Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Çeviri kontrol özellikle hücresel stres 1 dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m 7 GTP) mRNA 2 5 'kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S 3 ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 'UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu 5-8 haline gelmiştir.

Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri 9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP 11 için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G 12 ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese 6,13 sırasında 3 'UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F H 6,13 teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 14 ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m 7 GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem 15 çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri 16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar 6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana 20 gibi, S. Pombe 21, D 22 melanogaster ve C 23 elegans.

Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi 24 dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki 25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde 26% 3-12, bağırsak 27,% 4 in 3,5-6% karaciğer 28, böbrek 29% 7-12, kas 30 içinde% 4 ve kemik iliği 31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen 32 daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F H 24 maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim 33 sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia 34 daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür.

Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) 35 hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m 7 GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hücre Kültürü 1. Hazırlıklar

  1. insan hücrelerinin ticari olarak temin stoklarının al.
    NOT: Bu protokol, HCT116 kolon karsinomu ve birincil insan renal proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (HRPTEC) kullanır.
  2. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 7.5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş / yüksek glukoz ortamı: HCT116 kültürü için 500 mi tanesidir.
  3. % 5 FBS,% 1 epitel hücre büyüme takviyesi ile takviye Epitelyal hücre ortamı, ve% 1 P / S: 500 mi HRPTEC kültürü için tanesidir.
  4. 140 mM NaCI, 3 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4: 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 500 ml hazırlayın. 7.4 pH ayarlamak ve 121 ° C'de 40 dakika süre ile otoklavlama sureti ile sterilize.

Hücre kültürü 2. Başlatma

  1. Dikkatle t bozmadan% 80-90 konfluent çanak orta aspireO hücreleri.
  2. kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın.
  3. 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yıkanır ve hafifçe eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelere kaya kısım. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 90 sn için 4000 xg, 15 ml'lik bir santrifüj tüpü ve santrifüje müstakil hücreleri aktarın.
  5. tam DMEM 1 ml tekrar süspansiyon hücre pelet.
  6. bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Cm2 başına yaklaşık 2,500-5,000 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu elde etmek için gereken kaç pirojenik olmayan ve polistiren 100 mm'lik bir hücre kültür kaplarına hesaplayın.
  7. adım 30-45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1.2 veya 1.3 yapılan ön sıcak tam hücre kültürü ortamı.
  8. % 70 etanol ile orta şişe ve hücre şişesini dekontamine. ileriye bu noktadan itibarenişlemler aseptik olarak yapılmalıdır.
  9. Kısım adım 2.6 belirtilen tohum ekme yoğunluğu olan dondurulmuş hücre, tüm birimi kullanmak, çok 100 mm hücre kültür kaplarına tam DMEM 6 mi.
  10. 100 mm kültür çanakları her adım 2.6 hesaplanan hücre süspansiyonu hacmi aktarın. eşit plaka yüzeyi üzerinde hücreleri dağıtmak için elle her plakayı sallayın.
  11. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübatörde tohumlanmış 100 mm hücre kültür çanağı yerleştirin. Hücreler sonraki adımlarda önce en az 24 saat inkübe izin verin.

3. besi yerinden

  1. Hücre konfluent yüzdesini (çanak alanı kapsayan% hücreleri) belirlemek için bir mikroskop altında her bir hücre kültür çanağı gör. kuvöz ve öncesi sıcak tam orta ve 1x PBS hücreleri dönün. Hücreler% 80-100 konfluent iseniz bir sonraki adıma geçin.
  2. Dikkatlice bozmadan harcanan orta aspireHer bir kültür kabı hücreler.
  3. kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın.
  4. Kısım 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin-EDTA ve yavaşça kaya eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelerine temin etmektedir. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Bu kuluçka sırasında, kısım kadar kültür tabaklarında tam ortam, 10 ml cm2 başına 2,500-5,000 hücre hücre yoğunluğu elde etmek için gereklidir.
  6. Hücreler plakasından ayrılmış olduğunda, hızlı bir şekilde 1 x tanımlanan tripsin inhibitörü 3 ml ilave edilir ve yavaşça tripsin-EDTA tüm nötralize edilmiş olmasını sağlamak için 1 dakika için çanak girdap.
  7. steril bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne ayrılmış hücreleri aktarın ve kenara. Kalan hücreler bir araya ve aynı 15 mi santrifüj borusuna bu transfer çanak PBS 1X 3 ml ekleyin.
  8. 150 xg santrifüj edilerek pelet hücreleri5 dakika karıştırıldı.
  9. Süpernatant aspire ve tam ortam 3 ml hücre pelletini.
  10. Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı ve cm2 başına 2,500-5,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek için tam ortam 15 ml ihtiva eden 150 mm kültür kaplarına tohum. Her bir kap-bağlanma tahlili için iki 150 mm kullanın.
    Not: sıvı ortam ile hücrelere oksijen difüzyon Cilt 36 bağlıdır. Süspansiyon içindeki yapışan hücreler veya hücre kullanılıp kullanılmadığını deneyler arasında tutarlı medya hacmini tutulması tavsiye edilir. Medya yayılmasında bu değişkenliğe önlemek için (Tartışma tartışıldığı gibi 24 saat iş istasyonu inkübe) önceden klimalı edilebilir.
  11. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübatör tohumlanmış kültür yemekler yerleştirin. Hücreler sonraki adımlara geçmeden önce en az 24 saat inkübe izin verin.

4. Physioxic Pozlama

  1. mikroskop altında hücre gör. bes içint sonuçları, hücreler 24 saat pozlama için% 70-80 konfluent, 48 saat pozlama için% 50-60 konfluent ve 72 saat pozlama için% 40-50 konfluent olduğundan emin olun.
  2. İstenen süre (24, 48, ya da deneye bağlı olarak 72 saat) hipoksiyaya iş istasyonuna hücreleri yerleştirin.
  3. Uygun physioxia için iş istasyonu ayarlayın.
    NOT: Örneğin,% 3 O 2 ayar% 5 CO 2 ve% 92 N2 eşlik ediyorum.
    NOT: Dinamik aralık içinde oksijen dalgalanmaları aracı haline belirli bir zaman çizelgesi, program takvimi üzerinde istenen veya manuel olarak istenen aralıklarla oksijen ayarlarını varsa.
  4. % 60 nem ayarlayın. iş istasyonu atmosfer yine de çok kuru ve medya belirgin uzun deneyler (> 48 saat) boyunca buharlaşır. (Ortam iş istasyonu bir atmosfer ile dengelenir böylece) hücre kültürü DIS ortamı doldurmak için iş istasyonu olan bir hücre kültür şişesi içinde ortam rezervini muhafazahes.
    Not: çözünmüş oksijen, atmosferik oksijen 36 dengelenir, böylece (örneğin, PBS ve tripsin-EDTA gibi) liziz önce hücreler ile etkileşim herhangi bir çözüm hipoksi iş istasyonu olan, kullanımdan önce, 24 saat için önceden şartlandınlmalıdır.
  5. lizis kadar iş istasyonu içinde hücreler tutun.

Cap-bağlama deneyi 5. hazırlanması Tamponlar

  1. 1x Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) hazırlayın.
    1. DH 2 O 800 ml, 8.76 g, NaCl ve 6.05 g Tris baz çözülür.
    2. 1 M HCI kullanılarak 7.4'luk bir nihai pH'a çözüm sağlamaktadır.
    3. DH 2 O. kullanarak 1 L son hacim kazandırın
  2. denatüre lizis tamponu hazırlayın. Cap-bağlama analizinin yapılacağı güne liziz tamponunda hazırlanır. Boş agaroz boncuk ve γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk (7,9 ve 7.13 adımlar) yıkamak için ekstra lizis tamponu yapın.
    1. DH 2 O 7 ml, 160 ul 5 M NAC eklemeL, 160 ul 1 M Tris-HCI pH 7.4, 40 ul 200 mM NaF, 40 ul 1 M MgCl2, 40 ul 1 mM sodyum ortovanadat.
    2. 7 mi çözeltisine Igepal 40 ul ekle. son derece viskoz olduğu gibi Igepal ™ almak yardımcı olmak için pipet ucu kesin.
    3. Igepal tüm çözünmüş kadar, aşağı yukarı pipetleme veya vorteks 7 ml solüsyon karıştırın.
    4. 8 ml çözeltinin son hacmi kaldırın ve buz üzerinde tutun.
  3. 4x sodyum dodesil sülfat (SDS) -PAGE Örnek Tamponu hazırlayın.
    1. Bir cam kaba, 16 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 12.64 ml gliserol, ve 8 ml ditiotreitol (DTT) birleştirir.
    2. SDS 3.2 g ve bromofenol mavisi, 0.16 g ekleyin. Toz tamamen manyetik karıştırıcı ile karıştırılarak erimesine izin verir.
    3. -20 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kısım ve mağaza.

6. Hücre Liziz

  1. denatüre edici olmayan lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde th günlük tutmakE Cap-bağlanma tahlili.
  2. 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1 x PBS öncesi sıcak ve tripsin.
  3. Her bir kap-bağlanma tahlili için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu kısım 980 ul yapılmaktadır.
  4. liziz tamponu 980 ul 4- (2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorür 10 ul ve 100x proteaz önleyici kokteyl 10 ul ekle. buz üzerinde tutun.
  5. hipoksi iş istasyonu içinde bir çöp konteynırına her 150 mm çanak medya atın.
  6. Sıcak 1x PBS 3-4 ml hücreleri yıkayın ve tüm sıvı atın.
  7. Her bir tabak sıcak% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml ilave edilir ve 2 dakika boyunca ya da hücreleri artık plakaya tutunur kadar bekletin.
  8. Bir pipet kullanarak, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir plaka hücreleri transferi. hücrelerin her plaka ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır, böylece gerektiğinde tekrar edin.
  9. 90 saniye t 6,000 xg'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri santrifüjO pelet hücreleri.
  10. pelet bozmadan pipet kullanarak tripsin aspire. pelet 90 saniye boyunca 6.000 xg, yeniden santrifüj 1,5 ml'lik ependorf tüp rahatsız edilirse.
  11. nazikçe sadece pelet yukarıda tüpe PBS 200 ul pipetleme sıcak 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden santrifüj pelet rahatsız olup olmadığını.
  12. pelet bozmadan PBS aspire.
  13. 1 ml Pipet 500 ul birinci hücresel pelet üzerine liziz tampon çözeltisi hazırlandı. Yukarı ve aşağı pipetleme tamamen pelletini.
  14. İkinci hücre pelet ile yeniden süspanse hücreleri birleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleme ikinci pelletini. Tüm topaklar birleştirildi ve her bir örnek için yeniden süspanse edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
  15. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde liziz tamponunda kalan 500 ul lizat birleştirin.
  16. hipoksi iş istasyonundan örnekleri çıkarın.
    Not: liziz tamponu ilave edildikten sonra, birII Daha sonraki aşamalar, hipoksi, iş istasyonu, 37 ° C olarak ayarlanmış ve aşağıdaki adımlar soğuk (4 ° C veya buz üzerinde) gerçekleştirilir edilecek olduğu gibi çevre havası ifa edilecek olan vardır.
  17. Lyse 1.5-2 saat boyunca 4 ° C'de örnekleri çevirerek nazik ajitasyon kullanılarak hücreler.
  18. selüler artığın ayrılması için 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de lize hücreleri santrifüjleyin.
  19. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp lizat aktarın ve pelet atın.
  20. Süpernatantın bir kısmı (% 5-10), gelecekte Western blot analizi için bir bütün hücre lizatı giriş kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın.

7. Cap-bağlanma deneyi

  1. Her numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ayırmak için boş agaroz boncuk kontrol bulamacın 50 ul ve γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlanmış boncuk çamuru 50 ul transfer. boncuk bulamaç toplanmasını kolaylaştırmak için pipet ucu çıkarmak için makas kullanın.
  2. boncuk b peletY 30 sn boyunca 500 xg'de bulamaç santrifüj.
  3. dikkatlice Süpernatantı ve TBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon.
  4. Tekrarlayın 7.2 ve 7.3 adımları tekrarlayın. 30 saniye boyunca 500 xg'de boncuk Pelet ve süpernatant kaldırmak.
  5. Boş agaroz boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp adım 6.19 lizat içeren süpernatant aktarın.
    NOT: Boş agaroz boncuklar non-spesifik boncuk ile etkileşime lizat proteinleri kaldırmak için bir ön temizleme adımı olarak hareket ederler.
  6. yavaşça sallanarak 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
  7. 30 saniye boyunca 500 xg'de santrifüj edilerek boş agaroz boncuk pelet.
  8. Γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne lizat aktarın.
  9. Liziz tamponu 500 ul boncuk yeniden süspanse 30 sn boyunca 500 xg'de santrifüjleme ile boncuk tane haline ve Superna ayıklayarak boş agaroz boncuk yıkayıntant. Beş yıkar toplam bu dört kez tekrarlayın.
  10. 1x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde boş bir agaroz boncuklar tekrar süspansiyon ve 95 ° C'de 90 sn için boncuk kaynatın. gelecekteki Western blot analizi için -20 ° C'de saklayın ilgili protein boncuk olmayan spesifik olarak bağlanan bakmaktır.
  11. Cap bağlayıcı proteinler yakalamak için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar ile lizat inkübe edin.
  12. 30 saniye için 500 x g'de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. süpernatant atın.
  13. Adım 7.9 yineleyerek γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk yıkayın.
  14. liziz tamponu 600 ul boncuk tekrar.
  15. 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar GTP ekleyin.
  16. 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar + 1 mM GTP inkübe edin. Not: Bunon-spesifik m 7 GTP ile etkileşim proteinleri ilişkisini (yani, non-metile GTP ile etkileşim).
  17. 30 saniye için 500 x g'de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet.
  18. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatantı aktarın ve 4x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) 200 ul ilave edin. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C 'de GTP kontrol örneği saklayın. adım 7.9 tekrarlayarak boncuk yıkayın.
  19. 90 sn için 95 ° C 'de 1 x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) ve kaynama boncuk tekrar. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C 'de 7 m GTP'ye bağlı fraksiyonu saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir m 7 GTP Affinity Sütun içinde eIF4E ve eIF4E2 ve Oksijen Cevabı Cap-bağlama yeteneği analizi

1. Şekil 2, iki insan hücre çizgileri oksijen dalgalanmalara tepki olarak iki ana kap bağlayıcı proteinler tipik m 7 GTP afinite saflaştırma western lekelerinin temsil etmektedir: F ŞEKIL 1 ve kolorektal karsinom primer insan renal proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (HRPTEC) ( Şekil 2'de, HCT116). Hücreler, sıvı ortam içinde çözülmüş oksijen hipoksi iş istasyonu içindeki hava ile dengelenmiş olduğundan emin olmak için 24 saat boyunca, belirtilen durumu oksijen muhafaza edilir. Giriş Lane (in) 7 GTP-bağlı agaroz boncuklar kap bağlayıcı proteinler yakalamak eklenir m önce bütün hücre lizatı% 10 temsil eder. Bu giriş koridoru zenginleştirme ölçülmesi için bir temel olarak kullanılanm 7 GTP aşağı çekme bir hedef protein elde edilir. GTP şerit 1 mM GTP ile elüte edilmişler ve başlangıçta 7 GTP boncuklardan elüat ise. Bu adım ayrıca sigara metile GTP tanıyan proteinlerin algılanmasına olanak verir. Cap-bağlayıcı proteinler eIF4E ve eIF4E2 özellikle m 7 GTP tanır fakat homologu (burada gösterilmemiştir) eIF4E3 non-metillenmiş GTP bağlanır. 5 'mRNA başlık yapısı (m 7 GTP) bağlamak için eIF4E ve eIF4E2 kabiliyeti (toplam kullanılabilir havuzu) giriş şeritte yoğunluğuna m 7 GTP sütunu nispetle kendi bantlarının yoğunluğunu karşılaştırarak ölçülebilir.

Bu miktar, ImageJ olarak bir görüntü analiz yazılımı ile üç biyolojik çoğaltır protein bantlarının piksel şiddeti ölçülerek gerçekleştirilebilir. Sonuçlar ortalama ± standart hata yoğunluğu birimleri (RDU) göreli aracı olarak ifade edilmiştir. Ham değerler önce normalleşmeDeney ve kontrol numuneleri gelen unpaired iki kuyruklu Student t-testi ile karşılaştırıldı. P <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bu Örnek Deney iki hücre hattı da eIF4E ve eIF4E2 kullanım için oksijen farklı aralıklara sahip olduğunu göstermektedir. Şekil 1, HRPTEC sadece eIF4E güçlü m bağlandığım gösterir 7 GTP% 8 O 2 (Şekil 1A), eIF4E ve eIF4E2 hem anlamlı m 7 GTP% 3-5 Ç 2 (Şekil 1B - C) ile ilişkili olduğu, ve tek eIF4E2% 1 o 2 (Şekil 1D) m 7 GTP güçlü bir şekilde bağlar. Şekil 2'de, HCT116 hücrelerinde, bu kap bağlayıcı proteinlerin oksijen bağımlı kullanımı farklıdır: Sadece eIF4E GTP% 12 O2 (Şekil 2A), her iki kap-bağlayıcı proteinler m 7'ye önemli ölçüde bağlanan 7 m önemli ölçüde bağlanan % 5-8 O 2 aralığında GTP(Şekil 2B - C) ve sadece eIF4E2% 3 O 2 (Şekil 2D) m 7 GTP önemli ölçüde bağlanır. GTP ile m 7 GTP sütunundan elüsyon olmaması eIF4E ve eIF4E2 m 7 GTP özgüdür ve olmayan metile GTP tanımaz olduğunu göstermektedir. çubuk grafikler ImageJ kullanarak üç biyolojik çoğaltır ölçümü temsil etmektedir. Sonuçlarımız, iki ana kap bağlayıcı proteinler, eIF4E ve eIF4E2 bir oksijen-bağlı bir şekilde mRNA m 7 GTP başlık yapısına bağlanma yetenekleri açısından farklılık göstermektedir.

Bu iki protein mRNA'ların eşsiz sınıfların çeviri başlatmak önceki literatüre dayalı, kap-bağlanma aktivitesinde bu değişim oksijen durumuna değişikliklere uyum sağlamak için oluşturulan farklı proteomlarda neden olabilir. Bu teknik, 5 'mRNA kapak ile etkileşim yeni bir çeviri başlatma faktörleri tanımlamak için kullanılabilir(ya da kap-bağlayıcı proteinler ile) böyle bir m 7 GTP eluat kütle spektrometresi analizi gibi bir hedef western blot yaklaşım ya da geniş bir yaklaşımla.

Şekil 1
Şekil 1: eIF4E ve eIF4E2 faaliyetleri% 3-5 O 2 HRPTEC içinde physioxia sırasında örtüşüyor. GTP boncuk insan renal proksimal tübül epitel hücre M 7 kullanarak yakalama testleri (HRPTEC) lizatlarının (A)% 8, (B),% 5 (C),% 3 ya da (D) 24 saat süre ile% 1 O 2 maruz bırakılmıştır. GTP, GTP yıkama m 7 GTP için özgüllüğü ölçmek için; m 7 GTP, GTP yıkamadan sonra m 7 GTP boncuk bağlı proteinler. Örnek Western blotlar RD (gösterilmemiş olan ve en az üç bağımsız deneyden veriler ImageJ tarafından ölçülür ve nispi yoğunluk birimleri olarak ifade edildibütün hücre lizatı,% 10, girişin (IN) U) göre. * P <0.05 (eşsiz, iki kuyruklu Student t-testi) için kap bağlı fraksiyondan (m 7 GTP) 'de eIF4E ya eIF4E2 zenginleştirilmesini karşılaştıran önemli bir değişiklik olarak değerlendirildi. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama (SEM) ± standart sapma anlamına gelir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Timpano, S. ve Uniacke, fizyolojik oksijen altında kültüre J. İnsan hücreleri çeviri için ayrı mRNA'ların işe iki kap-bağlayıcı proteinlerin kullanmaktadır. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. eIF4E ve eIF4E2 faaliyetleri 5-8 HCT116'da physioxia sırasında üst üste% O 2. GTP boncuk (A),% 12 (B) ',% 8, (C),% 5 ya da (D) 24 saat süre ile% 3 O 2 maruz HCT116 insan kolorektal karsinoma lizatlarında m 7 kullanarak yakalama tahlilleri. GTP, GTP yıkama m 7 GTP için özgüllüğü ölçmek için; m 7 GTP, GTP yıkamadan sonra m 7 GTP boncuk bağlı proteinler. Örnek Western blot gösterilmektedir ve en az üç bağımsız deneyden elde edilen veriler, ImageJ tarafından ölçülür ve bütün hücre lizatı,% 10, girişin (IN) göre yoğunluğu birimleri (RDU) olarak ifade edildi. * P <0.05 (eşsiz, iki kuyruklu Student t-testi) için kap bağlı fraksiyondan (m 7 GTP) 'de eIF4E ya eIF4E2 zenginleştirilmesini karşılaştıran önemli bir değişiklik olarak değerlendirildi. Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama (SEM) ± standart sapma anlamına gelir. Bu araştırma aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. timpano, S. ve Uniacke, fizyolojik oksijen altında kültüre J. İnsan hücreleri çeviri için ayrı mRNA'ların işe iki kap-bağlayıcı proteinlerin kullanmaktadır. 2016; 291 (20): 10772-82 24. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fizyolojik oksijen koşullarına maruz insan hücrelerinde kap bağlayıcı proteinlerin analizi, yeni oksijen regüle çeviri başlatma faktörlerinin tanımlanması için izin verir. MRNA veya başka bir kap ile ilişkili proteinlerin hem 5 'başlık için bu faktörlerin afinite m 7'ye olan ilişkilerine gücü ölçülebilir agaroz boncuklar GTP-bağlı. Bu tekniğin bir uyarı proteinlerin post-lisis kapağı bağlama potansiyelini ölçer, ancak, protein-protein etkileşimleri ve post-translasyonel modifikasyonları (PTMS) muhafaza denatüre edici olmayan koşullar altında gerçekleştirilir olmasıdır. Çeşitli protein-protein etkileşimleri 5 'kapağa eIF4E etti bağlanması aracılık eder. 4E-BP bağlanır ve eIF4G ile etkileşimi engelleme ve 38 karmaşık öncesi başlama 43s görevlendirilmesini engelleyerek eIF4E bastırmıştır. eIF4E / 4E-BP kompleksi o transkript herhangi başlamasını engelleme, 5 'mRNA kap bağlı kalır ve canm 7 GTP afinite sütunlarında eIF4E inhibisyonu için bir markör olarak kullanılabilir. Tersine, m 7 GTP sütunlarda eIF4G ile eIF4E etkileşimi aktif çeviri başlatılması için bir belirteç olabilir. PTMS translasyon başlatma faktörleri aktivitesi düzenleyen başka bir yöntemdir. 5 'mRNA 39 kap Örnek olarak, Mnk1 ile eIF4E fosforilasyonu yakınlığını artırabilir. İnterferon uyarımlı gen 15 (ISG15) tarafından kodlanan protein değiştirici patojen enfeksiyonu 40 ile interferon başlatılmasına cevaben eIF4E2 kapağı bağlama aktivitesini arttıran bir PTM olup. ISG15 geni Bu sistem düşük oksijen eIF4E2 düzenleyen olabilir düşündüren kendi promotör bir hipoksi yanıt öğesi içeriyor. Çok az PTMS fizyolojik olarak ilgili oksijen koşullarında kap bağlayıcı protein aktivitesini değiştirebilir nasıl bilinir. kütle spektrometresi analizi ile takip Bu teknik inci yeni oksijen düzenlenmekte ve fizyolojik ilgili PTMS ortaya koyabilirtranslasyon inisyasyon faktörlerinin aktivitesi aracılık eder.

Bir m 7 GTP kapak analog ile yakalamak için alternatif bir yöntem eIF4E veya eIF4G gibi bilinen bir kap-bağlayıcı protein immünopresipitasyon ve ilişkili proteinleri tespit etmek kütle spektrometresi gerçekleştirmek olacaktır. Bu stratejinin bir sınırlama o kap-bağlayıcı proteinler genellikle stres 41 granüller içinde ya da kap-bağımsız çeviri 1,4 alternatif hücresel rolleri olması. Bu nedenle, m 7 GTP kapak analogları kullanılarak yeni kap ilişkili proteinleri inceleyen, özellikle kap-bağlayıcı proteinlerin izole etmek için en iyi, en güvenilir bir yöntemdir. Bir m 7 GTP kapak analog kullanan bir sınırlama gibi çöpçü de sadece m 7 GTP mRNA kap ile etkileşim enzim DCPS Dekapaj, ancak bazı kap-bağlayıcı proteinler 42 bağlama için ikinci bir temel ihtiyaç olmasıdır. Ayrıca, bu tür Dcp1 / Dcp2 kompleks genel olarak Dekapaj enzimler, Hidrolik olabilirm 7 GTP olyze ve etkili reçine kapasitesini azaltır. Bu nedenle, bazı kapak bağlayıcı proteinler bu analizde kaybolabilir. Bu uyarılar atlamak için, enzimatik dayanıklı mRNA kap analogları kullanılabilir. İki hidrolize olmayan kap analoglan mononükleotid m 7 GpCH2pp veya 7 GpCH2ppA dinükleotid m DCPS, Dcp1 ve Dcp2 43 yakalamak için gösterilmiştir. Bu mRNA kap analoglan ticari olarak mevcut değildir, fakat kimyasal olarak de novo sentezlenebilir gerekir. Bu protokolün diğer kısıtlılığı tek kap bağlayıcı "piggybacking" aracılığıyla proteinleri ya da kap-bağlayıcı proteinlerin etkileşim proteinleri Çekilecek olmasıdır. Kap-bağımlı çeviri inisiyasyon başlaması önemli biçimi iken, kap-bağımsız mekanizmalar hücresel stres 1 şartlarında özellikle yaygındır. Ancak, bu tekniğin bağlamında ve yeni stres kaynaklı faktörler olduğunu tanımlayan çeviri inisiyasyon 6-8,24 alanında ortaya çıkan eğilimler, pakap-bağımlı başlamasında rticipate araştırma umut verici bir alandır.

Bu protokolde Bir diğer faktör dikkate medyada oksijendir. bir sıvı ortam içinde hücrelerin kültürlenmesi hücreler ve atmosfer arasında bir bariyer oluşturmaktadır. Sıvı ortam, atmosfer gazı bileşimi 36 dengelenmeye 24 saat kadar sürebilir gösterilmiştir. Bu nedenle, hücreler önce lizis istenen oksijen durumu 24 saat kültür olmalıdır, ya da daha kısa inkubasyon gerekiyorsa medya önceden klimalı edilebilir. Ön şartlandırma gaz alışverişini sağlayan bir steril kültür şişesi içinde en az 24 saat süre ile hipoksi iş istasyonu ortamı muhafaza içerir. hipoksi iş istasyonu içindeki hücrelerin tanıtıldı herhangi oksijenli çözüm hızla böyle bu protokolde incelenmekte olan kap-bağımlı çeviri başlatılması gibi hücresel sinyal yollarını değiştirebilir. Nedeniyle hücrelerde oksijen algılama yollarının hassasiyeti, irade herhangi bir çözüm içinBu PBS ve tripsin-EDTA liziz önce hücreler ile etkileşim ayrıca, en az 24 saat boyunca önceden kıvamlandırılmış gerekir. Lizis ve post-lizis yıkama tamponlar soğuk kullanılmalıdır ve bu nedenle 37 ° C hipoksi iş istasyonunda önceden klimalı değildir. Proteinlerin bir miktar oksijen bağımlı modifikasyonlar, aktif sonrası lizis olabilir birlikte, soğuk tampon eser neden olabilir enzimatik aktiviteleri ve protein-protein ya da protein RNA kompleksleri "karıştırma" en aza indirmek için gereklidir. sertliğini arttırmak için bu protokol için bir modifikasyon 24 saat parçalama ve post-lizis yıkama tamponlar koşul öncesi ve sonra kullanımdan önce iş istasyonu içinde buz üzerinde inkübe olabilir. Bu çözümler, su buharlaşması nedeniyle konsantre çünkü Medya ve tamponlar fazla üç gün boyunca hipoksi istasyonunda muhafaza edilmemelidir. uzun vadeli çalışmalar için (> 3 gün), seribaşı hücrelerin başlangıç ​​miktarı dikkatle ele alınmalıdır. Hücreler bölmek ve çanak yüzey alanı kalabalık hale geldikçe,Bu ortam asidifikasyon gibi stresler kap bağlayıcı protein aktivitesini etkileyebilir. Deneyin son gününde, hücreler% 80-90 bir katışma olmalıdır.

, Hücrelerin miktarı boncuklar yıkama, kullanılan lizis kadar hipoksi iş istasyonu hücreleri koruyarak, ve metillenmemiş GTP kontrolü: Dört Bu protokol kapsamında kritik adımlar vardır. 1) düşük oksijen hücreleri korumak için çeşitli yöntemler vardır. Bunların çoğu, hücre kültür kaplarına sahip küçük kabinler arasında, ancak herhangi bir işlem veya hücre parçalama, havadaki odaları dışında gerçekleştirilmelidir. Örneğin hipoksi uyarılabilir faktörler olarak oksijen algılama makine bileşenleri aktif ya da bir ya da iki dakika 35 bir konuda etkisiz hale getirildi. Daha önce de belirtildiği gibi, bu nedenle, hipoksiyaya iş istasyonu hücreleri lize etmek, ilgili durumu oksijen ile ilişkili olan kap bağlayıcı proteinlerin aktivitesi elde etmek için önemlidir. hücre 2) sayısıBu protokol (iki 150 mm yemekleri) önerilmektedir güçlü m için yeterli olduğunu gibi eIF4E aile ya da karmaşık eIF4F (eIF4A ve eIF4G) üyeleri olarak 7 GTP interaktörler. Daha hücreleri en az beş 150 mm yemekleri, geçici etkileşimler veya eIF4F yoluyla m 7 GTP mRNA kapaklı tek ortağı olan proteinleri tespit etmek için gerekli olabilir. 3) hücre lizatı ile inkübe edildikten sonra boncuklar yıkama sıkı ve daha az sıkı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Burada sunulan protokol lizis tamponu boncuk beş kez yıkamak için kullanılan bir sıkı bir seçenek sunuyor. zayıf etkileşimlerle proteinleri proteinlere ilgi kap bağlayıcı, tek bir daha az yıkama yerine ve Tris-tamponlu tuzlu su yerine, lizis tamponu kullanabilir. 4) non-spesifik boncuk ile etkileşim proteinleri uzaklaştırmak için indirekt agaroz ile ön temizlemek hücre lizatı, bazı kap-bağlayıcı proteinler gerçek mRNA kap yapısı ayırt edemez, metile GTP (m önemli olmakla birlikte7 GTP) ve metillenmemiş GTP. Böyle bir protein eIF4E homologu eIF4E3 44 olduğu. GTP ile boncuk akıtılarak da ilgi olabilir olmayan metile GTP tanır herhangi bir protein yerinden edecek. Her iki m 7 GTP tanımak ve GTP henüz proteinlerin biyolojik önemi tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu metillenmemiş GTP M 7 GTP tanımak yapmak eIF4E ve eIF4E2 proteinlere oranla (korunmuş kap-bağlama domaini ile iyi niyetli bir kap bağlayıcı protein olan) eIF4E3 içeren birkaç yayın tarafından vurgulanmıştır.

Bu teknik, sunulduğu gibi, ilgi konusu m 7 GTP inter aktörlerin belirlemek için bir hedef bir yaklaşım olarak ya da kütle spektrofotometresi ile 7 m GTP eluatının analiz ederek, geniş bir yaklaşım olarak uygulanabilir. Birçok diğer teknikler içi fraksiyonasyon ve immünofloresans, ko-immünopresipitasyon bir şekilde kap bağlayıcı aktivitesi analiz physioxic maruz (protokol 4) takip edebilirnd Polizom analizi. Çeviri kontrol transkripsiyonu olarak gen ifadesinin eşit katkı olarak ortaya çıkmaktadır. Bu tekniği kullanarak kap-bağımlı çeviri başlatma düşük oksijen yanıt olarak düzenlenmiştir nasıl ışık tutacaktır kapak bağlayıcı komplekslerinin aktivitesini ve kompozisyon araştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351, (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14, (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266, (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433, (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564, (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273, (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486, (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32, (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23, (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129, (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21, (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282, (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1, (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273, (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29, (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121, (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25, (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43, (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57, (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92, (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87, (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571, (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99, (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321, (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15, (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26, (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14, (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18, (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21, (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14, (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18, (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271, (11), 2189-2203 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics