मानव इन्फ्लूएंजा ए वायरस के संक्रमण का Zebrafish मॉडल का प्रयोग करना एंटीवायरल ड्रग्स स्क्रीन और विशेषताएँ मेजबान प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के लिए

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के मुताबिक, इन्फ्लूएंजा वायरस वयस्कों के 5-10% और सालाना बच्चों के 20-30% संक्रमित और गंभीर बीमारी के 3-5 लाख मामलों का कारण है और दुनिया भर में 1 अप करने के लिए 500,000 से मौत हुई है। इन्फ्लूएंजा के खिलाफ वार्षिक टीकाकरण बीमारी को रोकने के लिए सबसे अच्छा विकल्प रहते हैं। डब्ल्यूएचओ वैश्विक कार्य योजना जैसे प्रयासों का आदेश रुग्णता और मौसमी फ्लू के प्रकोप 2 के साथ जुड़े मृत्यु दर को कम करने के लिए और अधिक शक्तिशाली वैक्सीन रणनीतियों में मौसमी टीका उपयोग, टीका उत्पादन क्षमता, और अनुसंधान और विकास में वृद्धि हुई है। Neuraminidase अवरोधकों (जैसे Zanamivir और oseltamivir) की तरह एंटीवायरल दवाओं के कुछ देशों में उपलब्ध हैं और जब शुरुआत 3, 4, 5 के पहले 48 घंटे के भीतर प्रशासित, कम करने के लक्षणों में कारगर साबित किया है। वैश्विक प्रयासों के बावजूद, मौसमी इन्फ्लूएंजा की रोकथाम कहांtbreaks इस समय एक बड़ी चुनौती के रूप में इन्फ्लूएंजा वायरस प्रतिजनी बहाव अक्सर वायरस 6 के बदलते जीनोम के लिए अनुकूल करने के लिए मौजूदा क्षमताओं से अधिक बनी हुई है। वायरस के नए उपभेदों को निशाना वैक्सीन रणनीतियों अग्रिम में विकसित किया जाना चाहिए और कभी कभी उपभेदों के प्रकार है कि अंततः एक इन्फ्लूएंजा के मौसम में प्रबल में अप्रत्याशित परिवर्तन की वजह से बेहतर की तुलना में कम प्रभावी गाया जाता है। इन कारणों के लिए, एक स्पष्ट के संक्रमण से युक्त और मौत को कम करने के लिए वैकल्पिक चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने की जरूरत है। मेजबान वायरस बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के द्वारा, यह नया विरोधी इन्फ्लूएंजा दवाओं और सहायक उपचारों 7, 8 का विकास संभव हो सकता है।

मानव मेजबान इन्फ्लूएंजा ए वायरस (IAV) बातचीत जटिल है। मानव IAV संक्रमण के कई पशु मॉडल आदेश, समेत मेजबान वायरस बातचीत में जानकारी हासिल करने के लिए विकसित किया गया हैचूहों, गिनी सूअरों, कपास चूहे, हैम्स्टर, ferrets, और मकाक 9 हैैं। महत्वपूर्ण डेटा है कि मेजबान IAV गतिशीलता की समझ में वृद्धि की है प्रदान करने, प्रत्येक मॉडल जीव महत्वपूर्ण कमियां है कि जब मानव चिकित्सा में निष्कर्षों का अनुवाद करने का प्रयास विचार किया जाना चाहिए के पास। उदाहरण के लिए, चूहों, जो सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल हैं, आसानी से IAV प्रेरित संक्रमण के लक्षण जब मानव इन्फ्लूएंजा आइसोलेट्स 9 से संक्रमित विकसित नहीं है। इसका कारण यह है चूहों की कमी मानव इन्फ्लूएंजा के लिए प्राकृतिक tropism आइसोलेट्स के बाद से माउस उपकला कोशिकाओं मानव उपकला कोशिकाओं 10 पर व्यक्त α-2,6 सियालिक एसिड संबंधों के बजाय α-2,3 सियालिक एसिड संबंधों को अभिव्यक्त करता है। Hemagglutinin मानव IAV में मौजूद प्रोटीन कृपापूर्वक बाँध और असर रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis 9, 11 के माध्यम से α-2,6 सियालिक एसिड लिंकेज मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश आइसोलेट्स, 12, 13। एक परिणाम के रूप में, यह अब स्वीकार कर लिया है मानव इन्फ्लूएंजा के लिए माउस मॉडल विकसित करने में, देखभाल आदेश रोग phenotypes कि मानव बीमारी के पहलुओं पुनरावृत्ति को प्राप्त करने में इन्फ्लूएंजा की उचित तनाव के साथ माउस का उचित तनाव जोड़ी के लिए रखा जाना चाहिए कि। इसके विपरीत, ferrets के ऊपरी श्वसन तंत्र में उपकला कोशिकाओं α-2,6 सियालिक एसिड लिंकेज कि मानव कोशिकाओं 14 के समान होती है। Pathogenicity और मानव और एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस 14 की योग्यता, 15 सहित मानव रोग में मनाया रोग और नैदानिक विशेषताओं के कई संक्रमित ferrets का हिस्सा है। उन्होंने यह भी अत्यधिक टीका प्रभावकारिता परीक्षणों के लिए उत्तरदायी हैं। फिर भी, मानव इन्फ्लूएंजा के लिए भाल मॉडल है कि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण का अधिग्रहण कर मुख्यतः उनके आकार और पशुपालन की लागत से संबंधित कई नुकसान हैखिचड़ी भाषा चुनौतीपूर्ण डेटा। इसके अलावा, ferrets पहले दवा फार्माकोकाइनेटिक्स, जैव उपलब्धता, और विषाक्तता कि परीक्षण प्रभावकारिता मुश्किल बनाने में मतभेद प्रदर्शित किया है। उदाहरण के लिए, ferrets M2 आयन चैनल अवरोध amantadine से 16 विषाक्तता दिखा रहे हैं। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि मानव IAV संक्रमण के बारे में सवालों का अध्ययन करने के लिए एक पशु मॉडल को चुनने के लिए, यह महत्वपूर्ण है अपने निहित फायदे और सीमाएं, और मेजबान वायरस बातचीत है कि जांच के तहत के पहलू पर विचार करें।

Zebrafish, Danio rerio, एक पशु मॉडल है कि सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण की जांच के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी, और संभावित दवा के उपचारों 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, है <समर्थन वर्ग = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28। Zebrafish में कोशिकाओं की सतह पर α-2,6-लिंक्ड सियालिक एसिड की उपस्थिति IAV, जो संक्रमण के अध्ययन में वहन किया गया था और IAV 19 की एक फ्लोरोसेंट संवाददाता तनाव का उपयोग vivo में imaged करने के लिए अपनी संवेदनशीलता का सुझाव दिया। IAV संक्रमित Zebrafish में, एंटीवायरल ifnphi1 और MXA टेप की वृद्धि की अभिव्यक्ति संकेत दिया है कि एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित किया गया था, और विकृति शोफ और ऊतक विनाश सहित IAV संक्रमित zebrafish, द्वारा प्रदर्शित, मानव इन्फ्लूएंजा के संक्रमण में मनाया समान था । इसके अलावा, IAV एंटीवायरल neuraminidase अवरोध Zanamivir सीमित मृत्यु दर और zebrafish 19 में कम वायरल प्रतिकृति।

इस रिपोर्ट में, प्रणाली की शुरुआत करने के लिए एक प्रोटोकॉलzebrafish भ्रूण में आईसी IAV संक्रमणों में वर्णित है। एक सबूत के सिद्धांत के रूप में चिकित्सकीय प्रासंगिक खुराक पर Zanamivir का प्रयोग, एंटीवायरल गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग यौगिकों के लिए इस zebrafish IAV संक्रमण मॉडल की उपयोगिता प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, zebrafish में एक स्थानीय, उपकला IAV संक्रमण पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल मूत्राशय तैरना, एक अंग है कि संरचनात्मक और कार्यात्मक स्तनधारी फेफड़ों के 21, 29, 30, 31 के अनुरूप माना जाता है, में वर्णित है। इस स्थानीय IAV संक्रमण मॉडल का उपयोग करना, संक्रमण की साइट के लिए न्युट्रोफिल भर्ती लगाया जा सकता है, IAV संक्रमण और सूजन में न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान की भूमिका की जांच के लिए सक्षम करने से। ये zebrafish मॉडल मानव IAV संक्रमण की मौजूदा पशु मॉडल के पूरक हैं और छोटे अणुओं और बढ़ाया रों की संभावना की वजह प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैंtatistical शक्ति, उच्च throughput assays के लिए moderate- के लिए क्षमता, और क्षमताओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ प्रतिरक्षा सेल व्यवहार और समारोह को ट्रैक करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी काम जैव सुरक्षा स्तर 2 (या BSL2) रोग नियंत्रण (सीडीसी) के लिए और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा स्थापित निर्देशों के अनुसार अमेरिकी केंद्र द्वारा वर्णित मानकों का प्रयोग किया जाना चाहिए। सुरक्षा और अनुपालन सुनिश्चित करने के लिए उचित अधिकारियों के साथ प्रदान करें।

1. Zebrafish की देखभाल और रखरखाव

  1. zebrafish अंडे और प्रयोगों के लिए भ्रूण की अपेक्षित संख्या में एकत्र। जब आवश्यक हो, बड़े पैमाने पर प्रजनन टैंक, Adatto एट अल द्वारा वर्णित उन लोगों की तरह। 32, विकासात्मक मंचन भ्रूण की बड़ी संख्या को इकट्ठा करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
  2. भ्रूण कम घनत्व पर गहरी पेट्री डिश में वांछित विकास मंच (एक प्रणालीगत IAV संक्रमण [धारा 3] या 5 दिन बाद निषेचन एक स्थानीय, तैरना मूत्राशय के संक्रमण के लिए के लिए 48 घंटे के बाद निषेचन [धारा 4]) (जब तक विकसित करने के लिए अनुमति दें < 6 युक्त बाँझ अंडे पानी में 100 भ्रूण / पकवान) 28 डिग्री सेल्सियस पर0 माइक्रोग्राम / एमएल समुद्री नमक (जैसे, त्वरित महासागर) आसुत जल में।
    1. प्लास्टिक हस्तांतरण pipets के साथ मृत भ्रूण को निकालें और अंडे पानी दैनिक बदलने इष्टतम स्वास्थ्य और विकास को सुनिश्चित करने के लिए।

2. सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एक 4 मिलीग्राम / एमएल शेयर Tricaine-एस की आसुत जल और आटोक्लेव में समाधान (7.0-7.4 पीएच को समायोजित) तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. एक micropipette खींचने का उपयोग तंतु साथ borosilicate ग्लास केशिकाओं खींचो (निम्न सेटिंग्स के साथ जैसे micropipette डांड़ी: दबाव सेटिंग = 100, गर्मी = 550, पुल = [का कोई मूल्य नहीं], वेग = 130, समय = 110)।
    नोट: सुई trimming करने से पहले, जहां सुई सुई की नोक से घटना शुरू होता है से लंबाई लगभग 12-15 मिमी होगा। यह भिन्न हो सकते हैं, हालांकि, वरीयता और आवेदन के आधार पर। एक लंबी, अधिक क्रमिक शंकु क्योंकि भ्रूण बेध करने के लिए वृद्धि की क्षमता और कम आरआई के और अधिक बेहतर हो सकता हैसुई झुकने या तोड़ने के एस।
  3. एक माइक्रोवेव का उपयोग कर 100 मिलीलीटर पानी में अंडे agarose के 2 जी पिघला। जिस पर अप लाइन और गहरी पेट्री डिश में agarose पिघल गए और यह जमना करने की इजाजत दी गिरने से भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए प्लेटों बनाओ।
  4. nuclease मुक्त पानी में Zanamivir की एक 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर करें। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  5. भ्रूण agarose बढ़ते बनाने के लिए एक माइक्रोवेव का उपयोग कर पिघल 50 मिलीलीटर पानी में अंडे की 0.5 ग्राम agarose। 50 डिग्री सेल्सियस तैयार है जब तक पर नहाने के पानी में बनाए रखने के लिए इमेजिंग के दौरान उपयोग करने के लिए।

3. प्रणालीगत IAV संक्रमण (48 घंटा बाद निषेचन)

चेतावनी: सभी अनुसंधान कर्मियों अपने पर्यवेक्षकों और टीकाकरण IAV के साथ काम शुरू करने से पहले के बारे में चिकित्सकों के साथ परामर्श करना चाहिए।

  1. मैन्युअल प्रयोग # 5 संदंश का उपयोग करने के दिन पर भ्रूण Dechorionate। हटाने और भ्रूण कि 200 माइक्रोग्राम / एमएल Tricaine समाधान में प्रक्रिया में घायल हो गए euthanize लिए ध्यान रखना।
  2. तैयारी ओMicroinjection के लिए एफ IAV
    नोट: उपभेदों कि zebrafish भ्रूण संक्रमित करने के लिए दिखाया गया है इन्फ्लूएंजा ए / पीआर / 8/34 (H1N1) (APR8), इन्फ्लूएंजा एक एक्स-31 ए / आइची / ​​68 (H3N2) (एक्स-31), और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर हैं इन्फ्लूएंजा तनाव NS1-GFP 33। APR8 और एक्स-31, और अन्य नस्लों के बारे में विवरण, इन्फ्लुएंजा अनुसंधान डेटाबेस पर पाया जा सकता है
    1. Embryonated चिकन अंडे में IAV की NS1-GFP तनाव प्रचार के रूप में पहले 34, 35 में वर्णित है। लीजिए, विभाज्य, और -80 डिग्री सेल्सियस पर IAV युक्त द्रव्य, और दुकान अनुमापांक। पूर्व titered APR8 और एक्स-31 वायरस व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है।
      1. बस संक्रमण से पहले, तेजी से दस्ताने हाथ में एक IAV विभाज्य पिघलना और फिर जल्दी से बर्फ पर जगह अनुमापांक के नुकसान को कम करने के लिए।
    2. वायरल कमजोर पड़ने
      1. APR8 या एक्स-31 वायरस का उपयोग करते हैं, तो 3.3 x 10 6 अंडे संक्रामक खुराक 50% (EID50) को पतला बाँझ, ठंडा पीबीएस supplem में / मिलीलीटरसाथ 0.25% फिनोल लाल ented एक लामिना का प्रवाह हुड में (दृश्य में सहायता करने के लिए)। इसके साथ ही साथ 0.25% फिनोल लाल बाँझ पीबीएस युक्त एक नियंत्रण की स्थापना की।
      2. NS1-GFP तनाव 33 का उपयोग करते हैं, ~ 1.5 एक्स 10 2 बाँझ, ठंडा पीबीएस युक्त 0.25% फिनोल लाल रंग में पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) nl प्रति एक लामिना का प्रवाह हुड में (दृश्य में सहायता करने के लिए) के लिए पतला। इसके साथ ही साथ 0.25% फिनोल लाल बाँझ पीबीएस में वायरस की तरह पतला असंक्रमित चिकन अंडे से द्रव्य युक्त एक नियंत्रण की स्थापना की।
      3. बर्फ पर IAV बनाए रखने के इस्तेमाल के लिए तैयार है जब तक।
    3. microloader सुझावों के बस का उपयोग करने से पहले का उपयोग कर microinjection सुइयों में pipet वायरस समाधान। इंजेक्शन तंत्र (जैसे MPPI -3 दबाव इंजेक्शन प्रणाली) का उचित धारक में microinjection सुई डालें।
    4. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे देखते समय, धीरे तेज, निष्फल # 5 संदंश के साथ microinjection सुई टिप क्लिप।
      नोट: यह सिफारिशों हैदेद कि microinjection टिप धीरे-धीरे काटा जा सकता है।
    5. दबाव इंजेक्शन प्रणाली के पैर पेडल दबाना और एक अंशांकन माइक्रोमीटर स्लाइड पर खुर्दबीन के विसर्जन के तेल की एक बूंद में इंजेक्षन। बूंद के व्यास उपाय। , समीकरण का उपयोग बूंद की मात्रा की गणना वी = 4 / 3πr 3, जहां वी nl में मात्रा है और आर माइक्रोन में त्रिज्या है।
      नोट: बूंद व्यास बहुत छोटा है, तो अतिरिक्त गिलास काटा जा सकता है या दबाव और समय सेटिंग्स समायोजित किया जा सकता है। अगर बूंद व्यास बहुत बड़ी है, दबाव और समय सेटिंग्स समायोजित किया जा सकता है।
    6. दबाव इंजेक्टर पर दबाव और समय सेटिंग्स समायोजित करें और / या सुई की नोक reclip जब तक वांछित इंजेक्शन की मात्रा हासिल की है (आम तौर पर 1-3 NL)। 40 और 80 मिसे के बीच 20 और 30 साई और पल्स अवधि सेटिंग के बीच दबाव सेटिंग्स विशिष्ट हैं। दबाव वापस समायोजित इतना है कि यह केशिका दबाव काउंटरों लेकिन IAV (नेट शून्य दबाव) लीक नहीं करता है।
  3. इंजेक्शन के लिए भ्रूण संरेखित
    1. 200 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine में Dechorionated भ्रूण anesthetize।
    2. एक बार जब आंदोलन खत्म होता है, एक प्लास्टिक विंदुक के साथ एक 2% agarose प्लेट (धारा 2.3 में तैयार) को 10-20 भ्रूण हस्तांतरण। प्लास्टिक पिपेट का उपयोग अतिरिक्त तरल हटा दें।
    3. धीरे से एक आग पॉलिश और सील borosilicate ग्लास केशिका साथ microinjection के लिए भ्रूण संरेखित। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप धीरे ओरिएंट भ्रूण का उपयोग है, ताकि कुवियर की वाहिनी या पीछे कार्डिनल नस microinjection सुई (चित्रा 1 ए) के साथ कतार में है।
  4. IAV Microinjection
    1. धीरे कुवियर की वाहिनी या पीछे कार्डिनल नस में microinjection सुई डालें। पैर पेडल दबाना भ्रूण (चित्रा 1 ए) के संचार प्रणाली में IAV की वांछित मात्रा इंजेक्षन करने के लिए। भ्रूण एक से अधिक बार इंजेक्शन जा सकता है यदि आवश्यक है।
      नोट: इंजेक्शन सांस परिसंचरण और distrib में बह जाना चाहिएपूरे शरीर में uted। इंजेक्शन की मात्रा इंजेक्शन के स्थल पर एकत्र करते हैं, प्रयोग और euthanize से भ्रूण को हटा दें।
    2. नियंत्रण समाधान चुना वायरस के तनाव के लिए विशिष्ट के साथ अलग अलग भ्रूण पर इंजेक्शन दोहराएँ। APR8 और एक्स-31 के लिए, खंड 3.2.2.1 में वर्णित नियंत्रण का उपयोग करें; NS1-GFP के लिए, खंड 3.2.2.2 में वर्णित नियंत्रण का उपयोग करें।
  5. 33 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ अंडे पानी और इन्क्यूबेटरों में जगह युक्त लेबल पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण भ्रूण।
    नोट: संक्रमित भ्रूण बढ़ाया वायरल प्रतिकृति का समर्थन करने के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर विकसित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, 33 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन और अधिक बारीकी से मानव ऊपरी श्वास नलिका, जो बाहरी वातावरण में कम तापमान के साथ निकट संपर्क में है और वह जगह है जहाँ IAV में संक्रमण होने का तापमान mimics। भ्रूण एक व्यापक तापमान रेंज 34 के लिए acclimate कर सकते हैं।

4. स्थानीय, टीजी में तैरना मूत्राशय IAV संक्रमण (MPX: mCherry)

  1. Microinjection के लिए IAV की तैयारी
    1. धारा 3.2 में वर्णित के रूप में NS1-GFP तनाव और नियंत्रण इंजेक्शन समाधान पतला।
    2. धारा 2.2 में वर्णित के रूप में सुइयों तैयार करें।
    3. संरेखित टीजी (MPX: mCherry) 35 फुलाया तैरने मूत्राशय युक्त निम्नलिखित अपवाद के साथ खंड 3.3 में वर्णित के रूप में लार्वा। इस तरह है कि सुई तैरना मूत्राशय छेद कर सकते हैं और वायरस, तैरना मूत्राशय के पीछे में जमा किया जा सकता, जैसा कि पहले 36 (2A चित्रा) में वर्णित में लार्वा संरेखित करें।
  2. IAV Microinjection
    1. धीरे तैरना मूत्राशय में microinjection सुई डालने और संरचना (2A चित्रा) के पीछे की ओर वांछित मात्रा (5 जैसे nl) इंजेक्षन।
      ध्यान दें: इंजेक्शन सांस में पीछे की ओर इकट्ठा करना चाहिए और तैरने मूत्राशय की हवा बुलबुला ख चाहिएई आगे विस्थापित। GFP अभिव्यक्ति 3 घंटा के बाद इंजेक्शन पर देखा जा करने के लिए शुरू करना चाहिए।
    2. नियंत्रण समाधान, चुने हुए धारा 3.4.2 में वर्णित के रूप में वायरस के तनाव के लिए विशिष्ट साथ दोहराएँ इंजेक्शन।
  3. 33 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ अंडे पानी और इन्क्यूबेटरों में जगह युक्त पेट्री डिश के लिए लार्वा स्थानांतरण।

5. एंटीवायरल दवा उपचार

नोट: नीचे प्रोटोकॉल पहले गेबर एट अल में दिखाया गया Zanamivir उपचार का वर्णन है। 19। इस प्रोटोकॉल अन्य एंटीवायरल दवाओं स्क्रीन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और संभावित एक 96 अच्छी तरह से थाली, उच्च throughput प्रारूप में कई यौगिकों स्क्रीन करने के लिए संशोधित किया जाना है।

  1. 3 घंटा के बाद संक्रमण पर, 0, 16.7, 33.3 और एनजी / एमएल Zanamivir युक्त बाँझ अंडे पानी के साथ NS1-GFP- के अंडे पानी और नियंत्रण से संक्रमित मछली की जगह।
    नोट: ये सांद्रता के लिए हासिल की शारीरिक स्तर को दोहराने के लिए प्रयास करने के लिए आदेश में चुने गए हैंमानव रोगियों (100, 200, या 600 मिलीग्राम, चतुर्थ, दिन में दो बार या 10 मिलीग्राम साँस, दिन में दो बार) में Zanamivir की llowing प्रशासन। मानव रोगियों में सीरम सांद्रता 9.83 से 45.3 एनजी / एमएल 36 तक बताया गया।
  2. 5 दिनों के दौरान, अंडा पानी हर 12 घंटा बदलने के लिए और Zanamivir की उचित मात्रा युक्त बाँझ अंडे पानी के साथ बदलें।
  3. संक्रमण के पाठ्यक्रम ट्रैक।
    1. 200 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine में zebrafish anesthetize। नेत्रहीन IAV संक्रमित और नियंत्रण के बीच मछली और मछली दवाओं के विभिन्न सांद्रता में डूबे बीच संक्रमण पैटर्न में मतभेद का निरीक्षण करने के लिए स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP अभिव्यक्ति की निगरानी।
    2. 5 दिनों के पाठ्यक्रम पर रुग्णता और मृत्यु दर को ट्रैक।
      1. सुस्ती के संकेत और सूजन के सबूत, रंजकता में मतभेद, नेत्र और craniofacial विकृति, और अग्रकुब्जता सहित रोग विकृति से संबंधित संक्रमण गतिशीलता, के बारे में रिकार्ड टिप्पणियों। रोग विकृतिआमतौर पर, 24-48 घंटा के बाद इंजेक्शन पर नियंत्रण संक्रमित मछली में स्पष्ट हो जाता है वायरस की राशि इंजेक्शन पर निर्भर करता है। छवियों 24 घंटे बाद इंजेक्शन ले लीजिए।
      2. 5 दिनों के बाद संक्रमण के लिए हर 24 घंटा, मृत रुग्ण, और स्वस्थ लार्वा की संख्या रिकॉर्ड है। मौत एक नमूदार दिल की धड़कन की अनुपस्थिति से परिभाषित किया गया है। वांछित के रूप में डेटा प्लॉट। उदाहरण के लिए, स्वस्थ, रुग्ण, या मरी हुई मछलियों के प्रतिशत के साथ एक खड़ी बार ग्राफ के रूप में भूखंड डेटा, एक्स-अक्ष पर y अक्ष और इलाज के समूह पर साजिश रची। 19
        नोट: मौत कापलान Meier अस्तित्व अनुमानों से रन बनाए जा सकते हैं। आवेदन के आधार पर, यह स्कोरिंग मछली रुग्णता के लिए वैकल्पिक तरीकों, एक स्कोरिंग मैट्रिक्स है कि रुग्णता की डिग्री मनाया ऊपर उल्लिखित रोग विशेषताओं के आधार पर यों सहित विकसित करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।
      3. एक सांख्यिकीविद् के साथ परामर्श उचित सांख्यिकीय विश्लेषण लागू करने के लिए।

6। न्युट्रोफिल प्रवासन

नोट: नीचे प्रोटोकॉल तैरना मूत्राशय के लिए न्युट्रोफिल प्रवास पर नज़र रखने के लिए एक स्थानीय, उपकला IAV संक्रमण के बाद के लिए एक विधि का वर्णन है। वर्णित विधियों आनुवंशिक और रासायनिक जोड़तोड़ के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करना, यह एक IAV संक्रमण के दौरान तंत्र न्यूट्रोफिल व्यवहार अंतर्निहित को चिह्नित करने के लिए संभव हो जाएगा।

  1. इमेजिंग के लिए Zebrafish बढ़ते
    1. असंवेदनता लार्वा 200 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine में imaged किया जा सके।
    2. अंडे पानी (~ 50-100 μl) की एक छोटी छोटी बूंद में लार्वा कि अच्छी तरह से एक 24 साल की एक अच्छी तरह से करने के लिए NS1-GFP के साथ संक्रमित किया गया है, कांच के नीचे की थाली: एक व्यक्ति टीजी (mCherry MPX) हस्तांतरण। अन्य IAV संक्रमित और नियंत्रण मछली के साथ दोहराएँ।
    3. धीरे धीरे, प्रत्येक अच्छी तरह से (धारा 2.5) को 1% agarose भ्रूण बढ़ते मीडिया जोड़ने ख्याल रखने के बड़े बुलबुले परिचय नहीं।
      1. धीरे लार्वा की स्थिति को समायोजित इतना है कि यह उसकी तरफ से मुहिम शुरू की है।गुडी और हेनरी 37 कैसे जांच जो कीट पिन कि तंतु साथ borosilicate ग्लास केशिकाओं में मुहिम शुरू की है और जगह में superglued रहे हैं का उपयोग इस आवेदन में अच्छी तरह से कार्य करने के लिए का वर्णन है।
    4. एक बार agarose मज़बूत बनाता है, धीरे 200 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine युक्त अंडे पानी के साथ अलग-अलग कुओं भरें।
    5. एक confocal खुर्दबीन के साथ, एक 20x उद्देश्य का उपयोग brightfield और प्रतिदीप्ति छवियों के ढेर श्रृंखला AZ कब्जा तैरना मूत्राशय पर जोर दिया।
      1. ऊपरी और निचले सीमा सेट करें ताकि वे सभी दिख नमूदार हरे और लाल प्रतिदीप्ति कब्जा।
      2. कदम है कि ≤ 4 माइक्रोन रहे हैं के साथ 2.0 μsec / पिक्सेल पर छवियों पर कब्जा। पिक्सेल प्रति समय बढ़ रही है और कदम के बीच की दूरी को कम करने के लिए (जैसे 0.5 - 1.0 माइक्रोन) चित्र संकल्प और गुणवत्ता बढ़ जाती है।
      3. परतों के विलय से एक दो आयामी छवि उत्पन्न करता है।
      4. MPX-mCherry पॉजिटिव न्यूट्रोफिल वर्तमान मैं की संख्या की तुलना करेंn IAV संक्रमित और नियंत्रण इंजेक्शन zebrafish की तैरना मूत्राशय।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इधर, दिखा कैसे zebrafish में प्रणालीगत IAV संक्रमण दवा प्रभावकारिता (चित्रा 1 ए) का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता डेटा प्रदान की जाती हैं। 48 घंटा बाद निषेचन में भ्रूण एक वायरल संक्रमण आरंभ करने के लिए कुवियर की वाहिनी के माध्यम से APR8 (आंकड़े 1C, 1F), एक्स-31 (आंकड़े -1 डी, 1G), या NS1-GFP (आंकड़े 1H-1 मैं) के साथ इंजेक्ट कर रहे हैं। 48 घंटा बाद निषेचन में भ्रूण की एक और पलटन वायरल संक्रमण (आंकड़े 1 बी, 1E) के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए इंजेक्शन थे। 48 घंटा के बाद संक्रमण, zebrafish इंजेक्शन IAV साथ पेरिकार्डियल शोफ (आंकड़े 1C, 1 डी) और संचार गिरफ्तारी (चित्रा 1F), पेरीकार्डियम (चित्रा 1G) के दौरान मौजूद एरिथ्रोसाइट्स साथ के सबूत का प्रदर्शन किया गया। NS1 GFP, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP की प्रारंभिक अभिव्यक्ति के रूप में जल्दी के रूप में 3 घंटा के बाद संक्रमण मनाया गया का उपयोग करना। उस बिंदु पर, zebrafish एक 33.3 एनजी से अवगत कराया गया/ Neuraminidase अवरोध Zanamivir मिलीलीटर खुराक। इस खुराक लगभग 200 मिलीग्राम मानव रोगियों को दी खुराक के बराबर है। नियंत्रण संक्रमित Zanamivir (आंकड़े 1H, 1h ') के संपर्क में नहीं मछली शोफ और प्रणालीगत GFP अभिव्यक्ति की सुविधाओं का प्रदर्शन किया। Zanamivir के संपर्क में NS1-GFP संक्रमित लार्वा में सकल विकृति और GFP प्रतिदीप्ति (आंकड़े 1 मैं, 1 मैं ') कम मनाया गया। GFP में कमी, लार्वा के शरीर में सबसे महत्त्वपूर्ण था, जबकि बहुत कम परिवर्तन की जर्दी थैलियों में मनाया गया। के रूप में बेहतर तैराकी गतिशीलता इसका सबूत है और दिल में कम सूजन के स्तर, और अस्तित्व में सुधार Zanamivir के साथ इलाज मछली, कम रुग्णता का प्रदर्शन किया। इन निष्कर्षों को एक अधिक व्यापक अध्ययन 19 के पूरक हैं और दवा स्क्रीनिंग के लिए इस मॉडल का मूल्य दिखा।

एक स्थानीय zebrafish तैरना मूत्राशय संक्रमण मॉडल 31 IAV infe के लिए अनुकूलित किया गया हैction। NS1-GFP वायरस 5 D बाद निषेचन टीजी (MPX: mCherry) के तैरने मूत्राशय में इंजेक्ट किया गया था लार्वा एक स्थानीय, उपकला संक्रमण (2A चित्रा) आरंभ करने के लिए। पीबीएस एक नियंत्रण IAV संक्रमित कोशिकाओं की ओर न्युट्रोफिल भर्ती की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के रूप में तैरने मूत्राशय में इंजेक्ट किया गया था। तैरना मूत्राशय में mCherry लेबल न्यूट्रोफिल की भर्ती लगाया गया था। 20 घंटा के बाद संक्रमण, पीबीएस इंजेक्शन नियंत्रण करने के लिए की IAV संक्रमित मछली रिश्तेदार तैरने मूत्राशय में न्यूट्रोफिल की काफी पलायन (आंकड़े 2 बी, 2 बी ', -2, -2') में मनाया गया। इन आंकड़ों IAV तैरना मूत्राशय के लिए न्यूट्रोफिल भर्ती कर सकते हैं कि, बस के रूप में यह मानव फेफड़ों को न्यूट्रोफिल रंगरूटों प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: एंटीवायरल दवा उपचार zebrafish में IAV संक्रमण की गंभीरता mitigates। (ए (बी - मैं) सकल विकृति और IAV साथ कुवियर की वाहिनी में इंजेक्शन zebrafish भ्रूण की GFP प्रतिदीप्ति। (बीजी) मछली IAV से संक्रमित और वायरल संक्रमण और रोग के लक्षण के लिए 48 घंटे के बाद संक्रमण पर जांच की। (बी - डी) नियंत्रण या IAV संक्रमित मछली की एकल फोकल विमानों एकत्र किए गए थे (पक्ष घुड़सवार, बाएँ पूर्वकाल, पृष्ठीय ऊपर, 4x बढ़ाई, पैमाने बार = 500 माइक्रोन)। (बी) के नियंत्रण मछली पीबीएस के साथ इंजेक्शन और सामान्य आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया गया। (सी - डी) भ्रूण APR8 (सी) या एक्स-31 (डी) से संक्रमित आमतौर पर प्रदर्शन किया पेरिकार्डियल शोफ (भरे तीर)। भ्रूण भी परिगलित ऊतक, (सी) में स्पष्ट था। (ई) नियंत्रण मछली पीबीएस के साथ इंजेक्शन और विकृति के कोई सबूत नहीं (पैमाने बार = 250 माइक्रोन) को प्रदर्शित किया गया। (एफ) APR8 से संक्रमित भ्रूण संचार गिरफ्तारी (नोकदार नोक, पैमाने बार = 250 माइक्रोन) प्रदर्शित करता है। (G) भ्रूण एक्स-31 इन्फ्लूएंजा प्रदर्शित करता है दोनों पेरिकार्डियल शोफ (तीर) और पेरीकार्डियम (नोकदार नोक, पैमाने बार = 100 माइक्रोन) के दौरान जमा एरिथ्रोसाइट्स के साथ इंजेक्शन। (एच, आई) IAV संक्रमित zebrafish (पैमाने बार = 200 माइक्रोन) पर एक एंटीवायरल दवा के प्रभाव दिखा प्रतिनिधि छवियाँ। (एच) brightfield और (एच ') एक भ्रूण NS1-GFP (कोई एंटीवायरल दवा उपचार) के साथ इंजेक्शन दिखा प्रतिदीप्ति छवि। सूचना है शोफ और विशेष रूप से आम कार्डिनल नस क्षेत्र में GFP अभिव्यक्ति। (मैं, मैं ') उपचार एक एंटीवायरल दवा के साथ संक्रमित कम होआयन, के रूप में कम सूजन, और शरीर के सफेद धराशायी रूपरेखा के भीतर कम GFP अभिव्यक्ति, विशेष रूप से वाहिका, जो कम वायरल बोझ का संकेत है में सहित कम हो पैथोलॉजी, इसका सबूत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: न्यूट्रोफिल स्थानीय IAV संक्रमण की साइटों के लिए भर्ती कर रहे हैं। (ए) योजनाबद्ध इंजेक्शन 5 D बाद निषेचन में एक फुलाया zebrafish तैरना मूत्राशय में एक स्थानीय IAV संक्रमण आरंभ करने की जरूरत दृष्टिकोण का प्रदर्शन है। (बी, सी) न्युट्रोफिल तैरना मूत्राशय NS1-GFP संक्रमण के बाद भर्ती करने के लिए। जेड ढेर छवियों (4 माइक्रोन कदम) confocal माइक्रोस्कोपी (20x बढ़ाई) द्वारा एकत्र किए गए थे। छवियाँ फ्लैट थेदो आयामों में tened (पक्ष घुड़सवार, बाएँ पूर्वकाल पृष्ठीय ऊपर)। टीजी (MPX: mCherry) zebrafish (5 घ बाद निषेचन) (बी, बी ') द्रव्य पीबीएस और 0.25% फिनोल लाल या (सी, सी से पतला') NS1-GFP के साथ इंजेक्शन थे (7.2 × 10 2 pfu / भ्रूण) के साथ 0.25% फिनोल लाल द्रव्य और पीबीएस में पतला। 16 घंटा के बाद संक्रमण में न्यूट्रोफिल एक IAV संक्रमित तैरना मूत्राशय में उपस्थित थे (सी, सी ': हरी प्रतिदीप्ति स्थानीय संक्रमण पता चलता है; सी': लाल कोशिकाओं न्यूट्रोफिल हैं, सफेद तीर प्रतिनिधि न्यूट्रोफिल को दिखाता है)। (बी, बी ') GFP अभिव्यक्ति IAV संक्रमण के संकेत के कोई सबूत नहीं है और तैरना मूत्राशय के लिए न्यूट्रोफिल की कोई भर्ती लार्वा पीबीएस में द्रव्य के साथ इंजेक्शन में मनाया गया। मिसालएएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

लाभ मानव मेजबान रोगज़नक़ बातचीत मॉडल करने के लिए एक छोटा सा जानवर का उपयोग करने से प्राप्त की अधिकतम करने के लिए है, यह अनुसंधान सवालों और परीक्षण परिकल्पना है कि मॉडल प्रणाली के निहित लाभ को भुनाने के फ्रेम करने के लिए महत्वपूर्ण है। मानव IAV संक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में, zebrafish उच्च उपजाऊपन, ऑप्टिकल स्पष्टता, दवा स्क्रीनिंग के लिए ज़िम्मा, और ट्रांसजेनिक लाइनों है कि न्यूट्रोफिल तरह प्रतिरक्षा कोशिकाओं लेबल की उपलब्धता सहित कई ताकत, है। zebrafish सूजन और सहज उन्मुक्ति के अध्ययन के लिए माउस मॉडल प्रणाली के लिए एक तेजी से शक्तिशाली विकल्प के रूप में विकसित किया गया है। क्योंकि वे विकास के पहले 4-6 सप्ताह के दौरान एक कार्य अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कमी है, zebrafish चोट और संक्रमण के 37 के खिलाफ की रक्षा करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट। विकास में इस प्रारंभिक काल के दौरान, यह अलग और एंटीवायरल प्रतिक्रिया अकेले सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से उत्पन्न होने के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव है। थीहै, जो एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ न्यूट्रोफिल लेबल: s काम टीजी (mCherry MPX) की तरह ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों के विकास के द्वारा सुविधा दी गई है।

कि मानव रोग के समान IAV संक्रमण के लिए Zebrafish मॉडल ने हाल ही में 19 में वर्णित किया गया। यह प्रदर्शन किया गया है कि zebrafish उनकी कोशिकाओं है कि प्रदान IAV tropism वायरस, बाँध देते हैं, और कोशिकाओं में प्रवेश करने पर α-2,6-लिंक्ड सियालिक एसिड के अवशेष के पास है। इस पांडुलिपि में और गेबर एट अल में। 19, यह दिखाया गया है कि IAV के दो विभिन्न प्रकारों (ए / पीआर / 8/34 [H1N1] और एक्स-31 ए / आइची / 68 [H3N2]), साथ ही पुनः संयोजक NS1-GFP तनाव है कि GFP में यह परिणाम संक्रमित कोशिकाओं में अनुवाद, संक्रमित कर सकता है दोहराने, और कारण मृत्यु दर जब लार्वा zebrafish की संचार प्रणाली में इंजेक्शन। वायरस इंजेक्शन इस संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण विधि विसर्जन के माध्यम से IAV के लिए जोखिम मज़बूती से काम नहीं करता है के रूप में है। संक्रमित मछली हस्तांतरण होना चाहिएएक 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए लाल वायरल प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए। यह ध्यान रखें कि मानव श्वसन तंत्र, जहां इन्फ्लूएंजा संक्रमण होते हैं, आम तौर पर 33 डिग्री सेल्सियस है महत्वपूर्ण है। 28 डिग्री सेल्सियस, जो zebrafish ऊष्मायन के लिए और अधिक विशिष्ट तापमान पर ऊष्मायन, एक विश्वसनीय संक्रमण का उत्पादन करने में विफल रहता है। इसके अलावा, यह निर्माता या IAV के बैच से प्राप्त प्रत्येक बहुत zebrafish में संक्रामकता और रोग प्रगति को प्रभावित करता है कि परिवर्तनशीलता के कारण एक प्रयोग में उपयोग करने से पहले उत्पादन का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। जब संक्रामक खुराक सही ढंग से titrated है, zebrafish के विशाल बहुमत IAV के इन प्रकारों के साथ संक्रमित, सूजन द्वारा typified सकल रोग phenotypes प्रदर्शन करना चाहिए के रूप में जल्दी 24 घंटा के बाद संक्रमण के रूप में, कि उत्तरोत्तर खराब हो, 48 घंटा के बाद संक्रमण से craniofacial असामान्यताओं, 72 घंटा के बाद संक्रमण, और लगभग 50% से अग्रकुब्जता 5 डी के बाद संक्रमण से संक्रमण का शिकार करना चाहिए। 48 घंटा के बाद संक्रमण पर हिस्तोपैथोलोजी गिल के सबूत, सिर गुर्दे, और शामिल करना चाहिएजिगर गल जाना है, साथ ही पेरीकार्डियम में तरल पदार्थ के संकेत मिले हैं। zebrafish में एक IAV संक्रमण की उम्मीद के मुताबिक परिणाम के रूप में इन निष्कर्षों को स्थापित करने में, यह स्क्रीन उम्मीदवार विरोधी इन्फ्लूएंजा दवा परिसर के उम्मीदवारों के लिए संभव है। इसे ध्यान में रखते, एक एंटीवायरल गेबर एट अल में वर्णित मूल निष्कर्षों के आधार पर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक सबूत के सिद्धांत प्रोटोकॉल। 19 प्रदर्शन कर रहे हैं। एक खुराक के रूप में NS1-GFP प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित किया है कि, मानव रक्त में मनाया स्तर, रुग्णता की देरी से शुरू होने की नकल करने की भविष्यवाणी की है और वायरल प्रतिकृति / प्रसार पर एक स्पष्ट प्रभाव के माध्यम से मृत्यु दर कम हो जाता है, पर neuraminidase अवरोध Zanamivir का प्रयोग, मनाया गया। zebrafish IAV मॉडल आदर्श उच्च throughput छोटे अणु स्क्रीन करने के लिए moderate- के लिए अनुकूल है। क्योंकि संक्रमण से केवल कुवियर या पीछे कार्डिनल नस की वाहिनी के माध्यम से प्रचलन में मैनुअल इंजेक्शन के माध्यम से ही हो सकता है, स्क्रीन के आकार तकनीशियनों स्थापित की संख्या से सीमित कर रहे हैंसंक्रमण और तकनीक का प्रदर्शन करने में उनकी proficiencies lishing। फिर भी, यह प्रति घंटे तकनीशियन के अनुसार कम से कम 200 zebrafish भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए संभव है। जबकि एक zebrafish संक्रमण मॉडल में Zanamivir के लिए एंटीवायरल गतिविधि का प्रदर्शन करने में सफल है, यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि zebrafish सहित सभी पशु मॉडल, में दवा स्क्रीनिंग सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए 38। जिस तरह से एक दवा अवशोषित और चयापचय होता है से पशु-से-जानवर अलग है, और भविष्यवाणी करना मुश्किल है। फिर भी, नए विरोधी इन्फ्लूएंजा दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक विधि के रूप में, इस zebrafish IAV संक्रमण मॉडल मनुष्य के लिए orthologous और अत्यधिक संरक्षित एकीकृत शरीर क्रिया विज्ञान के साथ अंगों के साथ एक जानवर में छोटे अणुओं के कई हजारों सर्वेक्षण करने के लिए एक रोमांचक अवसर प्रस्तुत करता है।

प्रणालीगत संक्रमण के लिए एक मॉडल होने के अलावा, zebrafish भी जब IAV तैरना मूत्राशय 19 में इंजेक्ट किया जाता है स्थानीय संक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं 21, 29, 30, 31 के कार्यात्मक एनालॉग। जब ठीक से titrated, zebrafish कि 5 डी बाद निषेचन में NS1-GFP तनाव से संक्रमित हैं 1 डी के बाद संक्रमण से तैरना मूत्राशय की epithelia आसपास कबरा प्रतिदीप्ति का सबूत प्रदर्शन करना चाहिए। इस स्थानीय संक्रमण रणनीति का प्रयोग, संक्रमण के जवाब में न्यूट्रोफिल व्यवहार पर नज़र रखी जा सकती है। मानव न्यूट्रोफिल की तरह, zebrafish न्यूट्रोफिल, सहज प्रतिरक्षा में एक प्रमुख सेलुलर मध्यस्थ हैं जीर्ण सूजन 24 के दौरान ऊतकों को चोट और संक्रमण और महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए तीव्र प्रतिक्रियाएं दौरान कामकाज। वहाँ एक से बढ़ मान्यता है कि न्यूट्रोफिल इन्फ्लूएंजा संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है। वास्तव में, यह स्पष्ट हो गया है कि "के रूप दोधारी तलवार" प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मध्यस्थता में न्यूट्रोफिल समारोह। whiLe एंटीवायरल प्रतिक्रिया इन्फ्लूएंजा के संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक करने के लिए आवश्यक है, न्यूट्रोफिल भी फेफड़ों कि मेजबान के ऊतकों को नुकसान पहुंचा और मृत्यु दर 39, 40, 41, 42, 43 के खतरे को बढ़ा सकता है में एक जरूरत से ज्यादा भड़काऊ पर्यावरण के लिए योगदान करते हैं। वहाँ zebrafish और मानव जीनोम के बीच जीन synteny की काफी संरक्षण है, और इस orthology के साथ, वहाँ भी न्युट्रोफिल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण कार्य संरक्षण है। Zebrafish न्यूट्रोफिल एक बहुरूपी नाभिक, प्राथमिक और माध्यमिक कणिकाओं की उपस्थिति, और कार्यात्मक myeloperoxidase और NADPH 22 oxidase सहित मानव न्यूट्रोफिल, के लिए कई समानताएं सहन। इसके अलावा, zebrafish न्यूट्रोफिल बैक्टीरिया अपनी चपेट में ले और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) 44 जारी कर सकते हैं। कई ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों घ रहा हैकी पहचान करने और न्यूट्रोफिल जीव विज्ञान 27, 45, 46, 47 के कार्यों में मदद करने के लिए काटना eveloped। इस संक्रमण प्रोटोकॉल लचीला है और इन वैकल्पिक उपकरण का उपयोग कर कई न्यूट्रोफिल कार्यों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह स्थानीय zebrafish IAV संक्रमण मॉडल मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करने की सक्षम बनाता है, और विशेष रूप से न्यूट्रोफिल द्वारा मध्यस्थता उन।

स्तनधारी प्रजातियों मॉडल में किए गए अध्ययन में बहुमूल्य जानकारी 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, लेकिन कुछ वास्तविक समय IAV संक्रमण ज शामिल प्रयोगों झुकेंगेएवेन्यू प्रदर्शन किया गया, मेजबान में कशेरुकी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के घटकों के बीच जटिल परस्पर क्रिया की समझ सीमित। पिछले दशक के दौरान, zebrafish पशु मॉडल प्रणाली का उपयोग मेजबान रोगज़नक़ बातचीत 21, 47, 56, 57 के बारे में जानकारी का एक जल प्राप्त हुए है, और यह भी दवाओं की खोज के लिए एक उपकरण के रूप में महत्वपूर्ण जानकारी की पेशकश की है। आणविक तकनीक और इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक बेहतर समझ की अनुमति दी है और कैसे इन विवो 17, 18, 27 में प्रकट होते हैं। खोज की है कि zebrafish IAV 19 से संक्रमित हो सकता है, और है कि zebrafish शेयरों मानव सहित स्तनधारी सिस्टम, के साथ महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा समानता, अध्ययन करने के लिए दरवाजा खोल दिया हैएक महत्वपूर्ण मानव वायरल रोगज़नक़ की। प्रोटोकॉल वर्णित अन्य अनुप्रयोगों को निभा रहे हैं और मेजबान वायरस बातचीत मानव स्वास्थ्य पर गहरा प्रभाव डालता है नैदानिक ​​हो सकता है कि के बारे में महत्वपूर्ण खोजों उपज क्षमता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5, (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6, (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14, (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80, (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, (1), 531 (2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12, (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184, (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4, (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130, (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194, (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190, (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7, (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98, (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6, (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94, (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256, (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116, (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18, (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89, (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125, (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331, (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129, (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6, (6), e21715 (2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269, (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8, (12), e84436 (2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55, (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14, (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154, (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179, (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352, (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12, (1), e1005378 (2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33, (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319, (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33, (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22, (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171, (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14, (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31, (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183, (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79, (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47, (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49, (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98, (4), 523-537 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics