Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

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Summary

Diese Handschrift verwendet das Fiji-basierte Open-Source-Software-Paket VirusMapper Einzelpartikelanalyse Superauflösungsmikroskopische Bilder anzuwenden, um genaue Modelle der nanoskaligen Struktur zu erzeugen.

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Gray, R. D., Mercer, J., Henriques, R. Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper. J. Vis. Exp. (122), e55471, doi:10.3791/55471 (2017).

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Abstract

Super-Resolution-Fluoreszenzmikroskopie zur Zeit revolutioniert zellbiologische Forschung. Seine Fähigkeit, die Auflösungsgrenze von etwa 300 zu brechen nm für die Routine-Bildgebung von biologischen nanoskalige Komplexen und Verfahren ermöglicht. Diese Erhöhung der Auflösung bedeutet auch, dass Methoden populär in der Elektronenmikroskopie, wie beispielsweise Einzelpartikelanalyse können leicht an Superauflösungsfluoreszenzmikroskopie angewandt werden. Durch die Kombination dieser analytischen Ansatz mit höchstauflösenden optischen Bildgebung, wird es möglich, die Vorteile der molekülspezifischen Markierungskapazität von Fluoreszenzmikroskopie zu nehmen Strukturkarten molekularer Elemente innerhalb einer metastabilen Struktur zu erzeugen. Zu diesem Zweck haben wir einen neuen Algorithmus entwickelt - VirusMapper - verpackt als einfach zu bedienende, leistungsstarke und High-Throughput ImageJ Plugin. Dieser Artikel stellt eine ausführliche Anleitung zu dieser Software präsentiert seine Fähigkeit, neue strukturelle Merkmale in biologischen m aufzudeckenMOLEKULARE Komplexe. Hier präsentieren wir, wie kompatible Daten zu montieren und bietet einen Schritt-für-Schritt-Protokoll, wie diesen Algorithmus verwenden Einzelpartikelanalyse zu Super-Resolution-Bildern anzuwenden.

Introduction

Super-Auflösung (SR) Mikroskopie hat, indem sie die Fähigkeit, Bildschlüssel molekulare Prozesse zusammen mit der molekularen spezifischen Markierung von entscheidenden Bedeutung für das Verständnis ihnen einen großen Einfluss auf der Zellbiologie hat. SR ermöglicht nun die Lichtmikroskopie Auflösungen (20-150 nm) , die vorher nur erreichbar mit der Elektronenmikroskopie (EM) unter Beibehaltung der wichtigsten Vorteile der Lichtmikroskopie, wie das Potential zur Bild lebender Zellen zu nähern , 1, 2. Ferner erlaubt die strukturelle Erhaltung im nanoskaligen Ebene zu finden , die Anwendung von Einzelpartikelanalyse (SPA) zum SR - Daten, ein Konzept , umfassend in der Elektronenmikroskopie 3 verwendet. Verwendung von SPA können viele hochkonservierten Kopien eine Struktur sein, zusammen abgebildet und gemittelt, um die Auflösung, Genauigkeit oder Signal-zu-Rauschen des visualisierten Objekts zu verbessern. Wenn sie in Kombination mit SR verwendet wird, hat SPA nachgewiesen wurde ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hoch p seinrecision Zuordnung von Komponenten des Kernporenkomplexes 4, 5, 6 Zentrosomen und Viren, wie HIV und HSV-7 1 8.

Allerdings hat sich die Routine kombinierte Anwendung von SR und SPA wurde durch einen Mangel an verfügbarer Software in Frage gestellt. Aus diesem Grund entwickelten wir VirusMapper, ein Plugin zur populären Bildverarbeitungssoftware ImageJ / Fiji 9. Dies ist das erste frei verfügbare Software - Paket für generali SPA mit Fluoreszenzbildern 10 gestaltet schnell, benutzerfreundlich, Mehrkanal - naiven Lungs von Strukturen mit SR - Mikroskopie abgebildet , bereitzustellen. Obwohl auf Viren entwickelt, kann es auf jeden makromolekularer Komplex angewandt werden, bei denen unterschiedliche molekulare Spezies kann abgebildet werden, identifiziert werden, und lokalisierte.

VirusMapper kann verwendet werden, hochpräzise Molekular herzustellenModelle von jeder bekannten Struktur, für die Berechnung der durchschnittlichen Abmessungen und anderer Parameter zu ermöglichen. Der Algorithmus Design macht es besonders nützlich für die Populationen von Strukturen zu trennen, für die Bestimmung von verschiedenen Orientierungen oder verschiedene morphologische Zustände bereitstellt. Zusätzlich können Mehrkanalabbildungs ​​verwendet werden, um einen Referenzkanal in Fällen zu verwenden, wo die zugrundeliegende Struktur wohl bekannt ist, wodurch eine referenzbasierte Struktur Entdeckung. Die Anweisungen für das Herunterladen und die Installation der Software auf bereitgestellt https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . Beispieldaten können auch dort zu finden, und die Benutzer darauf hingewiesen werden unter Verwendung der Software auf den Beispieldaten zu üben, bevor sie zu ihrem eigenen anzuwenden versuchen.

Hier sind die Schritte für die Verwendung dieses Plug-SPA-Modelle aus den Rohdaten zu erzeugen, werden beschrieben. Die Software nimmt Rohbilder enthält Ein- or Mehr markierten Strukturen als Eingabe. Es gibt, je nach einer Anzahl von Parametern, die eingestellt werden, da die Software ausgeführt wird, SPA Modelle die durchschnittliche Verteilung der markierten Komponenten innerhalb der abgebildeten Strukturen zeigen.

Das Ziel des Protokolls ist präzise SPA Modelle der durchschnittlichen Lokalisierungen von Komponenten innerhalb abgebildeten Strukturen zu erzeugen , was gemäß der Pipeline in Figur 1 skizziert. Wie in Figur 1 gezeigt, wird die Software - Workflow nützlicherweise in drei Stufen unterteilt. Die erste Stufe ist zu segmentieren große Bilder, für jeden Kanal in Stapeln von Teilchen führt. Diese Partikel sind die Einheiten, die gemittelt werden, werden Modelle zu erzeugen und Samen für die Modellerzeugung zu produzieren. Die zweite Stufe ist Samen Bilder zu erzeugen, die verwendet werden, den gesamten Satz von Teilchen, die in der letzten Stufe zu registrieren. Dies wird durch die Wahl eines Referenzkanals durchgeführt und manuell Teilchen in diesem Kanal auszuwählen, der die s beitrageneeds. Die Samen werden in diesem Referenzkanal gewählt, sondern kann für alle Kanäle erzeugt werden. Partikel werden zunächst durch Anpassen einer Gauß'schen 2D in diesem Kanal neu ausgerichtet. Alle Partikel, die ausgewählt und neu ausgerichtet wurden, werden dann gemittelt, um einen Samen zu produzieren. Für jede gemeinsame Struktur in den Daten ersichtlich, die modelliert werden, sollten Teilchen als Keime ausgewählt werden, die klar und deutlich, dass die Struktur darstellen. Die Schnittstelle zu diesem Zeitpunkt ist auch nützlich zum Abtasten der Daten für solche Strukturen.

Die letzte Stufe ist es, Modelle zu erzeugen, unter Verwendung einer Schablonenanpassung. Dies ist ursprünglich auf den Samen erzeugten Bilder im vorherigen Abschnitt durch Kreuzkorrelation extrahiert durch die Registrierung der Partikel erreicht. Eine Untergruppe der registrierten Teilchen zusammen gemittelt, und der Prozeß iteriert wird weiter Modell mittlere quadratische Fehler zu reduzieren, falls gewünscht. Diese Teilmenge wird durch die Einstellung eine minimale Ähnlichkeit gegen den Samen bestimmt, die erfüllt werden müssen. Wenn Modellgleichzeitig in mehreren Kanälen s wird die gemeinsame Ähnlichkeit oder der Mittelwert der Ähnlichkeiten für jeden Kanal verwendet. Die resultierenden Modelle und die registrierten Teilchen, die zu ihnen trugen dann analysiert werden können, weiter.

Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll und Video des Originalpapier 10 ergänzen das Softwarepaket im Detail zu beschreiben. Die Leser werden ermutigt, diese sorgfältig für zusätzliche Hinweise in Bezug auf die Nutzung der Software zu überprüfen. Es gibt drei Hauptstufen: Partikelextraktion, die Segmente große Bilder in einzelne Partikel; Auswahl des Saatguts, wobei gemeinsame Strukturen sind in den Daten identifiziert und ausgerichtet Samen zu produzieren, die in der letzten Stufe verwendet werden; und die Modellerzeugung in der Schablonenanpassung auf diesem Samen basierten richtet die extrahierten Teilchen und mittelt eine Teilmenge der SPA-Modelle zu erzeugen.

1. Einrichtung Vor der Software-Paket Lauf

  1. Bereiten Sie die Proben der Struktur unter Studie auf einem Deckglas oder in den entsprechenden experimentellen Bedingungen.
  2. Bild der Proben mit Superauflösung Fluoreszenzmikroskopie, wie strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) 11 oder stimulated Emission Depletion (STED) 12 Mikroskopie.
    HINWEIS: Die genauen Einzelheiten, wie die Vorbereitung und Bildproben hängen stark von der Art der Struktur untersucht, so dass die einschlägige Literatur zu Rate gezogen werden sollte. Als Beispiel verwendete das genaue Verfahren zur Herstellung von Proben und Abbilden von Vaccinia-Virus, wie die hier, im repräsentativen Ergebnis Abschnitt beschrieben.
  3. Erstellen Sie Bilder von mehreren Sichtfeldern eine große Anzahl von separaten Kopien der Struktur oder Teilchen zeigen, vorzugsweise Tausende. Bildteilchen, die voneinander so gut wie möglich voneinander getrennt sind und dafür sorgen, dass die Bilder frei von Schmutz oder anderen fluoreszierenden Strukturen sind, die nicht von Interesse sind.
  4. Öffnen Sie alle Bilder, die Partikel in Fidschi, indem Sie die Dateien in den Fidschi-Symbolleiste oder indem Sie „Datei“> „Öffnen“ enthält.
  5. Wählen Sie „Bild“> „Stapel“> „Extras“> „verketten“ verketten dieBilder in einem einzigen Stapel. Wenn dann das resultierende Bild eine Hyperstack ist, schalten Sie ihn in einen Stapel, indem Sie „Bild“> „Hyperstacks“> „Hyperstack Stack“.
    HINWEIS: Der letzte Stapel sollte Einlagerungen Kanäle. Wenn es zwei Kanäle gibt, sollte die erste Scheibe in dem Stapel seinen Kanal 1 von dem ersten Bild, soll die zweite Scheibe der entsprechende Kanal 2, kann die dritte Scheibe sollte Kanal 1 aus dem zweiten Bild, und so weiter.

2. Extrahieren die Partikel

  1. Wählen Sie das Bild zu segmentieren und wählen „Viral Structures Extract“. Wählen Sie, wo die extrahierten Teilchen speichern und betrachten Sie die „Extract Viral Structures“ Dialog (Abbildung 2).
  2. Extraktionsparameter mit anfänglichen Schätzungen zuweisen, indem sie in den „Extract Viral Structures“ Dialog Eingabe wie folgt. Feinabstimmung dieser Parameter nach der Bildsegmentierung der Vorschau.
    1. Stellen Sie die tauber der Kanäle in der Datenmenge als die Anzahl der unterschiedlichen Fluoreszenzkanäle , die abgebildet worden sind ( zum Beispiel 2).
    2. Stellen Sie den Referenzkanal, aus dem Partikel durch Detektion von Peaks in diesem Kanal extrahiert werden, indem die Anzahl der die Auswahl des Kanals eintritt. Wählen Sie den beständigsten Kanal; das heißt, in der der Kanal die meisten Teilchen haben das gleiche Aussehen.
      HINWEIS: Wenn möglich, Teilchen in diesem Kanal wird eine zentrale Maximum haben.
    3. Wählen Sie, ob eine Pre-Detektions-Gauß-Unschärfe anzuwenden. Stellen Sie die Pre-Detektions-Gauß-Unschärfe auf 0 keine Unschärfe anzuwenden; Wenn dieser Wert erhöht ist, ein Gaussian blur Filter des gegebenen Radius ist, bevor lokale Maxima Detektion angewendet. Mit dieser Funktion , wenn der Referenzkanal keinen zentrales Maximum hat (beispielsweise Ringform); Verschwimmen induziert das Auftreten von einem.
      HINWEIS: Segmented Regionen von Interesse (ROIs) haben nicht die Gaußsche Unschärfe auf sie angewendet, da diese Funktion nur Gebrauch istd zu positionieren ROIs im Referenzkanal.
    4. Stellen Sie den ROI Radius (die um jedes lokales Maximum eingestellt werden) in Pixel. Wähle einen solchen Wert, dass die ROIs sind etwas größer als die größten Teilchen, wie beispielsweise in 3. Wenn beispielsweise die größten Partikel einen Durchmesser von etwa 30 Pixeln zu haben scheinen (etwa mit dem Auge geschätzt) und dann den ROI Radius auf 20 Pixel.
    5. Die Anzahl der ROIs pro Frame auf einen anfänglichen, relativ kleinen Wert unter 100 zu verwenden.
    6. Legen Sie die maximale ROI überlappen. Wenn die Teilchen gut getrennt sind, halten diese kleine; wenn Teilchen gruppiert sind, erhöht dies die ROIs zu ermöglichen, überlappen.
  3. Wählen Sie „Vorschau“.
    HINWEIS: Wenn diese Option ausgewählt wird, werden die extrahierten ROIs für den Referenzkanal mit dem aktuellen Rahmen verbunden erscheinen.
  4. Stellen Sie den ROI Radius, die Anzahl von ROIs, die maximale Überlappung ROI haben ROIs geeigneter Größe rund um so viele Teilchen wie möglich, Wie in Abbildung 3.
  5. Wählen Sie „OK“, um die Segmentierung zu führen. Schließen Sie das Bild und den ROI-Manager.
    HINWEIS: Ändern Sie nicht die Namen der Dateien der Partikelmengen. Diese Namen müssen im Format „Viruspartikel - ChannelX“ für die folgenden Abschnitte.

3. Wählen Sie Seeds

  1. Wählen Sie „Gene Seeds“, wählen Sie den Ordner , in dem die extrahierten Teilchen gespeichert werden, und zeigen Sie den „Gene Seeds“ Dialog und Fenster (Abbildung 4).
  2. Vergeben Anfangskeim-Auswahlparameter, indem sie in den „Gene Seeds“ Dialog eintreten, wie folgt.
    1. Stellen Sie den Referenzkanal, ausgestattet werden auszurichten und in der Mitte alle Kanäle. Wähle einen Kanal, in dem die meisten Teilchen, die das gleiche Aussehen haben, und das ein zentrales Maximum, wenn möglich.
    2. Wählen Sie die Boxen für alle Kanäle, für die ein Samen erzeugt werden soll.
    3. Wählen Sie, ob die Samen rotat sein sollteed um 90 °. Mit dieser Funktion können Sie die Ausrichtung im Einklang mit anderen Modellen haben
    4. Wählen Sie, ob eine Vororientierung Gaußsche Unschärfe anzuwenden. Stellen Sie den Unschärferadius für jeden Kanal 0 keine Unschärfe anzuwenden. Erhöhen Sie diesen Wert eine Gaußsche Unschärfe-Filter des vorgegebenen Radius vor Neuausrichtung anzuwenden. Verwenden Sie diese Funktion, wenn die Teilchen keine zentrale Maximum haben; Verschwimmen induziert das Auftreten von einem.
      HINWEIS: Samen wird nicht die Unschärfe hat angewandt, da diese Funktion nur ist die konsequente Ausrichtung zu erhalten.
    5. Wählen, ob Verschiebungskorrektur verwenden, um separat Samen Zentrum für Nicht-Referenzkanäle, obwohl sie nicht drehen kann, durch Aktivieren oder Deaktivieren der „Shift-Korrektur“ Boxen für jeden Kanal.
      HINWEIS: Verwenden Sie diese Option, wenn die Kanäle nicht gut miteinander ausgerichtet sind; es kann auch zum Ausrichten andere Kanäle ausschließlich gemäß dem Referenz, ohne Verschiebungskorrektur nützlich sein.
  3. Wählen Sie Partikel in Form von Samen zu verwenden. Suchen Sie in ter Partikel Sequenz ein Teilchen zu finden, die die Struktur ähnelt, die zu modellierenden ist und notieren Sie die Rahmennummer.
  4. Geben Sie die Nummer in der Box „Frames zu verwenden“, und mehrere Fenster wird angezeigt (Abbildung 5). Geben Sie Zahlen mehrere Rahmen durch Komma getrennt.
  5. Sehen Sie sich die Samen Rahmen und die resultierenden durchschnittlichen Samen in den Fenstern, die angezeigt werden.
    HINWEIS: Das Protokoll Samt ähnlich den Durchschnitt vorschlagen wird.
  6. Justieren des Referenzkanals, der Gaußschen Unschärferadius, und die Verschiebungskorrekturmöglichkeiten des Saatguts Auswahlprozess zu optimieren, so dass eine Reihe von Samenrahmen gefunden ein ähnliches Aussehen hat. Weiter Hinzufügen von Samen bis mittlere Samen erzeugt werden, dass zufriedenstellend die Struktur in den Daten gesehen ähnelt, die modelliert werden soll.
  7. Nennen Sie die Samen und wo sie gespeichert werden soll, und wählen Sie „OK“, um die endgültigen Samen Bilder für die spätere Verwendung in Modellgeneration zu speichern.

4. Generieren Modelle

  1. Sielect „Genemodelle auf Basis von Seeds“, wählen Sie den Ordner , in dem die extrahierten Teilchen gespeichert werden, und zeigen Sie den „Gene Models“ Dialog (Abbildung 6).
  2. Lädt die Samen für jeden Kanal durch das Kontrollkästchen verwenden.
    HINWEIS: Samen wird in einem Unterordner gespeichert werden, die in dem „Gene Seeds“ Dialog genannt wurden. Der Standardname ist „Analyse“. Achten Sie darauf , die Samen Durchschnitt zu wählen, nicht die Frames, die auch als Referenz gespeichert werden.
  3. Anfangsmodell-Generierungsparameter zuordnen, indem sie in den „Genen Model“ Dialog eintreten, wie folgt. Feinabstimmung später diese Parameter.
    1. Auswählen, ob ein Referenzkanal für die Ausrichtung verwendet werden, die Translationen und Rotationen nur aus dem Referenzkanal berechnet und wendet sie auf allen Kanälen. Wenn Sie diese Option verwenden, wählen Sie den Kanal als Referenz zu verwenden.
      HINWEIS: Diese Option sollte nur gewählt werden, speziell einen Kanal als refere verwendennce, wie referenzbasierte Struktur Entdeckung wenn tun. Ansonsten wird es in weniger genauen Modellen zur Folge hat. Die Kanäle sollten auch wenn mit dieser Option ausgerichtet werden.
    2. Wählen Sie, ob Bildintensitäten während Schablonenanpassung zu quadrieren. Dies wird kleine Unterschiede betonen, so dass diese verwenden, wenn ein Modell zu schaffen, die besonders subtile Eigenschaften hat.
    3. Wählen Sie eine minimale Ähnlichkeit gegen Samen unter Verwendung der „Minimum Ähnlichkeit gegen Samen“ Schieber oder durch eine Zahl in das Feld eingeben.
      HINWEIS: Nur Partikel mit einer Ähnlichkeit mit den Samen größer als diese abgeschnittenen verwendet wird. 60-80% ist in der Regel eine gute Wahl für den Anfang.
    4. Legen Sie die maximale Anzahl der Iterationen auf 1, optimiert die minimale Ähnlichkeit gegen Samen und erhöht es später, je nach Bedarf.
    5. Wählen Sie die Felder, um die Elemente des Modells Erzeugungsprozess zu wählen, die angezeigt werden.
      HINWEIS: „Show Samt“ werden die Samen an, die mit der boxe geladen wurdens an der Spitze des Dialogs. „Show-Modelle“ werden alle Iterationen der Modelle an, die aus Mitteln der Teilmenge von Teilchen erzeugt werden, die die minimale Ähnlichkeit gegen Samen erfüllt. „Show MSE“ ein mittlerer quadratischer Fehler (MSE) Bild anzuzeigen, das die Bereiche des Modells unterstreicht, dass die meisten variabel sind. „Show-Partikel“ wird die Teilmengen des Partikels anzeigen, die verwendet werden, um die Modelle zu erstellen, registrierten gemäß der höchsten Iteration des Modells, das angezeigt wird.
  4. Wählen Sie „Vorschau anzeigen“, um eine Vorschau-Modelle zu generieren und die Ergebnisse anzuzeigen.
    HINWEIS: Dies ist der rechenintensiven Schritt des Prozesses. Die Laufzeit für einen Satz von einem paar tausend Teilchen mit einem Durchmesser von einigen zehn Pixeln auf einem Desktop-PC sollte etwa 10 Minuten betragen. Wenn die Rechenzeit ein Problem ist, sollte Anwender versuchen, zuerst den Algorithmus auf einem kleineren Teilmenge der Daten oder einen kleineren ROI Radius verwendet in Schritt 2.2.4, falls möglich.
  5. Sehen Sie sich die Erzeugungd Modelle und die Parameter optimieren, vor allem die minimale Ähnlichkeit gegen Samen. Erhöhen Sie die minimale Ähnlichkeit gegen Samen bis nur wahre Teilchen der modellierten Morphologie werden in das Modell aufgenommen.
  6. die maximale Anzahl von Iterationen erhöhen, indem die „maximale Anzahl von Iterationen“ slider oder durch eine Nummer in das Feld eintritt, und ermöglicht es dem Modellerzeugungsprozess iteriert werden. Verwenden Sie einen Wert von etwa 10 für die maximale Iteration.
  7. Nennen Modelle und wählen Sie „OK“, um Modell Evolution Stapel zu speichern, die alle Iterationen des endgültigen Modell Erzeugungsprozesses enthalten.
    HINWEIS: Wenn die minimale Ähnlichkeit gegen Samen so hoch ist, dass keine Partikel diese Ähnlichkeit haben, werden nichts aktualisiert. Wenn das Plugin zu gefrier erscheint, die Möglichkeit zu prüfen, dass die minimale Ähnlichkeit zu hoch ist.

Representative Results

Hier zeigen wir die Software auf dem Modell Pockenvirus, Vaccinia-Virus. Eines der komplexesten Säugerviren, Vaccinia - Pakete etwa 80 verschiedene Proteine innerhalb eines 350 x 270 x 250 nm 3 ziegelförmigen Teilchen 13, 14. Drei Substrukturen sind erkennbar durch Elektronenmikroskopie: ein zentraler Kern, der den dsDNA-Genom enthält; zwei proteinösen Strukturen, genannt seitlicher Körper, der den Kern flankiert; und eine einzige Bilayer Proteolipids Hülle 15. Die große Größe, komplexe Struktur, und amenability rekombinante fluoreszierendes Protein-Tagging machen Vaccinia ein ausgezeichnetes System den VirusMapper Workflow zu demonstrieren.

Mit der Software wie hier beschrieben, kann die Verteilung einer Vielzahl von Proteinen auf der Vaccinia-Virion modelliert werden. Ein Protein wurde markiert und bebildert, gegebenenfalls in Kombination mit einem anderen Protein der bekannten Verteilung als Referenz und der Software wurde wie beschrieben verwendet, auf den Partikeldurchschnittsmodelle der Lokalisierung dieses Proteins zu produzieren. In diesem Beispiel wurden zwei Proteine ​​modellieren, das innere Kernprotein L4, und die Hauptkörperkomponente F17 Seiten.

Rekombinantes Vaccinia - Virus , das F17 hat getaggt mit GFP und L4 getaggt mit mCherry 16 verwendet wurde. Gereinigtes Virus wurde von ihnen bei Raumtemperatur für 30 min Beschichten in 1 mM Tris, pH 9, und gebunden an gewaschen, Hochleistungsdeck verdünnt. Die Proben wurden dann für 20 min durch Anlegen von 4% Formaldehyd in PBS fixiert. Die Deckgläser wurden in Antifade Eindeckmediums sofort auf Objektträger montiert. Imaging wurde von SIM auf einem kommerziellen SIM-Mikroskop durchgeführt. Ein Sichtfeld wurde Hunderte von Viren und Bilder enthält, die ausgewählt wurden mit 561 nm (32 & mgr; m-Gitter-PE unter Verwendung von 5-Phasenverschiebungen und 3 grid Rotationen erworbenRIOD) und 488 nm (32 & mgr; m Gitterperiode) Laser. Die Bilder wurden mit einer sCMOS Kamera erfaßt und verarbeitet, um die Mikroskop-Software. Kanäle wurden mit den gleichen Bilderfassungseinstellungen abgebildet, basierend auf einer mehrfarbige bead Rutsche ausgerichtet ist. Nach SIM Rekonstruktion und Kanalausrichtungs Bilder wurden in Fiji geöffnet und zu einem einzigen Bildstapel verkettet.

Virale Partikel wurden aus den Bildern mit dem L4-Kanal als Referenz extrahiert und ohne eine Gaussian blur Anwendung, da diese Teilchen eine zentrale Maximum aufweisen. Rund 15.000 Teilchen wurden in diesem Experiment extrahiert.

Aufgrund der Geometrie von Vaccinia, hat der seitliche Körper ein deutlich anderes Aussehen auf der Grundlage des Virus Orientierung. Wir visualisiert zwei Orientierungen, in denen entweder eine oder zwei seitliche Körper unterschieden werden konnten. Ich bezeichnen diese Orientierungen als frontaler und sagittalen, Respektively.

Separate Samen für die frontale und sagittale Ausrichtung durch die Suche durch die Partikel Liste ausgewählt wurden bei der „Gene Seeds“ Stufe (4 und 5); Partikel, die deutlich in eine Richtung oder der andere wurde ausgewählt. Der L4-Kanal wurde als Referenzkanal verwendet zueinander die Samen auszurichten. Auch hier war keine Gaußsche Unschärfe notwendig. 5 Teilchen für jede Ausrichtung wurden ausgewählt und wurden gemittelt, um die Samen zu produzieren.

Modelle wurden für jeden dieser Samen basierten Orientierung erzeugt. Weder ein Referenzkanal noch quadrierten Intensitätswerte wurden verwendet. Die maximale Anzahl von Iterationen wurde anfänglich auf 1, und die minimale Ähnlichkeit wurde eingestellt etwa 1.000 Partikel jeweils umfasst, die ein einheitliches Erscheinungsbild für jede Orientierung gegeben. Die maximale Anzahl der Iterationen wurde dann erhöhtfür die Konvergenz des Modells ermöglichen. Modelle wurden somit für die beiden Orientierungen in den beiden Kanälen (7) erzeugt wird .

Abbildung 1
Abbildung 1: VirusMapper Workflow. Das Plugin ist in drei Hauptphasen. Virale Partikel extrahiert wird von großen Bildern, Vorlagenbilder oder Samen sind semi-manuell aus den Daten ausgewählt, und die endgültigen SPA Modelle werden aus den Daten, die durch Bezugnahme auf die Samen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: "Extract Viral Structures" Dialog. Bei der Auswahl von „Extract Viral Structur es“, dieser Dialog erscheint. Die Parameter sollten für eine optimale Segmentierung mit ersten Schätzungen werden gefüllt.‚Vorschau anzeigen‘kann dann ausgewählt werden, die ROIs erlaubt angesehen werden und die Parameter feinabgestimmt werden. Bitte klicken Sie hier um ein anzuzeigen größere Version der Figur.

Abbildung 3
Abbildung 3: Extraktionsparameter einstellen. Nachdem die ROIs der Vorschau, die der ROI Radius, Anzahl der ROIs und maximale Überlappung ROI so eingestellt wird, extrahiert werden, eine Situation wie diese zu erreichen. ROIs sind etwas größer als die Partikel, alle Teilchen in einem ROI enthalten und ROIs ausreichend gruppierten Partikel überlappen können räumlich voneinander getrennt werden.ank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Generieren Schablonenanpassung Samen. Der „Gene Seeds“ -Dialog (1) setzt die Parameter aus zugewiesen werden. Die Referenzteilchen Sequenz (2) ermöglicht es dem Benutzer, durch Partikel in dem Referenzkanal zu scannen. Wenn ein Teilchen in der Referenzsequenz Teilchen, neu ausgerichtet Teilchen für alle Kanäle angeschaut wird, können in den neu ausgerichteten Teilchen Vorschauen (3) gesehen werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: seed Bilder hinzufügen. Als Samen werden auf die zugegebene „Frames zu verwenden,“ Box, der Durchschnitt aller Samen (4) und die damit verbundenen Rahmen (5) angezeigt. Teilchen, die zu den aktuellen durchschnittlichen Samen ähnlich sind, wird in dem Dialogfeld (6) vorgeschlagen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: „Gene Modelle“ -Dialog. Bei der Auswahl von „Modelle generiert Saat Basierend“, wird dieser Dialog angezeigt. Die Parameter sollten mit ersten Schätzungen für die optimale Modellerzeugung gefüllt werden, und die Elemente der Modellerzeugungsverfahren während der Berechnung gezeigt werden, ausgewählt werden. „Vorschau anzeigen“ kann dann ausgewählt werden, so dass die Modellgenerierung Prozess ausgeführt und die Parameter feinabgestimmt werden.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7
Abbildung 7: Die Modelle mit VirusMapper erzeugt. Vaccinia-Virions mit dem L4-Core-Protein mit der Etikette mCherry F17 und dem Seitenkörperprotein mit EGFP markiert wurden unter Verwendung von SIM abgebildet. Die Modelle wurden dann mit der Software erzeugt, wie im Protokoll beschrieben. Zwei Orientierungen, frontale und sagittale, sind durch das Auftreten der Seitenkörper aus. Maßstabsbalken = 100 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Mit diesem Verfahren werden die Forscher ausgestattet, um die Leistung von SPA und SR-Mikroskopie zu kombinieren, um hochpräzise, ​​Mehrkanal-2D-Modelle der Proteinarchitektur von Viren und andere makromolekulare Komplexe zu erzeugen. Allerdings sollten einige wichtige Aspekte berücksichtigt werden.

Samen sollte eine Struktur darzustellen gewählt werden, die konsistent zu sehen ist. Somit sollten die Rohdaten sorgfältig geprüft werden, bevor die Samen ausgewählt werden. Dies ist wichtig, zu verhindern, dass voreingenommen Modelle. Auswahl kann durch die Untersuchung der minimalen Ähnlichkeitsschwellen validiert werden benötigt, um eine bestimmte Anzahl von Partikeln in den Modellen enthalten. Offensichtlich für eine Wahl des Saatguts, je höher diese Schwelle für eine bestimmte Anzahl von Partikeln sein muss, je mehr die Struktur ist offensichtlich in den Daten.

Das Konzept Template-Matching ist besonders nützlich, wenn es Heterogenität in den Daten vorhanden ist. Alle verschiedenen Strukturen, die vi sindlich sollte für jeden Fall geschaffen identifiziert und verschiedene Modelle werden. Durch die Trennung von heterogenen Strukturen in einem Kanal, aber gleichzeitig Modelle in einem zweiten Kanal zu schaffen, können Muster entstehen, dass nicht sofort erkennbar gewesen.

Eine weitere Überlegung zu beachten bei der Verwendung dieses Algorithmus ist, dass das Iterationsverfahren stochastische Asymmetrie maximiert. Wenn beispielsweise eine Struktur mit zwei symmetrischen maximum Modellierung alle leichten Asymmetrien zwischen den Maxima werden miteinander während der Iteration ausgerichtet werden, und das endgültige Modell wird somit maximal asymmetrisch sein. Ist dies nicht eine bekannte Symmetrie in der Struktur modellierten, widerspiegelt dann sollte dies berücksichtigt werden. Derzeit ist die einzige Möglichkeit, diese Maximierung zu vermeiden, ist die Anzahl der Iterationen auf 1 zu begrenzen, obwohl eine mögliche Entwicklung wäre für VirusMapper Symmetrieachsen in den Modellerzeugungsprozess zu integrieren. Alle neuen Versionen von VirusMapper wird available auf der referenzierten Webseite (siehe Materialien Tabelle). Die Benutzer werden auch eine FAQ finden Sie hier alle gängigen Fragen zu beantworten.

Die Software wie beschrieben, ist anwendbar auf jede Struktur, die mit ausreichender Auflösung abgebildet werden kann, um die Funktionen zu visualisieren, die der Benutzer wünscht, zu modellieren. Obwohl SPA Auflösung verbessern, wird es eindeutig nicht um die Sichtbarkeit von Funktionen zu verbessern, die sonst nicht sichtbar sind. Dieses Protokoll wird daher nicht eine Methode, um die Qualität der Daten zu verbessern. Wie bei jeder Technik, sorgfältige Probenvorbereitung und Optimierung der Abbildungsstrategie wird die saubersten Daten und die besten resultierenden Modelle bieten.

Die Wahl der SR Bildgebungsmodalität ist auch wichtig, und in der Regel auf der Probe in der Hand ab. VirusMapper validiert wurde , gut mit SIM und STED 10, und es kann auch mit hochwertigen Lokalisierungsmikroskopie Daten verwendet werden, aber Vorsicht ist in diesem Fall getroffen werden,als spärliche Beschriftung könnte zu Problemen ähnlich denen der Asymmetrie Maximierung.

Derzeit ist VirusMapper der einzige frei verfügbare Algorithmus für die Einzelpartikelanalyse von Fluoreszenzbildern und die einzige allgemeine Zwecke 2D SPA Lungs Software. Andere Studien , die 4 Verwendung der gleichen Prinzipien gemacht haben, 6, 8 haben kundenspezifische Software für jede einzelne Studie spezialisiert verwendet. General-purpose Algorithmen zur Rekonstruktion von 3D - Daten wurde 5 veröffentlicht, 18, obwohl keine Software zur Verfügung gestellt wurde.

Wenn es verwendet wird, wie in diesem Artikel beschrieben ist, kann verwendet werden VirusMapper präzise, ​​genau zu erzeugen, und robuste Modelle der hochmolekularen Proteinarchitektur von Viren und anderen Komplexen. Mit diesen Modellen können die Forscher nehmen genaue Messungen der durchschnittlichen Abmessungen der Strukturures untersucht, so dass potenziell sie biologische Schlussfolgerungen erreichen, die sonst nicht möglich gewesen wären.

Darüber hinaus mit den Multi-Channel-Fähigkeiten dieser Technik ist es möglich, eine unbegrenzte Anzahl von Proteinen und Komponenten innerhalb Komplexe abzubilden und neuartige Proteinorganisation zu entdecken. Die Veränderungen der nanoskaligen Struktur in verschiedenen biologisch relevanten Bedingungen, wie zum Beispiel verschiedene Stadien eines Virus-Lebenszyklus, hat das Potenzial, wertvolle Einblicke in der Biologie zu bieten.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir möchten, dass Corina Beerli, Jerzy Samolej, Pedro Matos Pereira, Christopher Bleck und Kathrin Scherer für ihre Beiträge zur ursprünglichen Entwicklung und Validierung von VirusMapper danken. Wir möchten auch Artur Yakimovich für seine kritische Lektüre des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BB / M022374 / 1) (RH) finanziert werden; Kernfinanzierung an das MRC-Labor für Molekulare Zellbiologie, University College London (JM); die European Research Council (649.101-UbiProPox) (JM); und das Medical Research Council (MR / K015826 / 1) (RH und JM). RG wird von der Engineering and Physical Sciences Research Council (EP / M506448 / 1) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fiji Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper developed by the Henriques lab Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium Vector Labs H-100
Elyra PS1 Zeiss
ZEN BLACK Zeiss Image processing software for SIM
High performance coverslip Zeiss  474030-9000-000
TetraSpeck beads ThermoFisher T7279

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References

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