En skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet Amyloid Beta 42 och Amyloid Beta 40 Peptider som kan oligomerbildning

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Häri rapporterar vi en skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet amyloid beta 42 (Aβ42) och amyloid beta 40 (Aβ40) peptider som kan oligomerbildning. Amyloid beta är en i hög grad aggregation benägen, hydrofob peptid inblandad i Alzheimers sjukdom. Den amyloidogeniska karaktären av peptiden gör dess rening en utmaning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Alzheimers sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som effekter över 35 miljoner människor världen över. 1 Inblandad kraftigt i början och utveckling av sjukdomen, är den mycket sammanläggning liggande, hydrofoba peptid Amyloid beta (AP). 2 Ap varierar från 36 till 43 aminosyror i längd, dock är det tänkt att den 42-aminosyra-variant, amyloid beta 42 (Aβ42), är den giftigaste formen av proteinet. 3 Detta beror till största delen på förmågan hos Aβ42 att lätt bilda diffunderbara, oligomera arter som anses vara särskilt neurotoxiska enheter. 4 För att öka vår förståelse av Ap-peptiden, är det viktigt att rutinmässigt erhålla hög renhet material. Närvaron av spår av föroreningar har visat sig dramatiskt förändra aggregering propensity egenskaperna hos peptiden. 5

Traditionally har den högupplösande vätskekromatografi (HPLC) separation av hydrofoba peptider, såsom Ap gjorts genom användning av en kombination av C 4 eller C 8 kiseldioxidbaserade stationära faser och en sur mobil fas. 6 kan dock sådana förhållanden utgör en utmaning för rening av peptiden. Den låga isoelektriska punkten för Ap-peptiden (pl ungefär 5,5) 7 innebär att under sura betingelser, är peptid aggregation ökas och som ett resultat breda, icke-upplösta HPLC-toppar som ofta är svåra att isolera produceras (Figur 2A). Dessutom sådana breda toppar innehåller ofta föroreningar som kan påverka aggregering profil av peptiden, och vanligtvis kräver efterföljande omgångar av rening som dramatiskt kan påverka mängden peptid som produceras.

Poly (styren / divinylbensen) stationär fas, PLRP-S, representerar ett alternativt sätt att purifying hydrofoba peptider. Den stationära fasen har varit anställd vid reningen av ett antal olika proteiner och budbärare ribonukleinsyror (mRNA). 8, kräver 9 Den PLRP-S stationär fas ingen ytterligare alkyl ligand för omvänd fasseparation, och ännu viktigare är kemiskt stabil vid högt pH vilket leder till aggregatupplösning av peptiden. 7 Häri rapporterar vi en skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet amyloid beta 42 (Aβ42) och amyloid beta 40 (Aβ40) peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparativ HPLC Rening av Aβ40 eller Aβ42 peptid

  1. Förbered följande buffertar för HPLC-rening.
    1. Förbereda buffert A (20 mM NH4OH) genom att tillsätta 1,3 ml NH4OH (28% lösning) till 1000 ml ultrarent vatten.
    2. Förbereda buffert B (80% acetonitril med 20 mM NH4OH) genom att tillsätta 1,3 ml NH4OH (28% lösning) till en lösning av 800 ml av HPLC-kvalitet acetonitril och 200 ml ultrarent vatten.
    3. Förbereda provupplösning buffert (0,1% NH4OH) genom att tillsätta 100 mikroliter av NH4OH (28% lösning) till 100 ml ultrarent vatten.
  2. Ställ in HPLC-instrument som visas i figur 1.
    1. Montera lösningsmedels flaskor som innehåller buffert A och buffert B till inloppen i HPLC-pump med hjälp av polymerslangen. Fäst polymerslangen till HPLC-pump med en i ett stycke montering. Se till att polymer rör avvarje buffert är monterad på korrekt inloppsventil av instrumentet. Montera HPLC-pump med en avgasare.
    2. Par HPLC-pumpen med inloppet till 300 Å 8 ^ m 25 mm х 300 mm preparativ kolonn (Figur 1B, kolumnen längst till vänster, se Material List) användning av polymer-slang.
      1. Fäst polymer slangen till preparativ kolonn med ett stycke finger åtsittande. Se till att polymer kolumnen är orienterad på rätt sätt.
        OBS: Den stationära fasen i den preparativa kolonnen består av poly (styren-divinylbensen) partiklar. Den korrekta orienteringen av polymer kolumnen är markerad på det yttre höljet med en enda riktningspilen.
    3. Anslut utloppet av kolonnen till den dubbla våglängdsdetektor användning av polymer slang och ställa in våglängdsdetektor till 214 nm och 280 nm.
      1. Ändra våglängden genom att ändra detekteringsvåglängds parametrar i inställningsinstrumentet metoden alternativ påinbyggd HPLC-programvara.
    4. Fäst polymerslangen till inloppet av den våglängdsdetektor med en i ett stycke finger åtsittande. Fästa polymerslangen till utgångsventilen hos våglängdsdetektor. Fäst polymerslangen till utloppsventilen av HPLC-detektor med en i ett stycke finger åtsittande. Detta kommer att bli provsamlingen slangen.
      OBS: Avsaknaden av en stark kromofor på Ap-peptiden dikterar att 214 nm användas som den primära ultraviolett (UV) våglängd för maximal samling.

Figur 1
Figur 1: Experimentell inställning av HPLC-instrument som används för rening av amyloid beta-peptider. (A) Det kvaternära HPLC-pump utrustad med en avgasare och rörlig våglängdsdetektor inställd på 214 nm och 280 nm; (B) HPLC-kolonner som används för rening av de amyloid beta-peptider, frånvänster till höger, 25 x 300 mm 2 preparativ kolonn, 7,5 x 300 mm 2 semi preparativ kolonn och 4,6 x 250 mm 2 analytisk kolonn; (C) Manuell injektor med 20 mikroliter av rostfritt stål injektionsslinga som används för analytisk HPLC; (D) Manuell injektor med 10 ml rostfritt stål injektionsslinga som används för preparativa och semi preparativ rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Programmera HPLC programvara för att köra reningsmetoden såsom visas i tabell 1. Skriv reningsmetoden genom att ändra lösnings tidsplan parametern (i metoden alternativet inställningsinstrument inbyggd i HPLC-programvara). Slå på HPLC-pump genom att klicka på "på" -knappen på HPLC programvara.
    OBS: Pumpen börjar leverera börjar förhållandet mellan buffert A och buffert B genom preparative kolonn och HPLC-instrument.
    1. Låt systemet i 30 minuter för att helt jämvikt.
Tid / min % Av Buffert A a % Av buffert B b Flow Rate d / ml min -1
0 80 20 6
45 75,5 24,5 6
45,01 80 20 6
52,01 80 20 6
52,02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 c 6

<strong> Tabell 1: Tidsplan för rening av Aβ42 och Aβ40 peptider med hjälp av 25 × 300 mm polymer kolonn. en buffert A - H2O med 20 mM NH4OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH; c Ran under 15 minuter för att tvätta kolonnen före nästa injektion av prov; d För att kunna köra en flödeshastighet av 6 ml / min på HPLC-instrumentering, måste minskas till 200 bar tryckgränsen.

  1. Rening av peptiden provet Ap
    Obs: Den råa peptiden erhölls genom automatiserad fastfas-peptidsyntes. 10
    1. Lös 3 mg rå Ap-peptid i 4 ml av provupplösningen buffert. Sonikera provet i 30-60 s vid rumstemperatur och vid en frekvens av 40 kHz för att underlätta upplösningen.
    2. Injicera hela provet på HPLC-kolonnen med användning av en plastspruta 5 ml utrustad med en 16-gaugerostfritt nål stål. Köra renings förfarandet som det beskrivs i understeget 1,3.
      OBS: Systemet möjliggör provinjektion göras genom användning av en manuell injektor utrustad med en 10 ml rostfri injektionsslinga (figur 1D). Den önskade Ap-peptid kommer att eluera mellan 72 och 74 minuter som en skarp löst topp (figur 2C).
    3. Samla in provet i en 50 ml koniskt centrifugrör. Bekräfta identiteten hos Ap topp genom direktinsprutning masspektrometri av de insamlade eluent. 11 Store elueringsmedlet i upp till 12 h vid -20 ° C.
      OBS: Lagring av lösningen för perioder längre än 12 timmar rekommenderas inte på grund av risken för oxidation av peptiden.
    4. Isolera den renade peptiden genom flash frysa den uppsamlade alikvoten / alikvoter av Ap-peptiden i flytande kväve och lyofilisera. Utför frystorkning genom frystorkning provet vid en temperatur på -60 ° C och en pressäker på 20 mTorr under en period av 24 timmar.
    5. Köra den analytiska HPLC-protokollet som beskrivs nedan för att bestämma renheten hos Ap-peptiden. Förvara peptider i sin lyofiliserad form vid -20 ° C under en period av upp till 6 månader.

2. Analytisk HPLC-analys av det renade Ap Protein

  1. Förbered HPLC buffertar som beskrivs i underavsnitt 1.1. av ovanstående protokoll.
  2. Setup den analytiska HPLC såsom per steg 1.2.1 och såsom visas i fig 1 med 4,6 x 250 mm analytisk kolonn (Figur 1B, kolumnen längst till höger) och den manuella injektor med 20 mikroliter av rostfritt stål injektionsslinga (Figur 1C) monterad på instrument.
  3. Programmera HPLC programvara för att köra den analytiska metoden som visas i Tabell 2 följande instruktioner som liknar dem i steg 1,3.
tid /min % Av Buffert A a % Av buffert B b FLÖDESHASTIGHET / ml min -1
0 95 5 1
30 50 50 1

Tabell 2: Schema för HPLC-renhetsanalys av Ap-peptiden. en buffert A - H2O med 20 mM NH4OH; b 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH.

  1. Renhetsanalys av Ap-peptiden
    1. Bered en 1 mg / ml lösning av den renade peptiden genom upplösning av peptiden i provet buffertlösningen.
      OBS: Buffert recept kan hittas i underavsnitt 1,1. Proteinkoncentrationen bestäms genom mätning av protein absorption vid 280 nm (A 280 nm). 12 Den m olar extinktionskoefficient (ε) används för att bestämma koncentrationen är ε = 1490 dm 3 mol -1 cm -1. 13
    2. Injicera 20 mikroliter av 1 mg / ml (222 ^ M) lösning på HPLC-kolonnen och kör analysmetod som startades i steg 2,3.
      OBS: Den kvarvarande lösningen som inte används för analys kan snabbfrystes i flytande kväve och lyofiliserades för utvinning av Ap-peptiden. Frystorkning information kan hittas i underavsnitt 1.4.4. Ap-peptiden kommer att eluera från den analytiska kolonnen mellan 16 och 18 min (figur 2D). Använda inbyggd integration analysprogram som medföljer HPLC-instrument för att bestämma renheten hos Ap-peptiden. Renheten bestäms genom att integrera var och en av de individuella topparna på spektrumet och beräkning peptid-peak procentområdet. Normalt bör en rening av> 95% fastställas.

</ Html"Figur 2" src = "/ filer / ftp_upload / 55.482 / 55482fig2.jpg" />
Figur 2: Representant HPLC spår av Aβ42. (A) Traditionell C 4 kiseldioxid rening, betingelser: Buffert A: H2O med 0,1% trifluorättiksyra (TFA), buffert B: MeCN (acetonitril) med 0,1% TFA, gradient: 20 till 27% buffert B under 40 minuter följt med isokratisk 27% buffert B; (B) Preparativ rening med användning av 25 x 300 mm 2 polymer kolonn, betingelser: Buffert A: H2O med 20 mM NH4OH, buffert B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, lutning : 20 till 27% buffert B under 70 minuter följt av isokratisk 27% buffert B; (C) Optimerad preparativ rening med hjälp av 25 x 300 mm 2 polymer kolumnen villkor som beskrivs i tabell 1 ligger i underavsnitt 1.3 i protokollet beskrivande text; (D) Analytisk HPLC med användning av 4,6 x 250 mm 2 polymer-kolonn, diritions: Buffert A: H2O med 20 mM NH4OH, buffert B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, gradient-5 till 50% buffert B över 30 min. För del A, B och C den topp som motsvarar Aβ42 markeras med en asterisk. Uppsamling av den märkta Aβ42 topp i del C avslöjar en renhet av> 95%, såsom visas i del D. Masspektrometri användes för att bestämma identiteten på den Aβ42 topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reningen av den Aβ42 peptiden med användning av en kombination av den PLRP-S stationär fas och ett högt pH mobil fas resulterar i bildandet av en skarp, löst toppen för den Ap-peptiden vid en retentionstid mellan 72 och 74 min (figur 2C). Bekräftelse av identiteten av toppen sker genom direktinsprutning masspektrometri av den uppsamlade elueringsmedlet. Elueringsmedlet kan lagras vid -20 ° C i lösning i upp till 12 timmar. Längre perioder av lagring kan leda till oxidation av proteinet. För att isolera den renade peptiden, är eluenten snabbfrystes i flytande kväve och lyofiliserades. Analytisk HPLC av den renade peptiden visar en renhet av> 95% (figur 2D). Samma förfarande kan användas för att rena den Aβ40 peptiden (figur 3A) utan modifiering av metoden. Analytisk HPLC anger en renhet av Aβ40 vara större än 95% (Figur 3B). Figur 3
Figur 3: representativa HPLC spår av Aβ40. (A) Optimerad preparativ rening med hjälp av 25 x 300 mm 2 polymer kolumnen villkor som beskrivs i tabell 1 ligger i underavsnitt 1.3 i protokollet beskrivande text. Den topp som motsvarar Aβ40 är markerad med en asterisk. (B) Analytisk HPLC med användning av de 4,6 x 250 mm 2 polymer kolonn, betingelser: Buffert A: H2O med 20 mM NH4OH, buffert B: 80% MeCN / 20% H2O med 20 mM NH4OH, lutning : 5 till 50% buffert B över 30 min. Uppsamling av den märkta Aβ40 topp i del A avslöjar en renhet av> 95%, såsom visas i del B. Masspektrometri användes för att bestämma identiteten på den Aβ40 topp. Klicka hennee för att se en större version av denna siffra.

För att bekräfta att den renade peptiden kan bilda oligomera blandningar, utförde vi fotoinducerad tvärbindning av icke modifierade proteiner (picup) såsom tidigare beskrivits 14, 15 och kunde robust observera oligomerbildning. 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HPLC-rening av Ap-peptiden är mycket beroende på valet av både den stationära fasen som användes vid reningen och den mobila fasen väljs för att eluera peptiden. Den låga isoelektriska punkten för peptiden och hög benägenhet för aggregering render traditionella kromatografiska förhållanden för separation av hydrofoba proteiner (C4 eller C8 stationär fas i kombination med en sur mobil elueringsmedel) utmanande, med Ap-peptiden eluerades som en förlängd bred, icke-löst topp (Figur 2A).

För att kringgå detta problem, den PLRP-S stationär fas, kemiskt stabila vid högt pH befanns vara effektiva för rening av Ap-peptiden (figur 2B och 2C). Användningen av ett högt pH mobil fas minimeras graden av aggregering, och när optimerad, gav upphov till en kraftig, väl löst topp. I den optimerade protokollet, den procentuella andelen av buffert B var snabbt switched från 20% till 27% vid 52-minuters tidspunkt och som ett resultat, gav upphov till en väldefinierad Ap topp (figur 2C). Denna optimerade protokoll förlitar sig på alla av de hydrofoba orenheter som eluerades från kolonnen under den initiala 20-24,5% ökning av buffert B koncentration. Om föroreningar finns som är av samma hydrofobicitet som Ap-peptiden, kan då ytterligare optimering av HPLC-protokollet vara motiverat. Den optimerade metoden var mycket reproducerbar bland enskilda partier av syntetiserade Ap och kunde rena både 40 och 42 varianter av peptiden utan några ändringar i optimerade förfarandet (Figur 3). För båda peptiderna var renheten enligt bestämning med analytisk HPLC visade sig vara större än 95%.

Med tanke på de rapporter om spår av föroreningar som ändrar aggregationen benägenheten hos Ap-peptiden, är det lämpligt att en ortogonal biofysikalisk karakterisering utnyttjas för att bekräftaatt den renade peptiden är i stånd att undergå oligomerisering. Använda tidigare rapporterats protokoll vi valde att utföra picup. 14, 15 picup analys av de renade proteinerna visar den karakteristiska monomeren genom hexamer befolkningsfördelningen för Aβ40 peptiden och monomeren genom heptameren fördelning i samband med Aβ42 peptiden. 10 Dessa resultat bekräftar att rening av Ap-peptider med hjälp av PLRP-S stationär fas och ett högt pH mobil elueringsmedel resulterar i Ap proteiner som är kapabla att aggregering.

Reningsförfarandet rapporterat är utformad för att kunna rena upp till 3 mg av Ap-peptiden i en enda kromatografisk körning. För detta förfarande, är det kritiskt att ställa in flödeshastigheten hos HPLC-instrument vid 6 ml / min. Om lägre flödeshastigheter av HPLC-pump används, bör tiden HPLC-körning utökas för att tillgodose detta. Conversely, kan användningen av högre flödeshastigheter motivera en minskning av den tid HPLC-körning. Däremot kan minskning av den tid körningen resultera i samtidig eluering av Ap topp med andra toppar och därför sänka renheten av Ap-peptiden uppsamlades. Vidare kan HPLC-instrumentering och storleken av den kromatografiska kolonnen som används för rening kraftigt påverka den mängd material som kan renas i en enda körning. Om ingen topp produceras vid den förväntade elueringsmedel tiden av Ap-peptiden, och en stor topp alstras vid elueringsmedel tid som motsvarar lösningsmedelsfronten, då alltför mycket material ursprungligen laddades på kolonnen. Minska den mängd material som injicerades på HPLC-kolonnen för varje körning kommer att kringgå detta problem. När Ap-peptiden har renats, är det starkt rekommenderat att lösningen frystorkas så snabbt som möjligt. Långvarig lagring av peptiden i lösning kan leda till oxidation av Ap och således bildandet av orenheter. den puhet av Ap-peptiden bör alltid fastställas genom analytisk HPLC. Spårmängder av orenheter kan förändra aggregering benägenheten hos peptiden dramatiskt. Om det analytiska HPLC-spår visar närvaron av orenheter, sedan provet bör åter utsattes för HPLC-rening protokollet och dess renhet åter bestämdes genom analytisk HPLC.

Förhoppningen är att denna skräddarsydda förfarande för rening av Aβ42 och Aβ40 peptider kommer att vara till nytta för det vetenskapliga samfundet och tillåta användare att få hög renhet Ap kan oligomerbildning. Skulle det förväntas att detta förfarande skulle kunna anpassas till andra amyloidogena peptider som är svåra att isolera och rena.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Agilent för deras tekniskt stöd. Kate Markham och Rafael Palomino kredit för sin första hjälp i syntesen och reningen av Ap-peptiden och Dr Hsiau-Wei Lee tackade för hans hjälp att förbereda Figur 1 av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362, (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47, (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192, (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377, (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7, (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763, (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23, (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22, (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, (1), 330-335 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics