Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fischer, J., Johnson, R. A., Boon, E. Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay. J. Vis. Exp. (119), e55129, doi:10.3791/55129 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Adaptiv respons är avgörande för bakteriell överlevnad. För att upptäcka och reagera på miljöförändringar, bakterier använder en stimulus-respons system som kallas tvåkomponents signalering. 1,2 I ett typiskt två-komponentsystem, detekterar histidin kinas ett besläktat stimulus, autophosphorylates dess konserverad histidinrest, därefter överför fosfat till en konserverad aspartatrest på mottagaren domänen av en svarsregulatorprotein. 3 Denna händelse utlöser en förändring i aktiviteten av svarsregulator, som stimulerar en nedströmseffekt. 4,5 Således bakterier kan känna av och anpassa sig till förändringar i den lokala miljön. Vissa tvåkomponents signalsystem avvika från denna arketyp. I vissa fall är den sensoriska domänen i histidin-kinas en fristående protein, som direkt detekterar sinnesintryck och modifierar kinasaktivitet genom en protein-proteininteraktion. 6-8 Men fondenamental processen och övergripande roll för systemet förblir densamma. Tvåkomponents signalering är en allestädes närvarande stimulus-reaktion som är nödvändig för bakteriell överlevnad, och histidin kinaser spelar en avgörande roll i transduktion av signalen. 9

Trots betydelsen av histidin kinaser till bakteriell biologi, är de fortfarande dåligt karakteriserade. Detta beror på den inneboende instabiliteten hos phosphohistidine, och bristen på en praktisk metod för att mäta autofosforylering. Phosphohistidine är mer labil än fosfoserin, fosfotreonin och fosfotyrosin. 10 Således tekniker som vanligen används för att analysera Ser / Thr / Tyr-kinaser är inte tillämpliga för histidin kinaser. 11 In vitro-analyser för att studera histidin kinaser har i stort sett varit begränsade till SDS-PAGE-autoradiografi. 12,13 I denna metod [γ- 32 P] -ATP inkuberas med kinas och fosforylering av kinaset analyseras genom polyacrylamide gelelektrofores (PAGE) följt av autoradiografi av gelén. Denna metod kan användas för att övervaka kinas autofosforylering liksom phosphotransfer från kinas till en svarsregulator. Emellertid har denna metod märkbara brister. PAGE-baserade analyser är låg genomströmning och tidskrävande. Sådana begränsningar är inte bidrar till att karakterisera ett protein och fastställa dess kinetiska parametrar. En alternativ metod för att studera histidin kinaser som nyligen publicerades utnyttjar phosphohistidine antikroppar för att detektera autofosforylering. 14 Även om denna metod har fördelen av att skilja mellan en-phosphohistidine och 3-phosphohistidine, beroende på instrument som används för detektering, denna metod kanske inte erbjuder ett stort dynamiskt område eller hög övre detektionsgränsen. Det finns således ett behov av ett snabbare, mindre arbetskrävande, och mer känslig analys som kan användas för att studera dessa viktiga proteiner.

Här beskriver vi och demonstrate ett noggrant utvecklade nitrocellulosa bindningsanalys som kan användas för att kvantifiera autofosforylering av renade bakteriella histidin kinaser in vitro. Denna analys är högre kapacitet och mindre tidskrävande än PAGE baserade analyser. Metoden utnyttjar även tjerenkovstrålning för phosphohistidine kvantifiering, som erbjuder en hög övre detektionsgräns och ett stort dynamiskt omfång. Analysen kan användas för att bestämma kinetiska parametrar för histidin kinaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Varning: Detta protokoll kräver lämplig utbildning i användning och hantering av radioaktivt material. Använd erforderlig personlig skyddsutrustning när du utför denna analys, inklusive beta strålskydd. Radioaktivt avfall måste hanteras varsamt, eftersom stora mängder avfall genereras under tvättfasen av experimentet. Se till att avfallet lagras i en upprätt behållare, såsom en stor hink eller flaska som inte kommer att vara lätt omkull eller spillt. När experimentet avslutas, töm allt flytande avfall på lämpligt sätt märkt avfallsbehållare radioaktiva. Hantera alla material med omsorg, och hålla en geigermätare i närheten för att övervaka arbetsytan för kontaminering.

OBS: Detta protokoll är en reviderad version av en tidigare rapporterad analys från vår grupp. 15 Phosphohistidine stabilitet i H 3 PO 4 bör testas för varje okaraktäriserat histidin kinas innan du använder den här metoden. Den phosphohistidine stanlagsprov har beskrivits tidigare. 15 En negativ kontroll som inte innehåller kinas måste inkluderas. Detta är nödvändigt för att subtrahera bakgrundssignalen från varje prov, och säkerställa att det [γ- 32p] -ATP tillräckligt tvättas bort från membranet.

1. Beredning av reagenser och material

  1. Rena histidin kinaser från bakteriekultur innan du använder denna analys.
    1. Rena en histidin-kinas (gen ID 1189383) från Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) för utvecklingen av denna analys. Klona kinaset in i expressionsvektorn pET-23aHis-TEV med användning av Ndel och Xhol restriktionsställen, och utföra ställesriktad mutagenes för att ge den mutanta konstruera Vp1876 D499A.
    2. Omvandla plasmiden in i E. coli BL21 (DE3) pLysS, och odla celler i TB medium vid 37 ° C. Tillägg kulturer med ampicillin (100 | ig / ml) och kloramfenikol (34 | ig / ml), och växa under omröring(250 rpm) till en OD 600 av 0,6.
    3. Inducera proteinexpression med IPTG till en slutlig koncentration av 25 | iM, och växa kulturer över natten vid 16 ° C. Harvest cellerna genom centrifugering (5000 xg), lyse genom ultraljudsbehandling, och centrifugera för att avlägsna cellrester (18.000 xg).
    4. Rena den His-märkt kinas med användning av Ni-NTA-agaros. Bekräfta renhet genom SDS-PAGE. Optimera rening för varje protein, och bekräfta renhet innan du använder denna analys.
  2. Förbered 25 mM H 3 PO 4 tvättlösningen. Till 1 L destillerat avjoniserat vatten, till H 3 PO 4 till en slutlig koncentration av 25 mM. PH för denna lösning är ca 2,0. Placera 25 mM H 3 PO 4 på is.
  3. Bered en 13x stamlösning av 325 mM H 3 PO 4, för att användas för att släcka kinasreaktionen. PH för denna lösning är ca 1,5. Placera 325 mM H 3 PO 4 på is.
    OBS: H 3 PO 4
  4. Förbered en 4x reaktionsbuffert stamlösning innehållande 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCl, 16 mM MgCl2 och 40% glycerol.
  5. Kvantifiera histidin kinaskoncentration av metoder etablerade proteinkoncentration (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Bered en histidin kinaslösning med en koncentration som är 4 gånger den önskade slutkoncentrationen. För att erhålla tillräcklig signal, bör den slutliga proteinkoncentrationen i reaktions helst vara minst 5 ^ M.
  6. Förbered en 4x radiomärkt [γ- 32p] -ATP lösning med lämplig 4x koncentration av omärkt ATP och märkta: omärkt förhållande för experimentet.
    OBS: Mängden [γ- 32p] -ATP som bör ingå i denna blandning är beroende av hur mycket [^7, - 32 P] -ATP i slutändan kommer att upptäckas för varje reaktion. Vi har fått tillräcklig signal med slutkoncentrationer som sträcker sig mellan 0,1-5 pCi per reaktion. Det är viktigt att den märkta: omärkt ATP förhållandet hållas konstant för alla reaktioner i ett givet experiment. Serieutspädningar bör göras när flera ATP-koncentrationer önskas, eftersom detta väl hålla märkta: omärkt ATP förhållandet konstant över alla koncentrationer. Slutliga ATP-koncentrationer sträcker sig typiskt från 10 | iM till åtminstone 1 mM, och varje koncentration bör analyseras i tre exemplar för att erhålla tillförlitliga kinetiska data.
  7. 96- väl dot blot-apparat
    1. Skär en 8 cm x 12 cm bit nitrocellulosamembran (0,2 um porstorlek).
    2. Positionen nitrocellulosa i en dot blot-apparat, vilket säkerställer att membranet passar så att anordningen är förslutna, och samtliga brunnar är helt täckta av membranet. Om monteras korrekt, bör det inte finnas något luftläckage när vakuumet är applIED.
    3. För att samla filtratet ansluta apparaten till en sekundär sidoarm kolv. Från ventilspindeln, anslut lämplig slang så att anordningen kan bekvämt användas utan att tippa den sekundära kolven.
    4. Anslut sekundärsidan arms kolven till aspirator / vakuumkälla.
    5. Testa att anordningen är helt tät genom att applicera vakuum till anordningen. Om anordningen är korrekt monterad, kommer ett kraftigt vakuum vara närvarande i alla brunnarna. Alla slanganslutningar kan vara insvept i Parafilm eller plastfolie för att säkerställa en tät förslutning.
    6. Eventuellt, för att testa vakuum, pipett 100 mikroliter av reaktionsbuffert till en brunn. Vakuumet bör vara tillräckligt starkt för att dra upp all vätska genom brunnen och på membranet.
    7. Stänga av vakuum tills alla prover är redo att upptäckas på membranet.

2. Omsättning Initiering och Quenching

  1. Blandning av reaktionskomponenter
    1. Före initiation, förbereda alla fyra reaktionskomponenter som 4x stamlösningar: reaktionsbuffert (se avsnitt 1.4), histidin kinas (1,5), [γ- 32p] -ATP (1,6), och DDH 2 O.
    2. Blanda lika volymer av reaktionsbuffert, histidin-kinas, och DDH 2 O. Låt dessa reaktionskomponenter ekvilibrera vid rumstemperatur under en kort tid (10 min).
      OBS: Den slutliga reaktionsvolymen är beroende av om försöket är tidsberoende, enzymberoende, eller substrat-beroende. Tidsberoende reaktioner måste vara större, eftersom multipla alikvoter tas från samma reaktion och släcktes vid önskad tidpunkt. Reaktionsvolymen kommer att bero på antalet tidpunkter som önskas. Analysen är optimerad för varje plats på nitrocellulosamembranet för att innehålla 30 mikroliter av reaktionen. Således, om 10 tidpunkter önskas, måste reaktionsvolymen vara minst 300 mikroliter (en högre volym som 330 mikroliter skulle vara att föredra i händelse av pipetteringsfel).Enzym och substrat-beroende experiment kräver mindre reaktionsvolymer. Reaktionsvolymen för dessa experiment kan vara så liten som 30 | il, eftersom detta är den slutliga volymen som kommer att fläckvis på nitrocellulosamembranet.
    3. För att initiera reaktionen, tillsätt en volym på [γ- 32 P] -ATP lösning till reaktionen och blanda genom att pipettera upp och ner. Spåra förfluten reaktionstid med en timer och låta reaktionen fortgå under den önskade tiden.
    4. För att avbryta reaktionen, tillsätt 1/13 av den totala reaktionsvolymen iskall 325 mM H 3 PO 4 till reaktionen och blanda genom att pipettera upp och ner. Alternativt, tillsätt en alikvot av reaktionen till 325 mM H 3 PO 4.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av H 3 PO 4 bör vara 25 mM för att tillräckligt släcka reaktionen. Till exempel lägga till 2,5 mikroliter 325 mM H 3 PO 4 till 30 mikroliter reaktion eller lägga till 30 mikroliter reaktion på 2,5 mikroliter 325 mM H 3 PO <sub> 4. Det slutliga pH-värdet för reaktionen är ca 4,0. Denna koncentration av H 3 PO 4 har testats och bekräftats att släcka kinasreaktionen i denna buffert utan att försämra phosphohistidine.
      1. Till exempel mixa 7,5 mikroliter 4x reaktionsbuffert, 7,5 | il 4x histidin-kinas, och 7,5 mikroliter DDH 2 O. Initiera reaktion med 7,5 mikroliter [γ- 32 P] -ATP. Släck reaktionen med 2,5 | il 325 mM H 3 PO 4.
    5. Placera omedelbart kylda reaktioner på is tills alla reaktioner har avslutats.
      OBS: För att maximera effektiviteten, är det lämpligt att initiera en reaktion var 15 eller 20 s tills alla reaktioner initieras, och när den önskade reaktionstiden har passerat, släcka en reaktion var 15 eller 20 s tills alla är utsläckt. För dem som använder analysen för första gången, kan ett längre intervall vara mer hanterbart.

3. Spotting of kylda Reaktioner på nitrocellulosa

  1. Starta vakuum på 96-brunnars dot blot-apparat
    1. Placera den förmonterade 96-brunnars dot blot-apparaten (avsnitt 1.7) till en sekundär behållare. Denna behållare bör vara tillräckligt stor för att apparaten kan lätt tas isär, när anordningen och membranet kommer att vara radioaktiv efter användning.
    2. Sug 96-brunnars dot blot-apparat.
    3. När apparaten är under vakuum, försiktigt pipettera släckta reaktions direkt på nitrocellulosamembranet i varje brunn. Upprepa tills alla reaktioner lastas på membranet. Eftersom bindningskapaciteten av nitrocellulosa (75-110 mikrogram / cm2) är större än den mängd histidin kinas som är fläckig, kan man anta att nästan alla av kinas binder till membranet när den laddas korrekt.
      OBS: Beroende på vilken utrustning som används, måste man vara noga med att inte punktera nitrocellulosa. Observera att alla av reaktionen har gjort kontakt med the nitrocellulosa. Det är lätt för en del eller alla av reaktionen att hålla sig till väggarna i brunnen, och inte når nitrocellulosa.
    4. Tvätta brunnarna med 100 | il iskall 25 mM H 3 PO 4. Detta kommer att tillåta någon reaktionsvolym som kan ha varit instängd i brunnen för att nå membranet, vilket garanterar fullständig lastning av alla reaktioner. Göra det möjligt för hela volymen att strömma genom membranet.
  2. Apparat demontering och nitrocellulosamembran överföring
    1. Försiktigt isär apparaten innan du stänger av vakuumet. Observera att både apparaten och nitrocellulosamembranet är radioaktiva vid denna tidpunkt. Ta inte bort några apparatkomponenter från den sekundära behållaren vid denna tidpunkt.
    2. Med pincett, noggrant överföra nitrocellulosamembranet från apparaten till en behållare med ca 200 ml 25 mM iskall H 3 PO 4. Placera locket på behållaren, som tvätt kommer att vara radioactive. Vid denna tid, kan vakuum stängas av.

4. Nitrocellulosa Processing

  1. nitrocellulosa tvättning
    1. Placera behållaren med tvättmembranet på en rocker. Låt membranet försiktigt gunga under 20 minuter.
    2. Efter 20 min, dekanteras försiktigt den använda tvättlösningen in i en stor hink för att användas för lagring temporärt avfall. Tillsätt 200 ml iskall 25 mM H 3 PO 4 till membranet och upprepa.
      OBS: Minst tre 20 minuterstvättar är nödvändigt att ta bort bakgrunds [γ- 32 P] -ATP signal från membranet. Efter den tredje tvättningen, testa den använda tvättlösningen för strålning med en geigermätare. Fortsätta tvättning av membranet såsom beskrivits ovan tills ingen signal föreligger i tvättlösningen.
  2. nitrocellulosa torkning
    1. Efter det att membranet är tillräckligt tvättas, tillåta membranet att kort lufttorka. Detta tar vanligtvis fem minuter eller mindre.

5. Exponering för Storage phosphor screen

Obs: Detta avsnitt är valfritt. Exponera membranet till en fosforskärm är fördelaktig i det att den möjliggör visualisering av intensiteten av radiomärkt kinas i varje fläck på membranet. Den relativa intensiteten för dessa fläckar är direkt proportionell mot mängden av fosforylerat histidin-kinas i varje fläck. Intensiteten kan kvantifieras med bildbehandlingsprogram, och dessa resultat kan jämföras med de som genereras från avsnitt 7. Dessutom ger detta steg för kvalitetskontroll. Avvikelser ses i den här analysen kan förklara oregelbundna resultat från scintillationsräkning.

  1. beredning fosforskärm
    1. Före exponering av membranet till lagringsfosforskärmen, exponera fosforskärmen till vitt ljus under åtminstone 5 min. Detta säkerställer att eventuella rest bild som kan innehas av skärmen raderas.
    2. Se till att skärmen är renoch torr. Om det behövs, försiktigt rengöra skärmen med en fosforskärm rengöringslösning som godkänts av skärmen tillverkaren, och torka torrt.
  2. Nitrocellulosamembranpreparat
    1. Försiktigt linda torra nitrocellulosamembran i en tunn plastfolie för att förhindra kvarvarande fukt från skada fosforskärmen. Se till att det inte finns några rynkor eller bubblor.
  3. Exponering för fosforskärm
    1. Placera insvept nitrocellulosamembranet i lagringsfosforskärmen kassett, placera skärmen med framsidan nedåt på membranet, och stäng kassetten. Öppna inte kassetten eller flytta membranet tills det är dags att skanna fosforskärmen som membranbyte under exponering kommer att orsaka en dubbel eller kladdig bild som ska fångas.
    2. Exponera i minst 4 timmar, eller så länge som fosforskärm tillverkaren antyder.
    3. När exponeringen är avslutad, skanna fosforskärmen och fånga bilden med en fosfor scanner.

6. Förberedelse nitrocellulosamembran för scintillationsräkning

  1. Ponceau S färgning och avfärgning
    1. Doppa kort på nitrocellulosamembranet i Ponceau S färglösningen (0,1% Ponceau S (vikt / volym) i 5% ättiksyra) för 1 - 2 min. Blöt hela membranet med fläcken före avfärgning.
    2. Dekantera överskott Ponceau S från membranet.
    3. Skölj membranet med DDH 2 O tills bara fläckarna från histidin kinas färgas. Observera att detta förfarande endast kommer att fungera om alla platser innehåller detekterbara mängder protein.
      OBS: Detta steg är nödvändigt för att bekräfta att kinaset är bunden till nitrocellulosa, och att proteinladdning är ännu i alla fläckar. Den tillåter också den prickiga kinas för att enkelt skäras ut från membranet.
  2. Skära ut fläckar
    1. Med sax, klippa ut varje plats på nitrocellulosamembranet. Det är inte nödvändigt att skära perfekt along kanten av färgade plats, om membranet tvättades tillräckligt, kommer bakgrunden på grund av varierande storlek av utskurna prickar vara försumbar. Det är bara viktigt att skära ut hela platsen för varje reaktion.
    2. Använd pincett, töm varje plats i scintillationsflaskor. Ingen scintillationscocktail är nödvändig eftersom 32p är lätt detekterbar genom tjerenkovstrålning.
      OBS: Alternativt kan platsen skäras ut med hjälp av en vass korkborr. Ta bort varje fläck från nitrocellulosa med korkborr, och skjut in en scintillationsflaska med ett stift. Med denna metod, inte membranet behöver inte röras, vilket ytterligare minimerar exponeringen för strålning.
  3. Fastställande CPM / pmol av [γ- 32p] -ATP lösning
    1. Spot flera utspädningar av [γ- 32p] -ATP lösning (punkt 1.5) på 1 cm x 1 cm kvadrater av nitrocellulosa. I korthet lufttorka.
    2. Använd pincett, töm varje ruta i scintillationinjektionsflaskor. Ingen scintillationscocktail är nödvändig. Dessa prover kommer att användas för att generera en standardkurva för att bestämma den CPM / pmol av ATP-lösning.

7. scintillationsräkning

  1. Ladda alla scintillationsflaskor i scintillationsräknare kassetter. Lastkassetter i scintillationsräknare.
  2. Utför scintillationsräkning program för att mäta CPM för varje flaska. Dessa data, tillsammans med CPM / pmol av den radioaktivt märkta ATP mix (från avsnitt 6.3), kan användas för att beräkna mängden av fosforylerat histidin kinas närvarande i varje plats, och därmed graden av autofosforylering. 18,19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representativ uppsättning data genererades med en bild som tagits med en fosforkameran (Figur 1), Ponceau S av nitrocellulosamembranet (figur 2), och scintillationsräkning data (Figur 3). Figur 3A visar enzym kinetiska konstanter i en Lineweaver-Burk plot. Dessa resultat erhölls med användning av en renad histidin-kinas från den gramnegativa arter Vibrio parahaemolyticus (gen ID 1189383). Det protokoll som används för att rena detta kinas beskrivs i avsnitt 1,1. Den slutliga kinaskoncentration i reaktionen var 7,5 ^ M. De slutliga ATP-koncentrationer varierade från 0 M till 1,28 mM. Den [γ- 32p] -ATP lösning var 171,97 CPM / pmol ATP. Dessa data kan alla genereras i en enda dag med användning av det förfarande som vi har beskrivit.

/55129/55129fig1.jpg "/>
Figur 1: Ponceau S färgning av ett nitrocellulosamembran. Ponceau fläck visar kinas bunden till nitrocellulosamembranet. Membranet sågs med reaktioner innehållande olika koncentrationer av ATP, men konstant kinas koncentration. Inget protein detekteras i no-kinaskontrollpunkter (4: e och 8: e raden). Ponceau S färglösningen var sammansatt av 0,1% Ponceau S (vikt / volym) i 5% ättiksyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: fluorografi resultat. Skannad bild av en fosforskärm som hade utsatts för ett nitrocellulosamembran. Membranet sågs med reaktioner innehållande constant kinaskoncentration, och olika koncentrationer av ATP. Varje koncentration analyserades i triplikat. Vid varje koncentration, var en ingen kinas kontroll ingår (4: e och 8: e raden) för att visa att radiomärkt ATP helt bort från membranet under tvättsteget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: scintillationsräkning data. A) Dubbel ömsesidig handlingen i autofosforylering av histidin kinas. Substratet-beroendet kurva genererades från scintillationsräkning. Phosphohistidine bildning beräknades med hjälp av lutningen i figur 3B (CPM / pmol ATP), som också genererades med fmintillation spektrometri. B) Standardkurva för CPM / pmol av ATP. Lutningen används för att beräkna mängden phosphohistidine (pmol) närvarande i varje prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nitrocellulosabindningsanalysen vi har beskrivit har många fördelar jämfört med tidigare använda metoder för att karakterisera histidin kinaser. I jämförelse med traditionella SDS / PAGE-baserade autoradiografi, är vår metod högre kapacitet och mindre tidskrävande. Nitrocellulosamembranet är lättare att hantera än SDS-geler, och behöver inte vara fast. Ponceau färgning av nitrocellulosa möjliggör protein platser att synliggöras. Detta ger ett enkelt sätt att skära ut varje plats för scintillationsräkning, och bestämma att proteinladdning är genomgående i alla fläckar. Scintillationsräkning av varje fläck ger noggranna resultat som lätt kan omvandlas till reaktionshastigheten med hjälp av lutningen hos standardkurvan visas i figur 3B.

Även utsätta nitrocellulosamembranet till en lagringsfosforskärm lägger tid till den totala varaktigheten av försöket, erbjuder detta steg inblick i framgången för blotting. Vilken som helstavvikelser som märks i scintillationsräkning data kan potentiellt förklaras av den komplementära fosfor bilden. Om till exempel membranet inte tillräckligt tvättade, kommer fosfor bild avslöja denna information. Fluorografi av membranet rekommenderas för alla som planerar att använda denna analys, eftersom resultaten från detta steg kan vara en värdefull kompletterande information.

En annan signifikant fördel med denna analys är förmågan att generera data från scintillationsräkning. Skära ut varje enskild plats för scintillationsräkning är föredraget att använda bildbehandlingsprogram för att kvantifiera bandintensitet, såsom typiskt görs för PAGE-baserade analyser. Den övre gränsen och det dynamiska omfånget för detektering är mycket högre med scintillationsräkning. Generera en standardkurva för att bestämma CPM / pmol ATP gör det enkelt att beräkna graden av autofosforylering från rådata. Med användning av denna metod, har vi möjlighet att noggrant detekterapikomol fosforylerad produkt.

Trots de många fördelarna med att använda vår metod, är det inte utan sina begränsningar. Vår metod inte skilja mellan en-phosphohistidine och 3-phosphohistidine. Även phosphohistidine antikroppar kan användas för att skilja mellan dessa fosforylerade produkter har vår metod fortfarande fördelen av att använda tjerenkovstrålning att kvantifiera fosforylering. Tjerenkovstrålning ger ett stort dynamiskt omfång och hög övre detektionsgränsen. Beroende på den metod för detektering, med användning av antikroppar för att kvantifiera phosphohistidine bildning kan lida av en mindre övre gräns och dynamiskt område. Vår metod är också begränsad till att användas med renade proteiner, och kan inte användas för att detektera fosforylerade kinaser in vivo. Vår metod kräver radiomärkt substrat, vilket kan avskräcka labb som inte är utrustade för radioaktivitet. I slutändan är denna metod mest lämplig för laboratorier som redan är utrustade för att hanteraradioaktivitet, och är intresserad av en högre genomströmning och mindre tidskrävande alternativ till ofta använda SDS-PAGE tekniker för att studera histidin kinaser. De som studerar Ser / Thr / Tyr kinaser kan också finna denna metod för att vara användbar, trots den relativa förekomsten av alternativa metoder för att studera dessa proteiner.

Karakterisering av histidin kinaser har länge varit gäckande, trots framsteg i metoder för att kvantifiera andra typer av kinaser. Med denna analys kan vi börja att karakterisera dessa biologiskt relevanta ännu dåligt förstådda proteiner. Detta steg i metodik för att kvantifiera histidin kinas autofosforylering slutändan kommer att öka vår förståelse av tvåkomponents signalering i bakterier. Denna analys kommer att vara ett värdefullt verktyg när vi utforskar effekten av besläktade stimuli och protein-proteininteraktioner på histidin-kinasaktivitet i olika tvåkomponents signalvägar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Institutionen för utbildning genom Graduate stöd inom områden av nationellt behov program (P200A100044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphoric acid VWR AAAA18067-AP For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base RPI T60040-5000.0 Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride RPI P41000-2500.0 For kinase reaction buffer
Magnesium chloride RPI M24000-500.0 For kinase reaction buffer
Glycerol RPI G22020-4000.0 For kinase reaction buffer
5'-ATP Promega E6011 Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP Perkin Elmer NEG002Z250UC  6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus Bio-rad 1706545 For spotting reactions
Nitrocellulose Whatman 32-10401396-PK For spotting reactions
Ponceau S Sigma aldrich P3504-50G For staining nitrocellulose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
  2. Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, (2), 118-124 (2012).
  3. Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
  4. Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
  5. Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49, (5), 579-581 (1987).
  6. Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (15), 5891-5896 (2008).
  7. Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Biochemistry. 46, (48), 13677-13683 (2007).
  8. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
  9. Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7, (8), 626-633 (2000).
  10. Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32, (1), 145-156 (2007).
  11. Kee, J. -M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7, (1), 44-51 (2012).
  12. Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Biochemistry. 33, (25), 7917-7924 (1994).
  13. Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, (44), 41182-41190 (2001).
  14. Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162, (1), 198-210 (2015).
  15. Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465, (3), 331-337 (2015).
  16. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7, (72), 248-254 (1976).
  17. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
  18. Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131, (3413), 1608-1609 (1960).
  19. Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31, (6), 371-374 (1980).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics