Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Chemistry

En aptamer-baserad sensor för Unchelated gadolinium (III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    Den ökande betydelsen av magnetisk resonanstomografi (MRT) i klinisk diagnos, som begränsas av den inneboende känsligheten av tekniken, har resulterat i den snabba tillväxten av forskning om utveckling av nya gadoliniumbaserade baserade kontrastmedel (GBCAs) 1. GBCAs är molekyler som administreras för att förbättra bildkvaliteten, och de har typiskt den kemiska strukturen hos en trevärd gadolinium jon (Gd 3+) koordinerad till en flertandad ligand. Denna komplex är av avgörande betydelse som unchelated Gd 3+ är giftig; Det har varit inblandad i utvecklingen av nefrogen systemisk fibros hos vissa patienter med njursjukdom eller fel 2. Följaktligen detektera vatten fria jonen är avgörande för att garantera säkerheten för GBCAs. Närvaron av unchelated Gd 3+ i GBCA lösningar ofta är resultatet av en ofullständig reaktion mellan liganden och den jon, dissociering av komplexet, eller displacement av andra biologiska metallkatjoner 3.

    Bland de flera tekniker som för närvarande används för att bestämma närvaron av Gd 3+, som förlitar sig på kromatografi och / eller spektrometri rang störst när det gäller mångsidighet och användbarhet 4. Bland deras styrka är hög känslighet och noggrannhet, förmågan att analysera olika provmatriser (inklusive humanserum 5, urin och hår 6, avloppsvatten 7, och kontrastmedel formuleringar 8), och den samtidiga kvantifieringen av flera Gd 3+ komplex (en lista studier före 2013 beskrivs i en omfattande översyn av Telgmann et al.) 4. Den enda nackdelen är att flera av dessa metoder kräver instrumentering (såsom induktivt kopplad plasma-masspektrometri) 4 att vissa laboratorier inte kan få tillgång till. Inom ramen för nya GBCA upptäckt på forskning och proof-of-concept nivåer, arelatively mer praktiskt, snabbare och kostnadseffektiv spektroskopiska baserad metod (såsom UV-Vis absorption eller fluorescens) kan tjäna som ett värdefullt alternativ. Med dessa program i åtanke, var en fluorescerande aptamer-baserad sensor för vatten Gd 3+ utvecklats 9.

    Den aptamer (Gd-aptamer) är en 44-baser lång enkelsträngad DNA-molekyl med en specifik sekvens av baser som isolerades genom processen systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) 9. Att anpassa aptamer till ett fluorescerande sensor, är en fluorofor fäst till 5'-terminalen av strängen, som sedan hybridiseras med en utsläckande strängen (QS) via 13 komplementära baser (figur 1). QS är märkt med en mörk släckningsmolekyl vid 3-terminalen. I frånvaro av Gd 3+, sensorn (Gd-sensor), bestående av en 1: 2 molförhållande av Gd-aptamer och QS respektive, kommer att ha minimal fluorescens-emission på grund av to energiöverföring från fluoroforen till släckare. Tillsättning av vattenhaltig Gd 3+ kommer förskjuta QS från Gd-aptamer, vilket resulterar i en ökning av fluorescensemission.

    Figur 1
    Figur 1. Sensorn (Gd-sensor) som består av 44-baser lång aptamer (Gd-aptamer) taggade med fluorescein (en fluorofor) och 13-baser lång släckning strand (QS) taggade med DABCYL (en mörk släckare) . I frånvaro av unchelated Gd 3+, är fluorescensen hos sensorn minimal. Med tillsats av Gd 3+, inträffar förskjutning av QS och en ökning i fluorescensemission observeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Det finns för närvarande ett vanligt förekommande spektroskopiska-baserad metod för att upptäckaing vattenhaltig Gd 3+. Denna analys använder molekylen xylenolorange, som undergår en förskjutning i den maximala absorptionsvåglängden 433-573 nm vid kelatering till jonen 10. Förhållandet mellan dessa två absorbansmaxima kan användas för att kvantifiera mängden unchelated Gd 3+. Den aptamer sensorn är ett alternativ (kan även vara ett komplement) till xylenolorange analysen, eftersom de två metoderna har olika reaktionsbetingelser (såsom pH och sammansättningen av buffertlösningar som används), mål selektiviteter, linjära intervall av kvantifiering, och detekterings formerna 9.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    OBS: Molecular Biology Grade vatten används i alla buffert och lösningspreparat. Alla engångs rör (mikrocentrifugrör och PCR) och pipettspetsar är DNase- och RNas-fri. Kontakta materialsäkerhetsdatabladet (MSDS) för alla kemikalier före användning. Användning av lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) rekommenderas starkt.

    1. Framställning av aptameren Stamlösningar

    1. Köp 2 delar av polydeoxinukleotid kommersiellt. Beställa båda strängarna med rening via högupplösande vätskekromatografi (HPLC).
      Strand 1 (Gd-aptamer):
      5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
      Del 2 (QS):
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
    2. Lös varje sträng i vatten för att göra 100 pM individuella stamlösningar av Gd-aptamer och QS.
    3. Lagra dessa lösningar vid -20 ° C. Lösningarna är stabila hittills, i 3 år.
    4. För att minimera freeze-tiningscykler, lagra förrådslösningar i 10 fil alikvoter.

    2. Beredning av 2x Gd-sensor Lösning

    1. Bereda analysbuffert (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Justera pH till ~ 7,4 med NaOH och HCl och filtrera genom sterila engångsflaska toppfilter med 0,2 | j, m PES-membran. Lagra i sterila flaskor. Om filtreras och förvaras på rätt sätt (vid rumstemperatur), är bufferten stabil hittills under 2 år.
    2. Späd 1 mikroliter av Gd-aptamer stamlösning (från steg 1,2) och 2 mikroliter av QS stamlösning (från steg 1,2) i 497 mikroliter av analysbufferten. Blanda väl med hjälp av en virvel. Deras koncentrationer i 2x Gd-sensor lösning är 200 nm och 400 nm, respektive.
      OBS: volym 2x Gd-sensor lösning som framställts i detta steg är 500 mikroliter, vilket är tillräckligt för att testa sex - 7 olika koncentrationer av Gd 3+ för kalibreringskurvan och kontrastmedlet lösningar(Steg 3). Varje prov kommer att ge dubbla brunnar i en 384-brunnar.
      1. Justera volymen av 2x Gd-sensor lösning enligt antalet Gd 3+ lösningar som måste testas.
    3. Överför 2x Gd-sensor lösning i 9 PCR-rör, med 50 mikroliter till varje rör. Placera rören i en termocykelapparat.
    4. Ställa in programmet i värmecykel att värma lösningen i rören till 95 ° C, håll under 5 min, och sedan långsamt kyla lösningarna till 25 ° C under ~ 15 min (med en hastighet av ~ 0,05-0,1 ° C / s). Den värme och kyla cykeln är att säkerställa optimal hybridisering mellan Gd-aptamer och QS. Partiella hybridiseringsresultat i ofullständig härdning och en högre bakgrundsfluorescens av sensorn. Om en anordning för cyklisk värmebehandling inte är tillgänglig, utföra denna process med användning av ett varmvattenbad i stället.
    5. När svalnat till 25 ° C, omedelbart använda lösningen, eller hålla i termocyklern (upp till ca 2 h) tills den ska varaBegagnade. När ett vattenbad används för uppvärmning, lämnar rören i badet som vattnet kyls långsamt till rumstemperatur.

    3. Konstruera Fluorescens kalibreringskurvan och att detektera närvaron av Unchelated Gd 3+ i en lösning av Gd kontrastmedel

    1. Upplösa GdCl 3 fast ämne i analysbufferten (samma buffert som i steg 2,1).
    2. Genom serieutspädning, förbereda 100 mikroliter vardera av 6 olika Gd 3+ lösningar i mikrocentrifugrör dubbelt av de slutliga önskade koncentrationerna för kalibreringskurvan (2x lösningar).
      1. Till exempel, för att konstruera en kalibrering för 0 (endast buffert utan GdCl 3), 50, 100, 200, 400, och 800 nM Gd 3+, bereds lösningar som innehåller 0, 100, 200, 400, 800, och 1600 nM av jonen. Se till att alltid inkludera "tomt" med 0 nM Gd 3+ som den negativa kontrollen.
    3. Lös kontrastmedlet att vara proved i analysbufferten. Förbered 2 eller 3 olika koncentrationer av kontrastmedlet lösningar via serieutspädning.
      OBS: Testning 3 olika koncentrationer av kontrastmedlet lösning rekommenderas. Detta för att säkerställa att dessa koncentrationer är inom det linjära området. Om de testade inte visa ett linjärt förhållande prover, minska koncentrationerna av kontrastmedlet som används.
    4. Ta PCR-rören innehållande 2x Gd-sensor lösning från steg 2.5 av termocyklern.
    5. Tillsätt 50 mikroliter av varje Gd 3+ lösning från steg 3,2 till 6 av de 9 PCR-rör innehållande 2x Gd-sensor lösning. Blanda genom att pipettera upp och ner. Varje PCR-rör innehåller nu den önskade koncentrationen av Gd 3+ som skall testas, 100 nM Gd-aptamer, och 200 nM-QS.
    6. Till de återstående PCR-rören innehållande 2x Gd-sensorlösning, tillsätt 50 | il av kontrastmedlet lösningarna från steg 3,3. Blanda väl genom att pipettera upp och ned några gånger.
    7. Inkubera solutions i PCR-rören för cirka 5 minuter vid rumstemperatur. Kan de lämnas att stå i upp till 30 minuter.
    8. Överför 45 mikroliter av varje rör till en 384-brunnar. Varje PCR-rör ger dubbla brunnar.
    9. Spela in fluorescensen av varje brunn på en platta-läsare. Fluoroforen (FAM) som används i Gd-sensordesign har excitation och emissionsmaxima av 495 och 520 nm respektive, som anges på leverantörens webbplats. Välja lämpliga excitations- och emissionsvåglängder eller filter, beroende på om det plattläsaren är monochromator- eller filterbaserad.
    10. Upprätta en kurva av fluorescens i godtyckliga fluorescensenheter (AFU) mot koncentration av Gd 3+.
    11. Rita grafen som fluorescens faldig förändring mot koncentration av Gd 3+. Beräkna fluorescens faldig förändring genom att dividera AFU av varje koncentration av AFU av "tomma" lösning (med 0 nM Gd 3+). Fluorescens faldig förändring kommer att möjliggöra normalization av resultaten bör AFU visa vissa periodiska (olika dagar, etc.) variationer.
    12. Jämföra fluorescensemissionen av lösningen innehållande kontrastmedlet och den "tomma", som är den lösning innehållande 0 nM GdCl 3 (endast buffert).
      ANMÄRKNING: En högre fluorescens av GBCA lösningen innebär närvaron av unchelated Gd 3+, vilket kan kräva ytterligare rening av kontrastmedlet. Mängden unchelated Gd 3+ närvarande kan uppskattas med hjälp av kalibreringskurvan i steg 3,10 eller 3,11.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ett typiskt fluorescensförändring av Gd-sensorlösning i närvaro av unchelated Gd 3+ visas i figur 2. Utsläppen kan ritas som förändringen fluorescens gånger (figur 2A) eller råfluorescensavläsning (Figur 2B) i godtyckliga enheter (AFU). Båda tomter ger mycket likartade kalibreringskurvor med en linjärt område för koncentrationer av Gd 3+ under 1 pm och mättnad av signalen vid> 3 M. Detektionsgränsen är ~ 100 nM med ett signal-brus 3.

    I lösningar innehållande GBCA av intresse, kommer närvaron av unchelated Gd 3+ översättas till en fluorescensökning av sensorn jämfört med "tomma" lösning. Fluorescensförändringar lösningar av 2 olika satser av Gd-DOTA komplexet, en med högre renhet än den andra, är shown Som exempel på representativa resultat (Figur 3). Gd-DOTA (gadoteric syra) är ett gadoliniumkomplex av Gd 3+ omges av en organisk ligand DOTA som finns i en kommersiell kontrastmedlet. Satsen av högre renhet visar inte en betydande ökning av utsläpp upp till 20 mM Gd-DOTA. När unchelated Gd 3+ är närvarande, är en förändring som märks även på Gd-DOTA koncentrationer under 5 mM observerades. I detta exempel där datapunkterna plottas som fluorescens-faldig förändring av sensorn, kan kvantifiering av mängden unchelated Gd 3+ uppskattas med hjälp av kalibreringskurvan i figur 2A.

    figur 2
    Figur 2. Representativa Gd-sensor fluorescens kalibreringskurva tomter. Alla datapunkter utfördes åtminstone i duplikat och medelvärdena tomtenTed med standardavvikelse som felstaplar. (A) En kalibreringskurva som erhållits med användning av 100 nM Gd-aptamer och 200 nM QS. Grafen ritas med fluorescens faldig förändring som y-axeln. (B) Samma kalibreringskurva som i (A) med rå fluorescens i godtyckliga enheter (AFU) som y-axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3. Representant Gd-sensor fluorescens förändring när man testar närvaron av unchelated Gd 3+ i prover av Gd-DOTA-molekylen. Två olika satser av Gd-DOTA komplexa lösningar visas i denna kurva, en av högre renhet (cirkel markör) och den andra innehåller unchelated Gd 3+ (blå triangle markör). Varje datapunkt är ett genomsnitt av två avläsningar med standardavvikelse enligt de felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Med hjälp av aptamer-baserade Gd-sensor, en ökning av fluorescensemission som är proportionell mot koncentrationen av unchelated Gd 3+ observeras. Att minimera mängden använt prov kan analysen köras i en 384-brunnars mikroplatta med en total provvolym av 45 | il per brunn. I denna design, var valet av fluorescein (FAM) och DABCYL (Dab) huvudsakligen baserade på kostnaden för reagenser, att ändra emissionsvåglängd, en annan parning av fluorofor och quencher kan användas 11.

    Det är viktigt att notera att för att erhålla det bästa resultatet med sensorn, ett av de kritiska stegen är upphettning till 95 ° C och långsam kylning (steg 2,4) i analysbufferten för att uppnå optimal hybridisering mellan Gd-aptamer och QS strängar. Som tidigare nämnts i protokollet, om en termisk cykelanordning inte finns tillgänglig, inkubationen vid 95 ° C kan utföras i ett vattenbad. En annan viktig parameter för att styra är tHan kompositioner av buffertlösningar; användning av analysbufferten som anges i steg 2,1 för upplösning av kontrastmedlet rekommenderas, eller avjoniserat vatten kan även användas. Dock bör lösningar som innehåller potentiella störande undvikas. Ett exempel på en sådan buffert är en som innehåller fosfatanjoner, som kan koordinera till unchelated Gd 3+ att bilda olösliga gadolinium fosfat 12. Fällningen kommer inte reagerar med sensorn, vilket resulterar i ett falskt negativt resultat.

    Några steg i de experiment kan modifieras utan att påverka resultatet. Först, för att förenkla analysen och beräkningen, förbereda både Gd-sensor-lösning och den vattenhaltiga GdCl 3 i kalibreringskurvan vid 2x koncentrationer. Om så önskas, kan andra utspädningsfaktorer som skall användas (t.ex. 10x lösningar), under förutsättning att de slutliga analyskoncentrationer av Gd-aptamer och QS hålles vid 100 nM och 200 nM, respektive. För det andra, analysbufferten does inte vara exakt pH 7,4. Vilket som helst värde mellan 7-7,4 kommer att ge den önskade fluorescensökning, så länge som samma buffert används under hela experimentet. För det tredje, när läsningen fluorescensemissions erhålls datapunkterna kan plottas antingen som råvara fluorescens i godtycklig enhet (AFU) eller som fluorescens faldig förändring. För att beräkna fluorescens faldig förändring är den råa fluorescens läsning av varje koncentration normaliserad till (delat med) läsningen av den negativa kontrollen (0 nM Gd 3+). Såsom visas i figurerna 2A och B, de fluorescensemissions trender i båda tomter är nästan identiska. Vecket förändring kan vara ett mer bekvämt sätt att analysera data om plattläsare visar vissa variationer i rå värden som registrerats vid olika tidpunkter. Slutligen, om laboratoriet är utrustad med en fluorometer, men inte en plattläsare, varje datapunkt kan mätas med användning av en kyvett, i stället för en mikroplatta. Beroende på storlek oF tillgängliga kyvetter, kan volymerna av lösningarna som framställts i analysen behöva justeras.

    Den metod som rapporterats häri tillhandahåller ett alternativ till chromatographic- och / eller spektrometriska baserade tekniker för att detektera vattenhaltig Gd 3+. Jämfört med den senare, är mer begränsad i termer av känslighet, noggrannhet och förmåga för samtidig detektion av flera arter Gd-sensoranalys. Å andra sidan kräver den spektroskopiska-baserad sensor en instrumentering som möjligen kan vara mer lättillgänglig, kan utföras inom en kortare tidsperiod, och provberedningen är minimal. Kontrastmedlet kan helt enkelt löst i buffertlösningen, blandas med Gd-sensorlösning och fluorescensemissionen direkt mäts. Dessutom är sensorn kan upptäcka en mycket lägre koncentration av unchelated Gd 3+ än xylenolorange indikatorn (ca 2 tiopotenser skillnad mellan de två metoderna) och har enhögre selektivitet för Gd 3+ över flera andra biologiskt viktiga och övergångsmetalljoner 9.

    Det finns två nackdelar med denna analys som kan begränsa dess användning under vissa experimentella betingelser. En begränsning är att sensorn är inte specifikt för Gd 3+; den visar ett svar på andra lantanidjoner (såsom Eu 3 + och Tb 3+) 9. Men dessa är inte joner vanliga i kontrastmedel eller biologiska system och därmed deras inblandning är minimal. Den andra punkten att notera är att vid högre koncentrationer (över ~ 10 M) av Gd 3+, en gradvis minskning av fluorescensemission Gd-sensor observeras. Effekten av släckning av lantanidjoner är ett väldokumenterat fenomen 13 som också har använts som en teknik för att detektera och kvantifiera dem 14. Medan detta begränsar användbarheten av sensorn för mätning av höga koncentrationer av Gd 3+

    I detta arbete, har användningen av en lämplig fluorescens-baserad teknik för detektering av toxisk unchelated Gd 3+ i vattenlösning har beskrivits. Denna analys är avsedd för tidig utvärdering av gadolinium-baserade kontrastmedel renhet, speciellt under syntesen och formulering för försök in vitro. Med den nuvarande tillväxten av magnetisk resonanstomografi i diagnos, är ett ökande antal nya kontrastmedel kontinuerligt utformas och testas. Aptameren baserade Gd-sensorn kommer att underlätta denna utveckling genom att tillhandahålla ett medel för att snabbt detektera närvaron av sub-mikromolära koncentrationer av icke omsatt eller dissocierade Gd 3+ i vattenlösning vid omgivande pH. Eftersom sensorn visar korsreaktivitet med andra trivalenta lantanidjoner, kan dess tillämpningutvidgas till dessa forskningsområden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

    1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, (2), 158-166 (2013).
    2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37, (5), 508-515 (2010).
    3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36, (5), 1060-1071 (2012).
    4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
    5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43, (12), 817-828 (2008).
    6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 1050-1054 (2004).
    7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46, (21), 11929-11936 (2012).
    8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398, (7), 2987-2995 (2010).
    9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408, (15), 4121-4131 (2016).
    10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
    11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
    12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
    13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95, (4), 571-580 (2003).
    14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59, (8), 1122-1125 (1987).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter