク質の予想収量は細菌培養1リットル当たり約15mgです。プログラマブル・インキュベーターの使用は、好都合には、一日の仕事時間中にタンパク質の産生の細菌ペレットと分析コントロールのコレクションをタンパク質生産をスケジュールすることができます。

試料濃度は、良好な品質のスペクトルを得ることが重要です。 2Dスペクトルのための十分な典型的なタウのサンプルを200μl( すなわち 100μM)タウタンパク質中1mgを含有するであろう。 3Dスペクトルのために、300μlの中に少なくとも200μMのは、必要な極低温プローブヘッドが使用されることが設けられています。より良好な信号対雑音を提供する本研究で用いた900 MHzの機器などの高磁場分析計へのアクセスそして、試料濃度の制約( 図8)を低減。タウが大きく乱れタンパク質であることを考えると、そのNMRスペクトルは、かなりの信号重複によって特徴付けられる、高磁場NMR分光計はまた、解像度の点( 図8)での最良の選択となります。それにもかかわらず、リン酸化部位に対応する共鳴は、スペクトルの異なる領域にあり、600 MHzの分光計であっても検出することが容易である( 図9 B及び9Cを比較)。また、、その不規則性のために、タウタンパク質は、タンパク質分解( 図8B)に敏感です。

バッファの滅菌は、タウの劣化を制限することをお勧めします。 NMRサンプルにプロテアーゼ阻害剤の添加は、パルスシーケンスに応じて、数時間から数日続くことができるデータ取得期間中分解に対してタウを保護するのに役立ちます。低pH(7.0以下すなわち、pHが)AVために必要とされますoidの広がりを合図につながるタンパク質のプロトンと水プロトンとの間の速すぎて交換。サンプルpHもよくスペクトルの再現性を確保するために制御されなければなりません。 pSerおよびPTHRのpKa値は、NMR分光法のための最適pHに近いので、実際のところ、リン酸化残基の化学シフトは、pHの変化に非常に敏感です。 NMR試料のpHの調整は、少量に適応のpH微小電極とpHメーターを使用して直接作製することができます。タウは、可溶性タンパク質であり、標準的な条件で凝集しません。ヘパリン硫酸、および37℃でのインキュベーションのようなポリアニオンの添加は、タウのサンプル中の凝集を開始することができます。この場合には、検出を越えて広がる対応するNMRスペクトルにおける共鳴の最も凝集体の固体の性質を与えられました。でもリン酸化タウのサンプルは、NMRデータ収集のためにここに記載された条件で集計しません。

抗体の分析と比較して、NMRはOを提供しますPTMのverallビュー。質量分析は、タンパク質試料のリン酸化パターンを識別するために使用することができます。同位体標識は、この技術のために必要ではなく、必要なサンプルの量ははるかに小さいです。しかし、このようなタウなどの複数のリン酸化とタンパク質の特性は、依然として厳しいです。隣接するリン酸化は、識別のボトムアップ戦略で同重体ペプチドを生成します。完全な識別は、サンプルのタンパク質分解によって得られたペプチドのMS / MSシーケンシングを必要とします。 NMRの利点は、技術の本質的な定量的性質に構成されています。 NMR信号の強度は、特定の部位に存在する化学基の量に結合することができます。そこで我々は、各サイトの化学修飾の割合を定義することができます。 MSアプリケーションのほとんどの最近の進歩は、しかし、タウ複数のリン酸化のMS分析は、適切な正規化25の後であっても定量的に、24実行可能であることを示しています。

ここでは、活性化されたERK2によってタウのリン酸化を提示したが、方法論は、他のキナーゼとリン酸化だけでなく6,7,26のために使用することができます- 28。 31 -キネティック実験は、タンパク質基質28に向かっキナーゼ特異性を定義するのに役立つことができ、実行することができます。リン酸化の研究は、組換えキナーゼに限定されるものではなく、細胞または組織抽出物のキナーゼ活性は、6,32,28を分析することができます。興味深い開発は、 その場で修正33,34 勉強するためにセル内 NMRの使用です。 PP2Aホスファターゼ35によってリン酸化タウの脱リン酸化を研究することによって示されたように逆に、NMRはまた、ホスファターゼ特異性に対処するためによく適合されています。 NMR分光法は、阻害化合物のウィットの存在下で、2次元スペクトル中のタンパク質基質のリン酸化プロファイルを比較することにより、キナーゼ阻害剤の特徴付けにも適用することができます時間制御実験6から発行されたスペクトル。

より高感度のMS技術に比べて、NMR分光法を使用しての関心は、むしろ一人でその分析能力によりここに記載されているプロトコルを利用するアプリケーションの広い範囲に存在します。これは、主にNMRを用いて研究された構造的または機能的修飾を有する特定のリン酸化をリンクすることができるようにリン酸化部位を同定するために重要であることが証明されました。リン酸化タウのサンプルのNMR分光法は、両方の過渡ローカルの二次構造上、変更タウ36,37のダイナミックなアンサンブルの世界的な再配置にリン酸化の構造的影響を探索することができます。機能面では、タウのリン酸化8によるタンパク質パートナー7,38,39および集約とタウの両方の相互作用の調節を含みます。 NMRによって特徴付けたリン酸化タウのサンプルは、さらにために、リン酸化依存性相互作用を解読するために使用することができ14-3-3タンパク質40、および操作されたタンパク質-タンパク質相互作用を持つ例は41,42の阻害剤。 NMRは、残留物のレベルで、及びリン酸化に対するこの相互作用の依存性の相互作用部位(複数可)の定義を可能にします。 - 45 トランスイソメラーゼPin1は、タウ規制43に関与する重要なリン酸化依存性酵素さらに、リン酸化タウのNMR分光法は、プロリンシスを特徴づける重要な方法論です。また、NMRによるリン酸化の分析は、のIDPにも球状タンパク質46にも適用することができます。最後に、アセチル22,40,41などのタウのPTMの他のタイプは、NMRによって研究することができます。ここで説明するプロトコルは、より良い生理学的および病理学的条件下でのタウの機能的および構造的調節を理解することが非常に重要であることが判明しました。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

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References

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