La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Immunology and Infection

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Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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Abstract

La identificación de un epítopo antigénico por el sistema inmune permite la comprensión del mecanismo de protección de anticuerpos neutralizantes que pueden facilitar el desarrollo de vacunas y fármacos peptídicos. de barrido de péptidos es un método simple y eficiente que los mapas de forma directa el epítopo lineal reconocido por un anticuerpo monoclonal (mAb). A continuación, los autores presentan una metodología de determinación epítopo participación de las proteínas truncadas recombinantes en serie, el diseño de péptidos sintéticos, y la hibridación dot-blot para el reconocimiento antigénico de la proteína de cubierta del virus de la necrosis nerviosa utilizando un anticuerpo monoclonal neutralizante. Esta técnica se basa en la hibridación dot-blot de péptidos y mAbs sintéticos sobre una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La región antigénica mínima de una proteína de la cubierta viral reconocido por el RG-M56 mAb puede ser reducido a paso a paso recortado mapeo de péptidos en un péptido epítopo 6-mer. Además, barrido de alanina y mutagénesis residuo subinstitución puede llevar a cabo para caracterizar el significado unión de cada residuo de aminoácido que compone el epítopo. Se encontró que los residuos que flanquean el sitio epítopo para jugar un papel crítico en la regulación del péptido conformación. El péptido epítopo identificado puede ser utilizado para formar cristales de complejos de péptido-anticuerpo de epítopo para un estudio de difracción de rayos X y la competencia funcional, o para la terapéutica.

Introduction

En el sistema inmune, la recombinación de los segmentos V, D y J permite anticuerpos para crear enormes variaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para la unión a diversos antígenos para proteger al huésped de la infección patógena. La defensa de neutralización de anticuerpos contra los antígenos depende de la complementariedad espacial entre las CDR de los anticuerpos y los epítopos de los antígenos. Por lo tanto, la comprensión de esta interacción molecular ayudará diseño vacuna profiláctica y desarrollo de fármacos péptido terapéutico. Sin embargo, esta interacción de neutralización puede estar influenciada tanto por múltiples dominios antigénicos de un antígeno único y de múltiples CDR de anticuerpos, que en consecuencia hacen que el proceso de determinación de epítopo más complejo. Afortunadamente, el desarrollo de la tecnología de hibridoma, que se fusiona células productoras de anticuerpos individuales con células de mieloma, permite para un lote dividen constantemente de las células para secrete un anticuerpo específico, conocido como un anticuerpo monoclonal (mAb) 1. Las células de hibridoma producen estos mAbs, puros de alta afinidad para unirse a un único dominio antigénico de un antígeno específico. Con la relación de la antígeno-anticuerpo establecido, varios enfoques, incluyendo la exploración de péptidos, se puede utilizar para determinar el epítopo de un antígeno utilizando su mAb correspondiente. Los acontecimientos recientes en la tecnología de péptidos sintéticos han hecho que la técnica de exploración de péptidos más accesible y más conveniente para llevar a cabo. En pocas palabras, un conjunto de la superposición de péptidos sintéticos se producen según una secuencia de antígeno objetivo y están asociados a una membrana en un soporte sólido para el mAb hibridación. de barrido de péptidos no sólo ofrece una forma simple de un mapa de la región de unión a anticuerpo, sino que también facilita de aminoácidos (aa) mutagénesis de barrido a través de residuo o sustitución para evaluar la interacción de unión entre cada residuo aa del péptido epítopo y las CDR del anticuerpo.

2, 3, 4. El protocolo incluye mAb preparación, construcción y expresión de proteínas recombinantes en serie truncadas, diseño de péptidos solapantes sintético, la hibridación dot-blot, barrido de alanina, y mutagénesis de sustitución. Teniendo en cuenta el alto costo de la síntesis de péptidos, el paso de truncar en serie las proteínas recombinantes de una proteína diana deseada se modificó, y la región antigénica se redujo a alrededor de 100 a 200 residuos de aa antes de que se realizó el análisis dot-blot array péptido sintético.

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Protocol

1. Preparación del anticuerpo monoclonal

  1. Cultivar las células de hibridoma monoclonales de ratón RG-M56 2 en medio libre de suero en matraces 175T a 37 ºC con 5% de CO 2 suplemento. Recoger el sobrenadante cuando el color del medio se vuelve amarillo después de cinco días de incubación.
    NOTA: Las células de hibridoma se cultivaron en medio libre de suero para evitar la contaminación de anticuerpos de suero bovino fetal.
  2. Centrifugar el sobrenadante a 4.500 xg durante 30 min a 4 ºC y desechar el sedimento de restos celulares.
  3. Añadir 2 ml de agarosa de proteína G (suministrado como una suspensión 50%) a una columna de 5 ml y se equilibre con 10 volúmenes de resina (10 ml) de PBS enfriado en hielo.
  4. Carga de 200 ml del sobrenadante de anticuerpo (paso 1.2) en la columna y deseche el paso a través.
  5. Añadir 10 ml de helado de PBS a la columna para lavarla. Repetir dos veces.
  6. Añadir 10 ml de glicina 50 mM, pH 2,7 a la columna para eluir el anticuerpo asociado a la proteína G. Columnalect 900 fracciones mu l en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 l de 10x tampón de neutralización (1 M Tris, 1,5 M NaCl, y EDTA 1 mM, pH 8,0).
  7. Almacenar el anticuerpo purificado en 50% de glicerol con 0,03% NaN 3 a -20 ºC.

2. Construcción y expresión de proteínas recombinantes en serie truncadas

  1. Preparar una mezcla de reacción PCR: 5 l de 10x tampón Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 mM de cebador directo 3, 0,2 M cebador inverso 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng de pET20b-1A59 DNA 3 plásmido, y 2,5 U ( unidad) de ADN polimerasa Pfu; añadir ddH 2 O a un volumen final de 50 mL.
    1. Las muestras se ejecutan en un termociclador automático utilizando los siguientes parámetros: Ciclo 1 (94 ºC durante 5 min); 2-36 ciclos (94 ° C durante 30 s, 63 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 60 s); y el ciclo 37 (72 ºC durante 7 minutos).
  2. Se extrae la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los productos mediante el uso de un kit de purificación de PCR 5 para facilitar la continuación de la digestión con enzimas de restricción.
  3. Digerir los fragmentos de ADN amplificados por PCR con enzimas de restricción Nde I y Xho I y se liga a cada uno de estos fragmentos de ADN en Xho I enzima escindido pET-20b (+) Nde I y vector. Transformar las construcciones en las células DH-5a-competente de Escherichia coli 6.
    1. Preparar la mezcla de digestión en tampón de digestión (20 mM Tris-acetato, Mg 10 mM (CH 3 COO) 2, KCH 50 mM 3 COO, y DTT 1 mM, pH 7,9) con 1 g de ADN amplificado por PCR o pET-20b (+) DNA vector, y 2 U de Nde I y Xho I restricción enzimas en un volumen final de 20 mL.
    2. Mezclar la mezcla de digestión suave y rápidamente girar hacia abajo. Incubar a 37 ºC durante 2 h en un baño seco para asegurar el corte completo de la restricción sentarseES.
    3. Extraer la enzima de fragmentos de ADN digerido de restricción usando un kit de purificación de PCR 5 para facilitar la siguiente construcción de plásmido.
    4. Preparar la mezcla de ligación en tampón de ligación (Tris 66 mM, 5 mM MgCl 2 mM, ATP 1, y DTT 5 mM, pH 7,5) con 100 ng de ADN predigerido, amplificado por PCR, 10 ng de predigerido pET-20b (+) ADN vector, y 5 U de la ligasa de T4 ADN en un volumen final de 10 mL.
    5. Mezclar la mezcla de unión suave y rápidamente girar hacia abajo. Se incuba a 16 ° C durante 18 h en un baño de agua.
    6. Ponga 10 l de las muestras de ligación en 100 l de las células DH-5α-competentes y mezclar suavemente antes de colocar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 30 min. Poner el tubo de microcentrífuga en un baño seco a 42 ºC durante 90 s para inducir choque térmico 7. transferir inmediatamente el tubo en hielo durante 2 min.
    7. Añadir 900 l de caldo de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto triptona, 0,5% Bacto EXTRACTION levadurat, y 0,5% de NaCl, pH 7,0) al tubo. Incubar a 37 ºC con 150 rpm agitación durante 45 min. Sedimentar las células por centrifugación a 4000 x g durante 10 min y descartar el sobrenadante.
    8. Resuspender el precipitado con 50 l de caldo LB y se extendió cada transformación en placas LB precalentado que contienen 100 mg / ml de ampicilina. Incubar las placas a 37 ° C durante 16 h.
    9. Recoger una sola colonia usando una punta de 200 l y colocarlo en un caldo de 3 ml de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina en un tubo sin cubiertas 15 ml. Incubar a 37 ºC con 150 rpm agitación durante 12 h.
    10. Extraer el ADN plasmídico de cada cultivo 8 y la secuencia usando el promotor T7 y cebadores del terminador T7 para confirmar la secuencia 9.
  4. Después de la confirmación de secuencia, transformar 10 ng de ADN de estos pET-20b (+) plásmidos con diferentes longitudes de gen de la proteína capa YGNNV en la cepa BL-21 (DE3) de E. coli por nosotrosing el método de choque térmico-7. Siga los pasos 2.3.6-2.3.8 para llevar a cabo la transformación.
  5. Transferir una sola colonia de cada E. coli transformado BL-21 de células en caldo de 3 ml de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina en un tubo sin cubiertas 15 mL. Incubar el cultivo a 37 ºC con agitación 150 rpm.
  6. Se enfría la cultura a 25 ºC cuando la OD 600 del cultivo es aproximadamente 0,6 y añadir IPTG a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de la proteína recombinante. Incubar el cultivo de un extra de 4 horas a 25 ° C con 200 rpm de agitación.
  7. Transferir 1 ml del cultivo en un tubo de microcentrífuga. Sedimentar las células por centrifugación a 12.000 xg durante 1 min y descartar el sobrenadante.
  8. Resuspender el sedimento celular en 100 l de tampón de desnaturalización (8 M urea, fosfato de sodio 20 mM, y 0,5 M NaCl, pH 7,4) pipeteando arriba y abajo con una micropipeta. Mezclar mediante agitación vigorosa.
    NOTA: El sol de la muestraluciones ahora deben ser semi-transparente, un poco pegajoso, y listo para el ensayo de hibridación dot-blot.

3. Diseño y síntesis de péptidos superpuestos

  1. Diseño y síntesis de péptidos 3 de 20 unidades de serie que cada superposición con su sucesor por 10 aa residuos de la región de 195 a 338 aa de la proteína de la cubierta YGNNV para delimitar la región epítopo de RG-M56 mAb mediante transferencia de puntos.
  2. Diseñar y sintetizar péptidos 3 tres 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 y 199 VLCRWSVR 206) con un solapamiento de 6 aa residuos a la siguiente péptido sintético para limitar la región de epítopo 195-206 aa mediante transferencia de puntos.
  3. Diseño y síntesis de 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 y 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, y 197 VSVLCR 202), y 5-mer péptidos (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, y 198 SVLCR 202) con una superposición de 6, 5, y 4 residuos de aa, respectivamente, en sus péptidos vecinos para reducir al mínimo la región epítopo mediante transferencia de puntos.

4. La hibridación dot-blot

  1. Disolver cada péptido sintetizado en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración final de 10 mg / mL.
    NOTA: Para superar la variada solubilidad de péptidos sintéticos, todos los péptidos sintéticos debe disolverse en DMSO. DMSO es un buen disolvente para disolver completamente los péptidos hidrófobos o hidrófilos.
  2. Remojar la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con metanol durante 2 min.
    NOTA: membrana de PVDF es de hasta resistente a DMSO 100%; otros pueden no serlo.
  3. Equilibrar la membrana de PVDF con tampón modificado Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM, y 0,1% de SDS, pH 8,3) para2 minutos.
    NOTA: 10-20% (v / v) de metanol se puede añadir a un tampón de Towbin modificado para mejorar los resultados de la transferencia.
  4. Enjuague un pedazo de papel de cromatografía con el tampón de Towbin modificado. Colocar la membrana de PVDF en el papel de cromatografía. Espere hasta que el tampón Towbin modificado ha desaparecido de la superficie de la membrana de PVDF antes de continuar con el siguiente paso.
  5. Añadir 2 l de cada muestra de péptido a la membrana con una punta de 10 l. El aire seco de la membrana de PVDF en el papel de cromatografía durante 10 minutos. Añadir cada muestra péptido lenta y gradualmente sobre la membrana para evitar demasiada difusión.
  6. Bloquear la membrana en tampón de TBST (0,05% (v / v) pH Tween-20, Tris 20 mM, y NaCl 150 mM, 7,4) con 5% de leche sin grasa para 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  7. Añadir RG-M56 mAb a una dilución final de 1: 1000 en tampón TBST con 5% de leche sin grasa a la membrana. Incubar la membrana a 37 ° C durante 1 h con agitación suave.
  8. Retire el anticuerpo asílución. Lavar la membrana en tampón de TBST durante 5 min con agitación suave. Repetir dos veces.
  9. Añadir el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de ratón, Fc, conjugado con fosfatasa alcalina) en una dilución final de 1: 5000 en tampón TBST con 5% de leche sin grasa a la membrana. Incubar la membrana a 37 ° C durante 1 h con agitación suave.
  10. Descartar la solución de anticuerpo. Lavar la membrana en tampón de TBST durante 5 min con agitación suave. Repita el paso de lavado dos veces.
  11. Desarrollar la membrana con solución de sustrato BCIP / NBT a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. Detener el desarrollo lavando la membrana con ddH2O cuando aparezca la señal.
  12. El aire seco de la membrana y capturar la imagen de transferencia puntual usando un sistema de imagen.
  13. Medir la intensidad de cada transferencia de puntos utilizando el software de análisis de imagen 3.

5. barrido de alanina y sustitución

  1. Diseñar y sintetizar 3 alanina y methipéptidos de sustitución onine. Reemplazar cada residuo a bis con alanina para el péptido 8-mero 195 VNVSVLCR 202 y sintetizar péptidos 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 y 195 VNVSVLCA 202 . Reemplazar leucina residuos aa 200 a metionina para crear el genotipo SJNNV epítopo péptido 195 202 VNVSVMCR.
  2. Siga la sección 4 para realizar el rastreo de alanina y mutagénesis de sustitución transferencia de puntos.

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Representative Results

El objetivo de este experimento fue identificar un epítopo a través de transferencia de puntos usando mAb. Para obtener rápida y eficientemente por la región antigénica reconocida por mAb, de longitud completa y proteínas de la cubierta recombinante YGNNV en serie truncado con un marcador de fusión 6xHis en el extremo C-terminal se expresaron a partir de un sistema de expresión de E. coli PET 10 (Figura 1A). Las proteínas recombinantes resultantes fueron avistados en la membrana de PVDF usando RG-M56 mAb y anti-6xHis anticuerpo para la hibridación dot-blot. La transferencia de puntos reveló señales positivas contra 1-338 aa (de larga duración), 51-338 aa, y 195 a 338 bis, pero no aa 1-100 o 1-200 aa proteínas recombinantes (Figura 1B). La matriz de puntos hibridó contra el anticuerpo anti-6xHis y se confirmó la expresión de todas las proteínas recombinantes. Estos datos indican que el epítopo de reconocimiento RG-M56 mAb se encuentra en un 144-aa nea proteína recombinanter el C-terminal de YGNNV proteína de la cubierta (195 a 338 aa).

Posteriormente, los péptidos de serie 20-mer con 10 aa-residuos-larga se superpone a su vecino se han diseñado y sintetizado a partir de la secuencia de la proteína recombinante de 144 aa para la exploración de péptidos para reducir la región epítopo. Estos péptidos sintéticos fueron vistos en una membrana de PVDF y se sometieron a hibridación dot-blot usando RG-M56 mAb. El resultado mostró señales positivas sólo en el aa péptido 195-214 y el control positivo, proteína recombinante 195-338 aa (Figura 2A). A medida que el epítopo está localizado dentro del péptido 195-214 aa región, pero no la región de aa péptido 205-224, tres de serie péptidos 8-meros con residuos de 6-aa solaparse de aa residuo 195-206 (péptidos 195-202 aa, 197- 204 bis, y 199-206 aa) se diseñaron y sintetizaron. Dot-blot hibridación resultados mostraron señales positivas en el péptido aa 195-202 y el control positivo péptido 195-214 aa usarRG-M56 mAb (Figura 2B).

Barrido de alanina y mutagénesis de sustitución se realizaron para evaluar la especificidad de cada residuo aa del epítopo 8-mer, 195 VNVSVLCR 202. Cada residuo aa del péptido 8-mer se sustituyó individualmente con alanina. A continuación, la matriz de péptido mutación de alanina se colocó sobre una membrana de PVDF usando péptido 195-202 aa como control positivo. Análisis dot-blot indicó que las tres mutaciones que sustituye, V197A, V199A, y C201A, abolieron la afinidad de unión de RG-M56 mAb (Figura 3A). Aunque aa residuo 200 en el epítopo genotipo SJNNV es metionina, en oposición a una leucina en los otros cuatro epitopes genotipo betanodavirus, la secuencia de genotipo SJNNV, 195 VNVSVMCR 202, mostró afinidad de unión positiva contra RG-M56 mAb, como la del control positivo (Figura 3A). Este resultado indica que los epítopos of todos los genotipos betanodavirus pueden ser reconocidos por RG-M56 mAb. La afinidad de unión de cada residuo aa participar al sitio epítopo se cuantificó adicionalmente por la medición de la intensidad de la señal de la transferencia de puntos de cada sustitución de alanina usando el software de análisis de imágenes (Figura 3B). Las intensidades de las V197A, V199A y sustituciones C201A se redujeron a 10.2%, 18.6% y 8.5%, respectivamente, en comparación con los del control positivo (100%), mientras que el V195A, S198A, L200A, R202A, y sustituciones L200M mostraron intensidades más altas o similares a la del control positivo. Vale la pena señalar que la fuerza de influir en la sustitución N196A es ambigua, con una reducción de 37,4% en el control positivo. Estos resultados indican que V197, V199, C201 y son residuos esenciales para la unión de RG-M56 mAb.

Los resultados de mutagénesis de barrido de alanina revelar que los residuos de aa V195, N196, R202 y puedeser reemplazado por alanina, lo que implica que la región epítopo podría ser reducido aún más hacia abajo en ambos extremos. Por lo tanto, el paso a paso recortado mapeo de péptidos a través de 7-mer, 6-mer, y 5-mer paso péptidos sintéticos ha sido diseñado para reducir al mínimo la región antigénica. La señal positiva estuvo presente en el péptido sintético 6-mer 196 NVSVLC 201, pero no en los 7-mer y 5-mer péptidos sintéticos (Figura 4). Estos datos indican que el epítopo mínimo de proteína de la cubierta NNV reconocido por RG-M56 mAb es el péptido 6-mer, 196 NVSVLC 201.

Figura 1
Figura 1: Reducción de la región de epítopo usando proteínas recombinantes en serie truncados y anticuerpo monoclonal. (A) Mapa de NNVCPs recombinantes en serie truncadas. NNVCP 1-338 aa es la proteína de la cubierta de cuerpo entero. (B) Dot-bloEl análisis t de NNVCPs recombinantes. Izquierda: Mapa de las proteínas de la cubierta recombinante truncado en serie YGNNV en la membrana de PVDF. Medio: El análisis dot-blot se realizó usando anticuerpo anti-6xHis. Derecha: El análisis dot-blot se realizó mediante RG-M56 mAb. NNVCP: proteína de la cubierta del virus de la necrosis nerviosa; aa: aminoácido; PVDF: fluoruro de polivinilideno; N: N-terminal; C: C-terminal; mAb: anticuerpo monoclonal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: El mapeo fino de la región epítopo usando péptidos sintéticos. (A) Izquierda: Las secuencias de aminoácidos de los péptidos sintéticos de 20 unidades se suman a NNVCP 195-338 aa; cada péptido anterior tenía un 10 aa-residuos-larga solapamiento con el siguiente péptido. Derecha: Mapa del spéptidos ynthetic en la membrana PVDF. Recombinante NNVCP 195-338 aa se utilizó como control positivo. El análisis dot-blot se realizó mediante RG-M56 mAb. (B) Izquierda: secuencias de aminoácidos de los péptidos sintéticos 8-mer, 195-202 aa, 197 a 204 aa, y 199 a 206 aa; cada péptido anterior tenía un 6 aa-residuos-larga solapamiento con el siguiente péptido. Sintético péptido 195-214 aa se utilizó como control positivo. Derecha: El análisis dot-blot se realizó mediante RG-M56 mAb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: barrido de alanina y mutagénesis de sustitución del 195 VNVSVLCR 202 epítopo. Secuencias (A) de aminoácidos de la mutagénesis de sustitución y análisis dot-blot. Cada aa residue de la región epítopo, 195-202 aa, fue sustituido de forma individual con alanina. L200M sustitución es la secuencia de genotipo SJNNV en la región epítopo proteína de la cubierta betanodavirus. Sintético péptido 195-202 aa se utilizó como control positivo. Los residuos de aa reemplazados están subrayados. (B) Cuantificación de la afinidad de unión de la señal de transferencia en punto. La intensidad de la señal del control positivo (195 a 202 aa) se determinó como 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: determinación mínimo epítopo. El 7-mer (A), 6-mer (B), y 5-mer (C) péptidos sintéticos 195-202 aa se utilizaron para identificar el epítopo mínimo reconocido por RG-M56 mAb. Pepti sintéticade 195 a 202 aa se utilizó como control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo ofrece una técnica rápida y simple para identificar un epítopo lineal mAb-reconocido. Teniendo en cuenta el coste de la síntesis de péptidos y la eficiencia de la producción de péptidos que sintetizan, la región antigénica de la proteína de cubierta del virus se redujo mediante la expresión de proteínas recombinantes en serie truncados antes del análisis de barrido de péptidos. Como tal, se utilizó el sistema de expresión de E. coli pET confiable y eficiente para producir estas proteínas recombinantes en serie truncadas, como proteínas recombinantes con pesos moleculares entre 10 a 50 kDa se pueden expresar fácilmente a través de este sistema. De esta manera, el epítopo se puede reducir fácilmente a una más manejable región aa 100-200. El vector pET-20b (+) fue elegido específicamente, ya que contiene una secuencia que codifica para la expresión de 6xHis-etiquetas, permitiendo que las proteínas producidas 6xHis-tag de fusión para ser immunodetected utilizando un anticuerpo anti-6xHis para confirmar la expresión de la p recombinanteroteins. Las proteínas de cubierta recombinantes producidas fueron entonces analizados mediante RG-M56 mAb a través de un ensayo de hibridación dot-blot. Un método alternativo de determinación epítopo proteína recombinante es purificar las proteínas recombinantes expresadas a través de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados 10, separar las proteínas recombinantes con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y llevar a cabo análisis de transferencia de Western 3.

Para asignar más y más finamente la ubicación epítopo determinado por los resultados de análisis de hibridación dot-blot utilizando proteínas recombinantes en serie truncados, los péptidos sintéticos solapantes con diferentes tamaños fueron diseñados. Entre las diferentes longitudes posibles de péptido sintético para sintetizar, 20-mer con 10 aa-residuos-a largo superposición de péptidos se eligieron por primera vez en el escaneo péptido, tanto por su alta pureza síntesis (en torno al 90%) y por su longitud del péptido, lo suficientemente para la búsqueda de la continua epitope reconocido por el anticuerpo de células B 11. Tenga en cuenta que la exactitud y la pureza de los péptidos sintetizados se deterioran como el péptido sintetizado es más largo. De esta manera, la región epítopo se redujo rápidamente a alrededor de 10 residuos de aa de longitud. Después fueron encuestados en serie superposición de péptidos 8-mer, se definió la región epítopo lineal al péptido 195-202 aa. Posteriormente, barrido de alanina de este péptido epítopo 8-mer revela la fuerza afinidad de unión crítico de cada residuo aa, lo que permite la búsqueda de la epítopo mínimo. Las funciones esenciales de la V197, V199, y residuos de aa C201 implica que la región epítopo lineal cubre al menos 5 residuos de aa, de 197 a 201. Por otra parte, aa residuos V195, N196, R202 y pueden ser sustituidos por alanina sin perder completamente la unión de afinidad, lo que indica que la región de epítopo puede ser reducido a 7, 6, o incluso 5 residuos de aa de longitud. secuencias de péptidos pequeños pueden sintetizarse fácilmente y económicamente para la búsqueda de lineal (continuous) epítopos. Sin embargo, esta técnica de exploración péptido sintético no es adecuado para la determinación de un epítopo discontinuo de un anticuerpo, a menos que se combina con la escisión epítopo y análisis de espectrometría de masas 12.

En este protocolo, una técnica de hibridación dot-blot se utilizó para buscar el epítopo lineal de un mAb. hibridación dot-blot es un método simple pero eficaz. En el principio de la búsqueda, cuando la región epítopo se estrecha hacia abajo desde un paisaje a gran escala, la principal preocupación es observar ya sea una señal positiva o negativa después de la hibridación del anticuerpo a una proteína unida a la membrana objetivo, como la mayoría de los mAbs solamente se unen a un epítopo específico de una proteína antigénica (Figuras 1 y 2). Sin embargo, cuando se utiliza la hibridación dot-blot para explorar la disponibilidad de unión de cada residuo aa dentro de la región epítopo contra el anticuerpo, tal como por mutagénesis de sustitución de alanina,la intensidad de la señal de cada residuo aa sustituido determinada mediante transferencia de puntos debe tenerse en cuenta la importancia global vinculante. Eso intensidad de la señal se puede cuantificar fácilmente usando software de análisis de imagen (Figura 3B) o un densitómetro. Alternativamente, un ensayo inmuno-sorbente ligado a enzimas (ELISA) se puede realizar para cuantificar el grado de afinidad de unión y la fuerza de la señal resultante 3.

En el estudio anterior, la única proteína de la cubierta de la no-envuelta del virus de la necrosis nerviosa era inmuno-reconocido por mAbs 10 con un valor alto índice de neutralización entre 6.5 a 4.5 (log 10 NI) 2. La capacidad de reconocimiento altamente específico de los mAbs se utilizaron adicionalmente para el desarrollo de la de un solo paso, kit de diagnóstico inmunocromatográfico rápido para la detección de peces infectados-NNV 13. El epítopo antigénico de la proteína de cubierta del virus de la necrosis nerviosa fue reconocido por el RG-M18MAB como un péptido 8-mero, 195 202 VNVSVLCR 3, a través del cual se identificó un nuevo receptor NNV (datos no publicados). En el presente estudio, el epítopo de la necrosis nerviosa proteína de la cubierta del virus se redujo aún más a un péptido 6-mer, 196 NVSVLC 201, por el otro mAb, RG-M56.

Es inesperado que dos péptidos 7-mer (196 NVSVLCR 202 y 195 VNVSVLC 201) que contienen péptido 6-mer 196 NVSVLC 201 no son reconocidos por RG-M56 mAb (Figura 4A). Una interpretación razonable es que, aunque los residuos que rodean V195 y R202 pueden no contribuir directamente a la interacción de unión entre el epítopo y el anticuerpo, los residuos flanqueantes influyen en la formación de la conformación de péptidos correcta para el reconocimiento de anticuerpos. La aparición de V195 o R202 en sus terminal de flanqueo por sí solo puede retorcer el péptido sintéticoconformación de reconocimiento de anticuerpos y vinculante. La conformación epítopo es impulsado por la fuerza de ambos terminales, V195 y R202, que son equilibrada contra otros en el péptido sintético 8-mer, 195 VNVSVLCR 202, y contrarrestado en el péptido sintético 6-mer, 196 NVSVLC 201. Los residuos de aa, V195, N196, y R202, se pueden reemplazar individualmente con alanina sin completamente la pérdida de capacidad de unión, y por lo tanto, los resultados de mutagénesis de barrido de alanina indican que estos tres aa residuos no pueden desempeñar un papel importante en el reconocimiento y la unión de RG mAb -M56. Sin embargo, después de recortar un residuo más a partir del péptido sintético 6-mer, 196 NVSVLC 201, el péptido 5-mer, 197 VSVLC 201, sin la N196 en la región N-terminal de flanqueo, pierde la capacidad de ser reconocido y unido por RG -M56 mAB (Figura 4C). Este resultado sugiere que el residuo N196 también puede pponer un papel importante en la región flanqueante del epítopo para estabilizar la conformación epítopo correcto a fin de facilitar el reconocimiento y la unión de RG-M56 mAb. La importancia de los residuos flanqueantes que rodean la región epítopo también había sido explorado por otros estudios de unión antígeno-anticuerpo. La importancia de residuos flanqueantes aa que rodean a la región epítopo α-bungarotoxina para la unión de los anticuerpos fue investigada utilizando diferentes sustituciones de aa dentro de la misma subsitio colinérgica. Ellos fueron evaluados en esenciales, influyentes o no influyente 14. También se encontró que la especificidad del epítopo de anticuerpo-reconocido de mucinas epiteliales de carcinoma asociado puede ser influenciada además por los residuos de aa flanqueantes. Estos efectos pueden presentar barreras conformacionales que pueden impedir la unión de un anticuerpo a un epítopo 15.

El epítopo 6-mer, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, tiene características extremadamente hidrófobos, con cuatro restos hidrófobos, incluyendo dos valinas (197 y 199), una leucina (200), y una cisteína (201) (forma reducida). Los residuos V197, V199, C201 y son críticos para el reconocimiento RG-M56 mAb y de unión, como se determina por mutagénesis de barrido con alanina. La región de epítopo estaba situado en una de las ocho hebras beta anti-paralelas del dominio shell (S-dominio) de la proteína de la cubierta NNV 16. Curiosamente, el epítopo no aparece en el dominio saliente exterior, pero se esconde en la estructura gelatinosa rollo de la S-dominio en las otras hebras beta antiparalelas. El epítopo, con su alta hidrofobicidad, puede obtener un microambiente más estable en esta depresión. Por otra parte, se encontró que el 195 VNVSVLCR 202 3 péptido de este epítopo para obstaculizar la propagación del virus de la necrosis nerviosa gigante mero en células mero cerebrales. Por lo tanto, este péptido epítopo se sugirió a ser un competitor implicado en el dominio de unión al receptor necesaria para la entrada viral 3. Se planteó la hipótesis de que inhibidores de la entrada péptido que comprende restos hidrófobos y / o anfipáticos pueden alterar la conformación física y química de las interfaces de la membrana celular y pueden impedir la fusión de las membranas celulares y virales 17. Además, muchos inhibidores de la entrada de péptidos sintéticos han demostrado fuertes propiedades inhibidoras contra diversas infecciones de virus 17, 18. Por lo tanto, el péptido epítopo identificado con residuos hidrófobos y la inhibición entrada fuerte contra la infección NNV puede facilitar el desarrollo de fármacos de péptidos terapéuticos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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References

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