Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

1Laboratory of Cell and Tissue Biology, Keio University School of Medicine, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine
Published 1/04/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En Memelilerde, malleus, inkus ve stapes olmak üzere orta kulakta işitme kemikçikleri, en küçük kemiklerdir. Farelerde, bir kemik yapısı işitsel kapsül iç kulağı, yani koklea ve semisirküler kanallar kapsayan oysa işitsel bül, kemikçik evler çağırdı. Murin kemikçikler otolaringoloji alanındaki araştırmacılar büyük ilgi dolayısıyla işitme ve için gerekli olan, ancak onların metabolizma, gelişim ve evrim diğer alanlarda son derece alakalı. Değişmiş kemik metabolizması erişkin farelerde işitme fonksiyonu etkileyebilir ve çeşitli gen yoksun fareler in utero işitme kemiklerine morfogenezindeki değişiklikleri göstermek. fare işitsel kemikçikler küçük olmasına rağmen bir anatomik oryantasyon ve 3D yapısını anlar ise, kendi manipülasyon mümkündür. Burada, işitsel bül ve doğum sonrası farelerin kapsülü incelemek ve sonra bül kısmını kaldırarak bireysel kemikçik izole açıklanmıştır. Biz de tartışmak nasıl em içinfarklı yönlerde yatak bül ve kapsül malleusun, uzunlamasına yatay, ya da frontal kesitlerin hazırlanması için parafin veya dondurulmuş kesitler uygun üretmek için. Son olarak, biz fare ve insan işitme kemiklerine arasındaki anatomik farklılıklar numaralandırmak. Bu yöntemler işitsel kemiklerin, patolojik gelişim ve evrimsel açıdan ve farelerde orta kulağa analiz yararlı olacaktır.

Introduction

Orta kulak üç işitsel kemikçikleri, yani malleus, incus ve stapes, kulak iç kulak zarının ya da koklea 1,2 ses iletir bir memeli özgü işitsel zinciri oluştururlar. İşitme fonksiyonu İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) 3-6 ve Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7 kullanılarak izlenebilir kulak zarı arkasında malleusun titreşim eşikleri ölçerek farelerde değerlendirilebilir. ABR, LDV ve otoakustik emisyon (DPOAE) ölçümleri birleştirerek, iletim tipi işitme kaybı sensorinöral bozukluğu 8 ayırt edilebilir.

Kulak koşulları hayvan modelleri her yaştan hastaların refahı için işitme ve kulak sağlığı önemi göz önüne alındığında, ihtiyaç vardır. Örneğin, orta kulak iltihabı, insan bebekler ve çocuklarda ve şiddetli, akut otitis media görülen son derece yaygın bir kulak enfeksiyonu ve komplikasyonları Condi oluşabiliryon uygun antimikrobik 9 ile tedavi edilmez. Otitis media Fare modelleri patogenezini anlamak ve tedaviler 10,11 geliştirilmesinde faydalı olabilir.

(Malleusun goniale kısmı hariç) endokondral kemikleşme 12,13 oluşturduğu Murin kemikçikleri, kemik metabolizması ve morfolojilerinden çalışmaya son derece alakalı. Birincisi, kendi küçük boyutlu X-ray veya floresan mikroskobu 14 kullanılarak sağlam bir periost ile kemiklerin yüksek çözünürlüklü analiz sağlar. İkincisi, bu tür kemik hücreleri 15 arasında aşırı veya yetersiz kemik erimesinin, veya bozulmuş etkileşimleri gibi anormal kemik metabolizması, kayıp 3,4,7 işitme potansiyel katılımcı olarak analiz edilebilir. Üçüncü olarak, anormal kemik parçası morfogenez gibi Hoxa2 16-19 Msx1 20-22 Prrx1 23 Goosecoid yoksun hayvanlarda gibi çeşitli gen eksikliği olan farelerde, bildirilir(GSC) 24,25, Bapx1 13 Tshz1 26 dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog), 28, FGFR1 29 farelerde tiroid hormon reseptörleri (thrA, Thrb) 5 Bcl2 30 ve diğerleri 1,31 ya da aşırı eksprese Hoxa2 32. Son olarak, kendi küçük boyutuna rağmen, yapıları kaslar 33 ve eklem 34,35 olarak Kemikcikler ile ilişkili erişilebilir.

Fare kemikçikleri insan kemiklerinin daha küçük, ama fare orta kulak insan muadili bir minyatür sürümü değil dikkat çekicidir. İnsanlarda, oluşum safhasındaki stapedial arter gebelik sırasında kaybolur, oysa Örneğin farelerde, üzengi halkası geçer stapedial arter, yaşam 36 boyunca devam eder. Buna ek olarak, fare malleusun morfolojisi th farklıdıre insan kemik (Şekil 6). İnsanlarda, temporal kemik trabeküler kemiğin oluşan mastoid hava hücreleri bül 37 yerine kemikçik evler ise farelerde, işitsel (timpanik) bül, hava dolu orta kulak boşluğu kapatmaktadır. Her iki türde de işitsel kapsül (otik kapsül, kemik labirent) koklea ve iç kulak yarı dairesel kanallar kapsar. Orta kulak Karşılaştırmalı ve evrimsel biyoloji yoğun 38-40 gözden geçirilmiştir.

İlk Aşağıda verilen protokol sırasıyla, öncelikle orta kulak ve iç kulak oluşan işitme bül ve kapsül, teşrih açıklamaktadır. Bu protokol aynı zamanda işitsel bül gelen malleus, incus ve stapes izole etmek için nasıl gösterir. Son olarak, işitsel kemiklerin doku kesit için hazırlık gömmek için işitsel bül ve kapsül yönlendirmek için nasıl gösterir.

Protocol

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Keio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (IACUC - onay numarası: 09221) ve araştırma hayvanların kullanımı için Keio Üniversitesi'nde Hayvan Deneyleri üzerinde Kurumsal Yönergeleri izleyin. İnsan örnekler Anatomi, Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Anabilim bağışlanan bir kadavradan izole edilmiştir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak kullanılmıştır.

İşitsel Bulla ve Kapsül 1. İzolasyonu

  1. Solunum havalandırma min fazla bitene kadar izofluran veya sevofluran batırılmış kağıt havlu üzerinde bir platform içeren bir kavanoza fareler Euthanize ve sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin. batırılmış kağıt havlu ile farelerin doğrudan temas önlemek için dikkatli olun.
  2. boyun sırt tarafında küçük bir enine bir kesi yapmak ve kafasına doğru ayrı cilt çekin ve iki elinizi kullanarak kuyruk altında yatan boyun mu maruzSistemik lupus dokusu.
  3. 14 cm keskin cerrahi makas kullanarak Servikal bölgede fareler başını kesmek.
  4. tamamen burnuna doğru soyma cilt. burnu ve kesici diş ile birlikte tüm cilt kesti.
  5. ağzına makas yerleştirin ve her iki tarafta masseter kasları kesti.
  6. dikkatle çene açın ve birlikte dil ve alt çene çıkarın.
  7. Midsagital düzlemde (Şekil 1A, B) boyunca ikiye keskin bir makas, split kafatası ve kafa tabanı kullanma.
  8. forseps kullanarak, serebral ve serebellar hemisferlerin ve beyin sapı çıkarın. işitsel bül ve kapsül beyincik ve beyin sapı lateral yer almaktadır. İşitsel bül işitsel kapsül (Şekil 1C, D) daha fazla yanal olarak olduğuna dikkat edin.
  9. Çevreleyen kafatası kemiği (Şekil 1E) ile bül ve kapsül parçalara ayır.
  10. Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ihtiva eden bir çanak için numune aktarın.
  11. Ubinoküler diseksiyon mikroskobu nder, bül ve kapsül (Şekil 1F) etrafında gevşetilmiş sınır kesmek için çevredeki kemikleri ve makas ayrı çekmek için forseps kullanabilir. kaldırıldı çevreleyen kemikler basioccipital (ventral sınır), exoccipital (ventro-posterior sınır), supraoccipital (arka kenar), interparietal, paryetal (dorsal sınır), skuamöz (dorso-anterior sınır), alisphenoid (anterior sınır) ve basisphenoid vardır (antero-ventral sınır) kemikleri. Östaki tüpünün 41 timpanik açılmasını destekler styliform süreci (Sp), temporal kemik stiloid farklı olduğunu unutmayın.

Malleus, örs ve stapes: işitme kemiklerine 2. izolasyonu

  1. çekiç kemiği
    1. Kulak zarı görülebilecek şekilde küçük bir makas ve forseps hem kullanarak, (Şekil 2A, B sulkus tympanicus dış kulak yolu yanal parçası kaldırmak).
    2. Ventral (noktalı) ve posterior (#) duvarları (Şekil 2C) malleal processus brevis (yuvarlak apofizlidir, Tartışma), hem de yakın kulak zarı ve kulak kemiğinin bir kısmını çıkarın. Malleus ve tensör timpani kas şimdi (Şekil 2B, E) açık olmalıdır.
    3. Malleus ile stapes tabanı (Şekil 2F) kaldırın ve bir 27 G iğne (Şekil 2G) eğimli kenarı tensör timpani kas kesti. diğer memelilerde görüldüğü gibi malleal manubrium sıkıca timpanik membrana takılan unutmayın.
    4. kırılgan manubrium, dikkatlice kulak zarına ayırın. Üç işitsel kemikçik ortaya çıkarmak için timpanik kemik çıkarın.
    5. Kemikçik eklem (Şekil 2H) de inkus gelen malleus ile stapes tabanı yerinden.
    6. goniale anterior süreci çatlatma ile malleus ile stapes tabanı izole edin.
  2. Incus ve Stapes
    1. t yalıtmakKısa crus (Şekil 3A) inkus posterior ligament keserek o incus.
    2. 27 G iğne (Şekil 3B, C) kesik kenarı stapes yakın stapes arter keserek stapes izole edin. Gerekirse, iğne ile stapes kas sürecinde stapes kasının tendonu kesti.
    3. stapesin obturator foramen içine dikiş iğnesine (veya işaretleme pimi) takın ve stapes yukarı kaldırın. Stapes uzaklaştırıldıktan sonra, oval pencere açıklığı açıkça görülebilir (Şekil 3D) olmalıdır.

İşitsel Bulla ve Kapsül 3. gömülmesi

  1. Parafine gömme için hazırlık
    1. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin.
    2. Makasla rahatsız bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) bül ve kapsül batırmakC ve fiksatif bül içine girmesine izin verir. Hava bulla hapsolur ise, bir iğne ve şırınga ile çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın.
      Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınmalıdır.
    3. Bir kez PBS ile yıkayın.
    4. % 10 etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat 4 ° C'de bir hafta kirecini bül ve kapsül (EDTA 2Na), 2 ml bir tüp içinde 100 mM Tris baz, pH 7.0. Her gün tampon değiştirin.
    5. Bir kez PBS ile yıkayın. Numuneler 4 ° C'de su içinde% 70 etanol içinde saklanır. İsteğe bağlı olarak, kademeli alkol serisi (% 30,% 50, su içinde% 70) ile,% 70 etanol aktarın.
    6. Doku işlemcide (4x 40 ° C'de her biri 1 saat), ksilen içinde açık bir etanol çözeltileri kademeli bir seri örnekleri (% 70, 2 x% 95, 3 x% 100 her biri 1 H), kurutma, ile numune sızmaya erimiş parafin mumu 42. İsteğe bağlı olarak, ticari doku clearin ile yerine ksileng çözelti (örneğin, Histo-Temizle).
    7. işlemci örnekleri boşaltın ve onların kasetleri çıkarın.
    8. Bir doku gömme konsol sisteminde, bir yerde erimiş parafin mumu ile dolu kalıplar içine numune. (Bölüm 4) gömme geçin.
  2. (Kawamoto film yöntemiyle) dondurulmuş blokların gömme için hazırlık 43
    1. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin.
    2. makası ile bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C 'de (antijenikliği korumak için% 2 ya da% 1 PFA yerine PBS içinde% 4) sabitleştirici bül ve kapsül bırakın. Hava bulla kaldıysa, bir iğne ve şırınga kullanılarak çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın.
    3. PBS hızla bül ve kapsül yıkayın ve hemen 4 ° C'de sıvı cryo-gömme bileşik batırın.
    4. Önemli: hava kabarcıklarını çıkarın eğer ortada herhangi birve bir iğne ile, ve forseps ile gömme bileşiğin eklenmesi ile aspirasyon yoluyla dış kulak. (Bölüm 4) gömme geçin.

4. Numune Oryantasyon ve katıştırma

Not: Bütün bül ve kapsül arzu edilen bölümleri kesmek için gömme boyunca belirli bir yönde düzenlenmiş olması gerekir. aşağıda belirtilen prosedürler bölümüne, çeşitli yönlerde malleus ile stapes tabanı kullanılmaktadır.

  1. Malleusun Boyuna (Parasagital) kesit
    1. Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) aşağı bül veya dış kulak yolu lateral tarafını koyun. Malleusun boyun ve enine lamina gömme çanak (- C Şekil 4A) yatay altına paralel olacak şekilde yönlendirmeyi ayarlayın. Timpanik membran fare kafasının (Şekil 4A'da dikey yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile eğimli dikkat edin; Şekil 59 Kampen
  2. Malleusun Yatay kesit
    1. Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) yatay dorsal tepe yerleştirin. Malleusun boyun ve enine lamina gömme kabı (- F Şekil 4D) tabanına dik olacak şekilde bül ve kapsülün yönünü ayarlar.
  3. Manubrium ve kulak zarı 5 frontal kesit (kesitler)
    1. Bu gömme tabağın tabanına dik olacak şekilde sıcak bir parafin (veya kriyo-gömme bileşim) 'de malleal manubrium yerleştirin.
  4. Bir doku gömme konsol sistemi üzerinde parafin sertleşmesine uygun sıcaklıklara blok soğumasını (alternatif, kuru buz / hekzan banyosunda cryo gömme bileşik kullanın).
  5. Süreç doku blok ve rutin prosedürler kullanılarak kesilmiş bölümleri. hematoksilen ve eozin (H & # ile örneğin, leke parafin kesitleri38 E), safranin O (kıkırdak için) veya osteoklastlar için tartarata dirençli asit fosfataz (TRAP) aktivitesi () 3 veya imünohistokimya ile. Undekalsifiye cryosections kemik fluorochromes 14 kullanılarak etiketleme, kalsiyum alizarin kırmızısı boyama ve immünofloresans 42 için uygundur.

Representative Results

Bu protokol, fare işitsel bül gelen kemikçik izole etmek için bir yöntem sunar. İlk olarak, bül ve kapsül kafatası (Şekil 1) tek bir parça olarak kesilir. Parçalara bül sonra malleus ile stapes tabanı (Şekil 2) ve örs ve üzengi (Şekil 3) hazırlamak için kullanılır. Işitsel bül ve kapsülün Merkezi bül, dorsal sorguç, ön semisirküler kanal ve subarcuate fossa (Şekil 1F) ön ucunda styliform süreçtir. Microcomputed tomografi (BT) görüntüleme işitsel bül kemikçiklerdeki yanı sıra bu kemiklerin uzunlamasına ve yatay bir kesit (Şekil 4) için en uygun oryantasyon ortaya koymaktadır.

malleusun uzunlamasına parafın kesit için, bül ve kapsül pa gömülü bir hafta boyunca 4 ° C'de EDTA içinde dekalsifiye edildiŞekil 4 A'da gösterilen yönde de raffin blok - C, 4 um kesitler ve daha sonra H & E ile boyandı. Işitsel bül de kulak zarı bağlı malleus P14 (Şekil 5A) devam eden endokondral ossifikasyon saptandı. yeni kemik oluşumunu görselleştirmek için, kalsein (30 mg / g vücut ağırlığı), periton bir P20 fareye enjekte edildi ve bül ve kapsül P21, 24 saat sonra izole edilmiştir. Yumuşatma olmaksızın örnek dondurulup yerleştirilebilir ve Kawamoto 43 yöntemine göre bir yapışkan film kullanılarak 6 uM'de cryosectioned edildi. DAPI ile nükleer boyama (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) sonra bu bölüm flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlendi. Kalsein sinyalleri (yeşil) Malleus (m) 'de, yeni kemik oluşumunu, bül ve kapsül (Şekil 5B) gösterdi. malleusun yatay kesit için, 5 haftalık bir fare izole işitsel bül için (yumuşatma olmadan donmuş gömülüoryantasyon Şekil 4D bkz - Kawamoto yöntemi kullanılarak 6 mikron olarak cryosectioned F) ve H & E ile boyandı. Malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit, aynı zamanda koklea (Şekil 5C) göstermektedir.

Bir P31 fare izole sağ işitme kemiklerine bir medial görünüm fare malleusun tipik özelliklerini gösterir, yani "kayma-martı kanat benzeri" (ya da Farsça kılıç gibi 45) manubrium, önemli bir processus brevis (yuvarlak apofiz ,) (Şekil 6) Tartışma görebilir ve enine lamina. Ön işlem (prosesus anterior) goniale yaklaşık diseksiyon işlemi kırıldığı ve (ectotympanic) timpanik halkasından ayrılabilir dikkat etmek gerekir. incudostapedial eklem yerinden oysa bu temsili numune, malleus ve inkus arasında sağlam bir incudomalleolar eklemi sergiler. malleal içine tendon girmeler vestapedial kas işlemler tespit (Şekil 6A, yıldızlar) vardır.

Şekil 6B, aynı büyütmede, fare ve insan işitme kemiklerine karşılaştırır. boyut dışındaki türlerden farklılıklar, aşağıdakileri içerir. malleal manubrium kanat benzeri farelerde ancak insanlarda kulüp gibi. anatomik ekseni (ya da dönme ekseni, malleusun inkus ve kısa bir süreç ön işleminde çizgi) ve manubrium arasındaki açı farelerde çok küçük ve hemen hemen dik olan karşıt iki hemen hemen paralel olan insanlarda 6,46-48 yılında. İnsan Kemikcikler olarak, vibrometric çalışmalar incudo-malleoler ortak işlevsel 49 sabit ziyade hareketli olduğunu ortaya koymaktadır. Fare Malleus insanlarda 47 belirgin olmayan bir geniş, ince ve düz enine lamina sergiler. Farelerde, prosesus ön zar kemik, yani goniale ve tympani üzere kaynaşırC halkasının, insanlarda prosesus ön kemik 41 küçük bir spicule düşürülür ise. Fare ve insan üzengi da farklıdır: farelerde, ön crus kavislidir ve arka crus daha düz ise, insanlarda olduğu, ön crus düz arka crus daha fazladır. Bu vücut büyüklüğüne malleus baş göreli kitlesel "küçük" kemiklerin 48 allometrik ilişkilerinde önemli değişkenlik gösteren, örneğin altın köstebek gibi türler büyütülür dikkati çekiyor.

Şekil 1
Şekil İşitsel Bulla ve Kapsül 1. Diseksiyon. Bir P31 fare kafatası (A) sağ ve sol yarısı ayrılmıştır. A, ön; P, arka; L, sol; R, doğru. (B) ikiye, derili başının sağ yarısında medial yüzeyi. Cx, serebral korteks; Cb, beyincik; İşletmeleri, brainstem. D, dorsal; V, ventral. Forseps ile beyin (C) Sökme. (D) sağ kafatasında işitsel kapsül medial görünümü. dorsal tepe (ok başları), orta kranial fossa (MCF) ve posterior fossa (pcf) arasında uzanan ve dorso-anterior ve işitsel kapsülün ventro-arka yüzeyleri ayırır. Ölçek çubuğu, 2 mm. (E), işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) Yüksek büyütme. Co, koklea; VII, yüz siniri; VIII, sinir vestibülokohlear; AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; serebellar paraflokkulusun evler sf, subarcuate fossa. Ölçek çubuğu, 1 mm. İzole işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) (F) Mikrografik. Sp, styliform süreci. Ölçek çubuğu, 1 mm. (A - E), P31 fare. (F), P33 fare. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Malleusun 2. Diseksiyon Şekil. (A) sağ işitsel bül ve kapsülün ventrolateral görünümü. sulkus tympanicus (ST, kesik ok) kulak zarı eki sitesidir. ST kemik yanal dış kulak parçası ve ST kemik medial orta kulak boşluğunun tabanını oluşturur. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Dış kulak yolu çıkarıldıktan sonra (B) Görünüm pars flaccida (Pf) ve tensa pars (Pt) dahil timpanik membran (TM) ortaya çıkarmak için. Timpanik kemik malleal prosesus brevis (MPB) yakınındaki (noktalı çizgiler ve #) parçaları (C) çıkarılması. m, malleus; mM malleal manubrium. kulak zarından görülen orta kulak boşluğunda, hava kabarcığı ok. (D) Exposed malleus. Malleus kafa gösterilir. Noktalıhat inkus eklem yüzeyini gösterir. Tensör timpani kasının (E) tendon (TT) malleusun bağlı. Malleus kaldırıldığında (F) tensör tympani çekilir. * Kas süreç. (G) tensör timpaninin iğne kullanılarak kesilir. Üç işitsel kemikçikler kulak zarı çıkarıldıktan sonra (H). incudo-malleoler eklem yerinden edilir. m, malleus; i incus; s, stapes; , Goniale (çekiç kemiği ve timpanik halka, TR kaynaştırılmış) gidin. Tüm ölçek barlar, 0.5 mm. (A, lH), P33 fare. (B - G), P31 fare. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil inkus ve stapes 3. Diseksiyon. (A) incus vemalleusun çıkarılmasından sonra üzengi. stapedial arterin (SA) üzengi (ler) geçer. Noktalı çizgi inkus eklem yüzeyini gösterir. kısa bacak inkus (i) (ICB, crus breve) posterior ligaman sabit unutmayın (gösterilmemiştir). Asterisk, stapes kas süreci. (B) inkus çıkarılmasından sonra Stapes. İğne ucu stapedial arter (SA) kesmek için kullanılır. Kan akış yönünü ok. Noktalı çizgi stapesin eklem yüzeyini gösterir. (C) stapedial arter üzengi kaldırılır. X stapes arter (SA) kesik ucunu gösterir. (D) oval pencere (Ah, fenestra ovalis veya fenestra Vestibül) stapes çıkarılmasından sonra görülebilir. Rw, yuvarlak pencere (fenestra rotunda veya fenestra cochleae). Ölçek çubukları, 0.5 mm. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakam.

Şekil 4,
(- C parasagital, A) ve Yatay (D - E) malleusun Kesit Boyuna için gömülmesi sırasında İşitsel bül ve Kapsül yönlendirme Şekil 4.. (A - C) malleusun boyun ve enine lamina çanak gömme tabanına paralel yerleştirilir. (A) Yandan görünüm: Mikro BT görüntüsünde (mavi yalancı) bül sağ malleusun katıştırma göstermek için. Malleus ve inkus yeşil yalancı edilir. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. m, malleus; ok uçları, sırt sorguç. M, medial; L, yan; D, dorsal; V, ventral. (B) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. bül (styliform işlemi) ön ucu uzaklaştırılmıştır unutmayın. i incus. (C) Üstten görünüm: a çekilmiş mikroskobu (renk filtresi). AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform süreci. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. (D - F) malleusun processus brevis çanak gömme dibine dik yerleştirilir. (D) Yandan görünüm: Mikro-BT görüntüsünde sağ malleusun katıştırma göstermek için. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. (E) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. mM malleal manubrium. (F) Üstten görünüm: (a renk filtresiyle çekilmiş) mikrografı. Ölçek çubukları, 1mM. Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikro-BT görüntüleri, 5 um bir voksel çözünürlükte elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
FŞEKIL 5. Histoloji. (A) H & E boyama. P14 işitsel bül (noktalı çizgi), parafine gömülü sağ malleus (m) Boyuna (Parasagital) bölümü. TM, kulak zarı. (B) Calcein kemik etiketleme. P21 işitsel bül dondurulmuş, undekalsifiye sol malleus (m) Boyuna kesit. Counterstain, DAPI. (C) 'H & E boyama. İşitsel bül ve kapsülün (5 haftalık fare) dondurulmuş, kalan undekalsifiye malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit. Co, koklea. Ölçek çubukları, 1mM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. işitme kemiklerine medial görünümü. (A), P sağ işitme kemiklerine31 fare. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Ölçek çubuğu, 1 mm. Malleus kafası (Caput mallei, capitulum mallei); Boyun (Collum mallei); lamina (enine lamina); mM (Ağız sapı mallei); siyah yıldız (malleusun kas süreci); MPA (prosessus anterior, prosessus gracilis); MPB (processus brevis); örs gövdesi (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kısa crus, kısa bir süreç); ICL (Crus longum, uzun crus, uzun bir süreç); IPL (prosessus lenticularis, lentiküler işlem olup, Silviyan apofizi); stapes başı (Caput stapedis); beyaz yıldız (stapes kas süreci); ScA (Crus anterius, ön bacak); SCP (Crus posterius, arka bacak); Baz (Baz stapedis, kürek); Sof (obturator foramen, intercrural foramen). (B) 76 yaşındaki insan kadın sağ işitsel kemikçikler (Anatomi Anabilim Tıp, Keio Üniversitesi izniyle). insan Kemikcikler için kullanıldığı gibi P31 fare kemikçikleri (sağ alt) aynı büyütmede görüntülenmiş. CurvEd oklar anatomik ekseni ile manubrium (noktalı çizgiler) arasındaki açı gösterir. Ölçek çubuğu, 2 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada, doğum sonrası farelerde işitsel bül ve kapsül izole etmek için kullanışlı bir yöntem mevcut. P12 önce, dokular kırılgan ve izolasyonu sırasında zarar görebilir. P12 sonra, işitsel bül ve kapsül kolay çevre dokulardan izole edilebilir. kesit önce kafa bül Kesme pek çok avantajı vardır. İlk olarak, doğum sonrası kavitasyon ve işitsel bül büyüme en aktif itibaren P6 meydana gelir ve P14 50 tarafından tamamlandı. kulak zarı ve koklear duvar arasındaki mezenkimal doku kavitasyon sürecinde hava ile değiştirilir. orta kulak boşluğunda bileşke hava fiksasyon, yumuşatma ve gömme sırasında doku ve sıvılar arasındaki teması engelleyebilir. Ön uç (styliform sürecini) keserek yerine unisolated bül bunu yapmak çalışarak izole işitsel bül havayı çıkarmak için daha kolaydır. İkinci olarak, malleus (ve kulak zarı) yönünü dikey değilKafada. Bu, belirli bir yönde izole işitsel bül ve kapsül gömerek istenilen düzlemde malleus ile stapes tabanı bölümünde bu nedenle kolaydır.

izole sonra, işitsel bül ve kapsüller çeşitli analizler için de yararlıdır. Örneğin, yüksek çözünürlüklü X-ışını mikro-BT gibi malleus 14 osteojenik kılcal damarlar gibi kemik mikro morfoloji ortaya çıkarabilir. Stereofluorescence diseksiyon mikroskobu, orta veya iç kulak 33 floresan proteinleri ifade muhabiri fareler değerlendirmede yapıları görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Buna ek olarak, in vivo veya ex vivo olarak floresans etiketleme yöntemleri ve bütün montaj immünofloresan algılama çeşitli üstlenilebilir. Işık levha floresan mikroskobu da üç boyutlu analiz 51 için yararlıdır. Burada açıklanmamış olmasına rağmen, çeşitli anatomik yapıları, periferal sinirler, kan damarları gibi işitsel bül ve kapsül ile bağlantılı veOrta kulaktaki kulak zarı da bu protokolü kullanarak değerlendirilebilir.

O parafin kesit mineralizasyon analizini izin vermez, bu nedenle gömmeden önce kemik dokularının dekalsifikasyon gerektirir ve unutmayın. Buna karşılık, dondurulmuş kesitler hazırlamak için kullanılan Kawamoto filmi yöntemi 43 yumuşatma gerçekleştirilir, örneğin Alizarin boyama gibi in vivo kemik etiketleme teknikleri ya da özel boyama kullanılarak mineralizasyon çalışmalar için uygun olan edilebilir. Kriyo-ayırma koşulları, fare yaşına göre göre optimize edilmelidir. Örneğin, kriyostat odası içinde bir daha soğuk ısı bölümlerine hasarı en aza indirmek için daha büyük bir fare numuneler için tavsiye edilir.

Fare, malleusun önde gelen yarı küresel çıkıntı için doğru terim "orbicular apophysis" dir. Bununla birlikte, "prosesus brevis" çok fazla th yuvarlak apofize belirtmek için kullanılmaktadırÖzellikle fare gelişimsel biyologlar 16,20,22-25 arasında bir iki yıl. "Prosessus brevis" aslen orbicular apofizlidir farklı yanal süreç (processus lateralis), atıfta bulundu. İnsanlarda, hafif konik bir çıkıntı benzeyen bir yanal işlemi (şekil 6B, dış görünüşü görülmektedir) manubrium uzanan kulak zarı bağlanma genel hat oluşturur. Farelerde, yan işlemi, umbo 48 karşı ucunda manubrium bir tahmindir. Kulak zarının pars flaccida malleusun yanal süreç üzerindedir. Yuvarlak apofizi insan malleusun belirgin değildir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
  2. Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
  3. Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
  4. Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
  5. Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
  6. Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
  7. Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
  8. Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. (2009).
  9. Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
  10. Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
  11. Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
  12. Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
  13. Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
  14. Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
  15. Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
  16. Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
  17. Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
  18. O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
  19. Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
  20. Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
  21. Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
  22. Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
  23. Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
  24. Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  25. Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  26. Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
  27. Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
  28. Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
  29. Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
  30. Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
  31. Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
  32. Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
  33. Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
  34. Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
  35. Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
  36. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
  37. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
  38. Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
  39. Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
  40. Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
  41. Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
  42. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. Humana Press. (2003).
  43. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  44. Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
  45. Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
  46. Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
  47. Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
  48. Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
  49. Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
  50. Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
  51. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats