فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البروتينات كيناسس هي قادرة على التحكم في التغيرات الخلوية واسعة النطاق ردا على صفيفات معقدة من المحفزات، وقد وجه الكثير من الجهد للكشف عن تفاصيل مؤكدة لتنظيمها. وتشتمل كيناسيس على شبكات تشوير تكون عيوبها في كثير من الأحيان سمات لأشكال متعددة من السرطان والأمراض ذات الصلة، مما يجعل من منصة فحص قابلة للتلاعب في العوامل التنظيمية المنبع والتحقق من متطلبات رد الفعل الحرجة في البحث عن العلاجات المحسنة. هنا، نحن تصف مقايسة كيناز الأساسية التي يمكن تكييفها بسهولة لتتناسب مع أسئلة تجريبية محددة بما في ذلك ولكن لا تقتصر على اختبار آثار العوامل البيوكيميائية والدوائية، والتلاعب الجيني مثل الطفرة والحذف، وكذلك ظروف زراعة الخلايا والعلاجات للتحقيق آليات تشوير الخلية. هذا الاختبار يستخدم راديولبلد [γ- 32 P] أتب، والذي يسمح للمقارنات الكمية وتصور واضح من النتائج، ويمكن أن يكون وزارة الدفاعإفيد للاستخدام مع إمونوبريسيبيتاتد أو كيناز المؤتلف، ركائز محددة أو مكتوبة، في جميع أنحاء مجموعة واسعة من ظروف التفاعل.

Introduction

بروتينات كيناز هي إنزيمات متطورة حرجة لنقل الإشارات الخلوية إلى ردود مناسبة 1 . ونظرا لأدوارهم في الحفاظ على التوازن والوقاية أو تعزيز حالات المرض 2 ، وأساليب الكيمياء الحيوية لتقييم نشاط كيناز لا تزال أدوات قوية لتحديد معالم الإشارات حقيقية النواة 3 . على الرغم من أن استراتيجيات استخدام الأجسام المضادة الفوسفو محددة كانت مفيدة للغاية من حيث قياس آثار ظروف العلاج المختلفة على حالة الخلية إشارة 4 ، فحص كيناز يسمح لقياس آثار ظروف العلاج المختلفة مباشرة من حيث النشاط الأنزيمي من كيناز من فائدة. في حين أن هناك العديد من الخيارات لفحوصات مماثلة التي لا تستخدم المواد المشعة 5 ، ونحن لا نزال نعتمد على هذه الطريقة لكمية قوية من النتائج. هناكهي اثنين من التطبيقات النموذجية لهذا الفحص، على حد سواء قيمة لأسباب مختلفة: إمونوبريسيبيتاتد (إب) فحص كيناز ( الشكل 1 ) وفحص البروتين كيناز المؤتلف ( الشكل 2 ).

مقايسة كيناز إب مفيدة بشكل كبير لتحديد العوامل القادرة على تفعيل كينازات بروتين معينة وكذلك قياس ظروف العلاج المثبطة. وباختصار، يتم نقل كيناز الممزوجة حاتمة من الفائدة إلى خلايا حقيقية النواة مثقف، يتعرض لمجموعة متنوعة من العلاجات، إمونوبريسيبيتاتد، ومعاير للقدرة على دمج الفوسفات راديولبلد في ركيزة نموذج (على سبيل المثال الميالين البروتين الأساسي (مب)). ويمكن أيضا إجراء فحص كيناز إب دون اللجوء إلى أوفيركسريسيون، إما عن طريق إمونوبريسيانتاتيون من البروتين الذاتية أو أي عدد من تقنيات تحرير الجينوم. لأن العلاجات تدار في الثقافة، وهذا الأسلوب يمكن الكشف عن التحفيز تنتقل من خلال عوامل متعددة المنبعأو مسارات موازية من خلال قراءة في المختبر . ميزة رئيسية واحدة من هذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من العوامل المباشرة المنبع أو المصب أو مواقع الفسفرة فيه. وعلاوة على ذلك، مرة واحدة وقد تم تحديد ركائز محددة لكيناز من الفائدة، ويمكن استخدام نفس بروتوكول فحص كيناز مع مكونات المؤتلف لقياس نشاط معين نحو ركائز الطبيعية وتحديد مواقع فسفرة معينة عندما يقترن تحليل الطيف الكتلي. المواقع التي تم التعرف عليها بهذه الطريقة يمكن التحقق من صحة مزيد من المقايسات مع كيناز استخدام المسوخ الركيزة. وأخيرا، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للكشف وقياس أوتوفوسفوريلاتيون.

بروتوكول المقدمة هنا يفترض إما مخطط تنقية البروتين الأمثل أو طريقة ترنسفكأيشن للتعبير عن كيناز تقارب الموسومة من الفائدة في الخلايا المستزرعة. لمعارض أكثر تفصيلا من ترنسفكأيشن، تحلل، إمونوبرسيبيتاتيون، والبروتين بروتين تنقيةأوكولس، نقترح الإشارة إلى البروتوكولات كولد سبرينغ هاربور 6 . لمزيد من المعلومات حول تطوير مقايسة وتعديل، يرجى الرجوع إلى البروتين الفسفرة: طرق مختارة في الإنزيمية 7 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. كيناز تنقية الموارد و إمونوبريسيبيتاتيون خط أنابيب

ملاحظة: كيناسيس للاستخدام مع هذا الفحص قد تكون مصدرها إمونوبريسيبيتاتس من الخلايا المستزرعة أو وسائل المؤتلف مثل تنقية تقارب الموسومة 6 . وفيما يلي بروتوكول عام للعلم الموسومة مناعي التي قد تضطر إلى تعديل اعتمادا على كيناز الفائدة. يجب حفظ كل شيء على الجليد عند الإمكان.

  1. إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة إلى 200 ميكرولتر من ليسيتس الخلية (عادة ~ 1 ملغ / مل تركيز البروتين الكلي) واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
  2. غسل البروتين وحبات سيفاروس 2-3 مرات مع العازلة تحلل (انظر أدناه) عن طريق الغزل لفترة وجيزة في 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في 5000 x ج ("تدور اللمس")، وإزالة طاف مع ماصة، وإعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت .
    1. إعداد تحلل العازلة: 50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 7.7، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي مغكل 2، 1 ملي إغتا، 10٪ الجلسرين، 0.2 ملي أورثوفاناديت الصوديوم، 100 ملي فلوريد الصوديوم، 50 ملي β- غليسيروفوسفهات، 0.1٪ تريتون X 100 أو 0.1٪ نب-40.
  3. إضافة 30 ميكرولتر من الطين 50٪ من البروتين A الخرز سيفاروس في تحلل العازلة إلى ليسيتس؛ احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
  4. لمس تدور في 4 درجات مئوية لبيليه الخرز وإزالة طاف.
  5. غسل 3 مرات مع 1 مل من حبة غسل العازلة (1 M كلوريد الصوديوم، 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4).
  6. يغسل مرة واحدة مع 1X كيناز رد فعل العازلة (10 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.0، 10 ملي مغكل 2 ). إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزالة الخرز.

2. إنيتياليزينغ كيناس ردود الفعل

ملاحظة: لفحوصات كيناز إب، ~ 15 ميكرولتر من الخرز غير معلق هو نموذج البداية نموذجية. بالنسبة لفحوصات كيناز البروتين المؤتلف، تتراوح كميات البداية النموذجية من 0.1-1.0 ميكروغرام في 1-10 لأحجام التفاعل النهائية 25-50 ميكرولتر. ضبط وحدات التخزين من عينة البروتين المؤتلفs لتكون متساوية مع المخزن المؤقت يتم تخزينها في قبل تهيئة الفحص. عند استخدام كميات عالية من كيناز، وتشمل بروتين الناقل مثل بسا للمساعدة في الحفاظ على استقرار البروتين لمدة الفحص.

  1. إعداد 5X كيناز رد فعل العازلة الواردة أدناه:
    50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 8.0
    50 ملي مغكل 2
    50 ملي بنزاميدين (مثبط البروتياز)
    50 ملي دت (عامل تخفيض)
    250 ميكرومتر أتب (غير المسماة، أو "الباردة")
  2. الحفاظ على عينات كيناز على الجليد في أنابيب 1.5 مل. إعداد خليط التفاعل التالي في منفصلة، ​​المبردة 1.5 مل أنابيب:
    21 ميكرولتر H 2 O
    6 ميكرولتر 5X كيناز رد فعل العازلة
    1 ميكرولتر راديولبلد ("الساخنة") أتب
    2 الركيزة ميكرولتر (~ 5 ملغ / مل)
    ملاحظة: لفحوصات كيناز المؤتلف، قد يتم تعديل حجم لاستيعاب البروتين المنقى. حساب مثل هذا الحجم التفاعلي النهائي هو 30 ميكرولتر. استخدام هذه الوصفة لإعداد سيدمزج. عند استلام أتب المسمى، مخفف الأسهم في H 2 O إلى نشاط محدد من 0.01 ميسي / ميكرولتر قبل إضافة إلى خليط التفاعل.
  3. لتهيئة الفحص، إضافة خليط التفاعل الكامل إلى عينة كيناز واحتضان رد فعل في 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى 1 ساعة اعتمادا على نشاط كيناز يجري مقايسة.
    ملاحظة: عند العمل مع كيناز الذي لم يتم تقييم نشاط سابقا، إجراء دورة الوقت من النشاط كيناز مع فترات 5 دقائق بين نقاط الوقت.

3. رد الفعل إنهاء و سدز-بادج

  1. وقف رد فعل من خلال وضع على الجليد وإضافة 7.5 ميكرولتر 5X العازلة عينة ليملي 6 .
  2. الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة في كتلة الحرارة.
  3. اللمس تدور وتحميل 20 ميكرولتر لكل بئر على 10-15٪ سدز-بادج هلام. تشغيل هلام طويلة بما فيه الكفاية لفصل كيناز والركيزة (عادة 1 ساعة في قوة ثابتة من 5 W) تأكد من الحفاظ على جهاز هلام محمية للحد من التعرض ل 32
  4. هنا، استخدام أجهزة هلام محلية الصنع، ولكن القياسية المتاحة تجاريا مصغرة هلام هي مناسبة تماما. استخدم الأبعاد كما يلي:
    المواد الهلامية: 8 سم العرض، 5.5 سم طول (حل)، سمك 1.5 مم.
    أمشاط: 15 بئرا، سمك 1.5 مم، عرض 2.9 مم، عمق 16 ملم

4. جل تلطيخ والتجفيف

تنبیھ: یجب أن تکون جمیع الخطوات مؤکدة للحد من التعرض الشخصي ل 32 P باستخدام التدریع المشع وارتداء معدات الوقایة الشخصیة. لمزيد من المعلومات حول خطوات محددة يتم تضمين بعض المراجع المفيدة.

  1. إزالة هلام من الزجاج / الألومينا لوحات ومكان في 50 مل كوماسي وصمة عار (10٪ حمض الخليك الجليدي، 50٪ الميثانول، 0.25٪ R-250 صبغ) لمدة 1 ساعة على شاكر المداري تعيين إلى 50 دورة في الدقيقة. لهذه الخطوة استخدام حاوية أكبر قليلا من هلام نفسها. 8
  2. نقل هلام من وصمة عار لإصلاح الحل (10٪ جلي الخليك أسيد، 20٪ الميثانول) من أجل إزالة وصمة عار. روك الهلام في 600-700 مل من حل تحديد بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 50 دورة في الدقيقة. مكان قطع من رغوة أو معقود مناديل مختبر في الحاوية مع هلام لامتصاص صبغ كوماسي 8 ، 9 .
  3. إزالة هلام من تحديد الحل ونقع في 200 مل الميثانول لمدة 1-2 دقيقة مع التحريض لطيف حتى هلام يتحول الأبيض حليبي. وهذا سوف يساعد على منع تكسير خلال خطوة التجفيف.
  4. الرطب 14 سم × 14 سم قطعة من ورقة مرشح النوعي مع الميثانول ومكان على بلاطة هلام فراغ بلاطة. وضع هلام أسفل على الجانب الأمامي ورقة مرشح مواجهة.
  5. تغطية هلام مع التفاف البلاستيك بعناية لتجنب التجاعيد والهواء فقاعات. تشغيل مجفف لمدة 1.5 ساعة عند 80 درجة مئوية. بعد أن تم تحقيق الفراغ فتح الغطاء ولف أي فقاعات الهواء إذا لزم الأمر مع لينة المطاط المطاط.

5. أوتوراديوغرام والتلألؤ التهم

  1. إزالة دريهلام إد وإرفاق علامة أوتوراد، حاكم الفسفورية أو النقاط إلى ورقة الترشيح على جانب هلام. إذا كنت تستخدم النقاط تأكد من أنها في نمط غير المتماثلة. هذا سوف محاذاة هلام مع الفيلم بعد التعرض والتنمية.
  2. استخدام عداد جيجر للتحقق من شدة الإشارة. لتعرض الإشارات الأضعف في -70 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية مع شاشة تكثيف زيادة كثافة الفرقة الفيلم.
  3. في غرفة مظلمة وضعت هلام المجففة في فيلم كاسيت مع فيلم وشاشة تكثيف في الترتيب التالي من أعلى إلى أسفل: هلام، فيلم، وتكثيف الشاشة.
  4. إرفاق الشاشة المكثفة لغطاء الكاسيت والشريط هلام في مكان لجعل هذه الخطوة أسهل. تنبعث الشاشة المكثفة الضوء عندما تشعع جزيئات بيتا من 32 P. هذه الانبعاثات الخفيفة تخترق الفيلم أكثر كفاءة من جزيئات بيتا.
    1. تأكد من أن طول الموجة المنبعثة من تكثيف الشاشةالبرك إلى الطول الموجي الفيلم هو الأكثر حساسية ل.
    2. استخدام عداد جيجر لتحديد كم من الوقت لتترك التعرض ل: إذا كان عدد كيم ~ 100 أو أقل، حاول بين عشية وضحاها في -70 درجة مئوية. إذا العد هو ~ 10،000، تبدأ مع التعرض 1 ساعة وتحسين من هناك.
  5. في ختام التعرض إزالة الفيلم وتطوير في المعالج الطبي / الأشعة السينية فيلم. إذا تم إجراء التعرض في -70 إلى -80 درجة مئوية، إما السماح كاسيت لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة لتقليل التكثيف على الفيلم أو إزالة الفيلم مباشرة قبل التكثيف أشكال 10 .
  6. وضع الفيلم على ورقة هلام / مرشح المجففة ومحاذاة صورة علامة / النقاط مع علامات / النقاط على هلام المجففة. علامة على الفيلم العصابات المقابلة لمعايير البروتين. تسمية معايير البروتين والتي يمر ردود الفعل هي للرجوع إليها في المستقبل.
  7. استئصال العصابات من هلام التي تتوافق مع فرق من الفائدة على الفيلم ووضعهافي 7 مل قوارير التلألؤ. إضافة 4 مل من سائل التلألؤ والعد مع عداد التلألؤ السائل. تأكد من ضبط العداد لمراقبة نافذة طيف الطاقة الصحيحة ل 32 ص.
    ملاحظة: تأكد من أيضا مكوس الفرقة المقابلة للركيزة من حارة التحكم لا كيناز. سيتم استخدام هذا لحساب الإشعاع الخلفية التي سيتم طرحها من جميع التهم التلألؤ عينة.

6. تحليل النتائج

ملاحظة: يوفر أوتوراديوغرام التصور النوعي للنتائج. ولقياس الكميات الدقيقة، يمكن قياس التضمين 32 P بواسطة عداد التلألؤ. يتم التعبير عن البيانات عادة من حيث النشاط النسبي، كما هو مبين في الشكل 1B . وطالما تم الحفاظ على ظروف موحدة لجميع العينات، والقياسات النسبية لنشاط معين كافية لمقارنة العلاجات.

  1. عند حساب قيم النشاط المحدد المطلق، قم بإجراء الدقةأوس الأمثل لجميع ظروف التفاعل، بما في ذلك كيناز، الركيزة، وتركيزات أتب الباردة، من أجل ضمان نطاق خطي من النشاط على مدى دورة الزمن (على سبيل المثال 2 × [كيناز] = 2 × نشاط معين). ل كيناسيس مع نشاط معين عالية، إجراء المقايسات مع زيادة تركيز الركيزة في حالة النشاط كيناز محدودة بمقدار الركيزة.
  2. حساب النشاط المحدد للكيناز من الفائدة في وحدات من نانوموليز الفوسفات نقلها في الدقيقة لكل كيناز ملغ.
    1. اطرح الفراغات من التكلفة لكل ألف ظهور في النطاقات المحسوبة.
    2. احسب تسوس أتب الساخن: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 حيث t هو عدد الأيام منذ تاريخ المرجعية (يجب أن يوفرها البائع)، t 1/2 هو نصف عمر 32 P، وهو 14.3 يوما، و 0.95 يعكس كفاءة عداد التلألؤ. مثال: إذا كان استخدام أتب الساخن الذي هو 28 يوما من العمر، يجب أن تكون قيمة الاضمحلال 0.245.
    3. احسب(بمول) من مجموع أتب في الفحص (عادة هذا يساوي كمية أتب الباردة في رد الفعل): حجم الفحص (ميكرولتر) × [أتب الباردة] (ميكرومتر) = إجمالي أتب (بمولس). مثال: 30 ميكرولتر × 50 ميكرومتر = 1500 بمول
    4. حساب كيم / بمول أتب: [ميكرولتر من أتب الساخنة × (2.2 × 10 7 ) عامل تسوس] / بمول من أتب الباردة.
      ملاحظة: قيمة 2.2 × 10 7 تحويل 0.01 مسي / ميكرولتر من أتب إلى كيم.
    5. حساب كمية كيناز في الفحص في ملغ. لكل من كيناز المؤتلف و كيناسس إمونوبريسيبيتاتد، أساليب قياسية مثل المقايسات بكا هي مناسبة لتحديد تركيزات البداية. مثال: wtERK2 0.0002 ميكروغرام / ميكرولتر في رد فعل كيناز 50 ميكرولتر هو 0.01 ميكروغرام، أو 1 × 10 -5 ملغ.
    6. حساب إجمالي التكلفة لكل ألف ظهور في الفحص. تجميع 30 ميكرولتر ردود الفعل وتشغيل 20 ميكرولتر من كل رد فعل على هلام. ضرب عد في الدقيقة (بعد الطرح فارغة) من خلال عامل من إجمالي حجم الفحص / حجم تحميلها. الاستمرار في ما سبقعلى سبيل المثال، ضرب كل التهم بمقدار 1.5، أو 30/20.
    7. حساب النشاط المحدد من كيناز أكيد:
      مجموع كيم في مقايسة) / (كيم / بمول أتب) / (فحص الوقت بالدقائق) / (كمية كيناز في ملغ)
      ملاحظة: تقسيم القيمة أعلاه بنسبة 1،000 ينتج النشاط المحدد في نانوموليز / دقيقة / ملغ
  3. حساب عدد مولز الفوسفات تدرج في الركيزة (طالما وزنه الجزيئي هو معروف). ويستخدم هذا لتحديد عدد الفوسفوسايت على بروتين معين مرة واحدة وقد ذهب رد الفعل إلى الانتهاء.
    إجمالي قيمة النقرة في الفحص) / (كيم / بمول أتب)] / (كمية الركيزة في بمولس)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WNK1 إب المقايسات كيناز

تم ترانزفكتد ميك الموسومة WNK1 إلى خلايا HEK293 و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة لمكافحة ميك 11 . و إيمونوبريسيبيتات عرض نشاط كيناز نحو الركيزة نموذج مب وكذلك نحو نفسها ( الشكل 1A ). ثم تم اختبار المسوخ WNK1 لنشاط كيناز نحو مب من نفس الطريقة، وهذه المرة توظيف يبني غست الموسومة ( الشكل 1B ). كشف تحليل سلوك كيناز متحولة نسبة إلى ويلديب مخلفات حاسمة لنشاط WNK1 الأمثل.

تعرضت خلايا HEK293 إلى فريق من العلاجات الدوائية والكيميائية الحيوية. باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد WNK1 الببتيد N- محطة، تم قياس إمونوبريسيبيتاتد الذاتية KNK1 كيناز النشاط باستخدام مب كما الركيزة. عامل نمو البشرة (إغف)، وهو نشط أكتاتأو من إشارة ERK1 / 2، نوكودازول، وهو دواء يستهدف ديناميات الانيبيب، أنيسوميسين، مثبط للترجمة حقيقية النواة، وحمض ليسوفوسفاتيديك (لبا)، ميتوجين قوي، كلها غير قادرة على الحصول على زيادة قوية في مب الفسفوريلات. في المقابل، وقد تبين أن كلوريد الصوديوم أن يكون منظم نشاط كيناز WNK1.

ERK2 المؤتلف المقايسات كيناز البروتين

الجرذ ERK2 تحمل N- محطة وقد أعرب 6His العلامة في الخلايا البكتيرية وألفة تنقيته مع راتنج النيكل 12 . تمت تنقية البروتين أيضا بواسطة اللوني التبادل الأيوني على عمود مونوق، حيث تم اختبار العديد من الكسور شطف لنشاط كيناز ( الشكل 2A ). لأن ERK2 يتطلب الفسفرة المزدوجة من قبل منظمة مجاهدي خلق للوصول إلى أقصى نشاط كيناز، ERK2 المنقى من البكتيريا في غياب ميك غير نشط إلى حد كبير. لذلك، من أجل اختبار الكسور من ريكومبينانت ERK2 للنشاط نحو مب، تم تضمين شكل نشط بشكل أساسي من MEK1 دعا MEK1R4F في تفاعلات كيناز. الجدير بالذكر، MEKR4F لا يأوي نشاط كيناز عالية على مب ( الشكل 2 ).

باستخدام مقايسة مماثلة لتلك المبينة في الشكل 2A ، تم استخدام نشاط كيناز مب لقياس النشاط من المسوخ ERK2 المؤتلف المنقى من الثقافات البكتيرية نسبة إلى بروتين ويلديب ( الشكل 2B ). على الرغم من أن ERK2 قادر على الفسفوريلات مب عندما حفز من قبل MEKR4F، طفرة إما يسين الحفاز (K52R) أو داني ثريونين إلى المواقع الكنسي من الفسفرة المزدوجة (T188D و T188E) يلغي بشكل كبير نشاط كيناز ERK2. ERK2-T188D و ERK2-T188E عرض النشاط كيناز هامشي نحو الببتيد صغير ومرن ( الشكل 2C )، ومع ذلك، فإنها غير قادرة على فوسفهوريلات بقوة ركائز ERK2 المعروفة Nup153 و PDX1 ( الشكل 2 D).

شكل 1
الشكل 1: المقايسات كيناز مناعية من WNK1. ( A ) تم ترانزفكتد خلايا HEK293 مع إما PCMV5-ميك دون إدراج أو PCMV5-ميك-WNK1، وكانت إمونوبريسيبيتاتد البروتينات الموسومة مع الأجسام المضادة لمكافحة ميك تليها مقايسات كيناز باستخدام مب كما الركيزة. يظهر التصوير الإشعاعي الذاتي على اليسار، و إمونوبلوت من إمونوبريسيبيتاتس على اليمين. ( ب ) استخدمت غست-WNK1 البروتينات متحولة مختلفة في فحوصات كيناز مع مب كما الركيزة. يتم التعبير عن الفسفرة مب كنشاط نسبة إلى ويلديب WNK1. ( C ) كان WNK1 الذاتية إمونوبريسيبيتاتد من خلايا HEK293 تعامل مع مختلف المحفزات و أسايد ل أوتوفوسفهوريلاتيون. تم تعديل هذا الرقم من شو وآخرون. ، 2000 11 .5504fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: المؤتلف مقايسات كيناز البروتين من ERK2. ( A ) تم استخدام الكسور ERK2 المنقى من عمود تبادل أنيون مونوق في مقايسة كيناز مع مب في وجود أو غياب MEK1R4F، مشجعا نشطا نشيطا من النشاط ERK2 كيناز. ( B ) تم اختبار المسوخ ERK2 لنشاط كيناز على مب. ( C ) تنشيط المسوخ حلقة ERK2-T188D و ERK2-T188E عرض النشاط كيناز هامشية نحو الركيزة الببتيد وصفتها صغيرة. ( D ) مقارنة أنشطة ERK2 أو T188D كيناز بعد تفعيل بواسطة MEK1R4F مع ركائز ERK2 المعروفة نوكليوبورين 153 (Nup153) والبنكرياس والاثني عشركس الاثني عشر 1 (PDX1). وترمز ركائز فسفوريلات بواسطة أسافين وفوسفوريلاتيد ERK2 و T188 بواسطة النجمة. أعيد طباعته (وتعديله) بإذن من مكرينولدز إت آل. ، 2016 12 (حقوق الطبع والنشر 2016 الجمعية الكيميائية الأمريكية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كيناسس هي عائلة متنوعة من البروتينات التي تطورت وظائف واسعة في سياقات عديدة، وكانت مقايسات كيناز مفيدة بشكل لا يصدق في دراسة عدة بروتينات التشوير وساهمت بشكل كبير في فهمنا الحالي للاتصالات الخلوية. ومن الجدير بالذكر أن نفس المقايسة الأساسية استخدمت في تمييز كينازين متباينين ​​على الرغم من الاختلافات الرئيسية في الهيكل والنشاط. يحتوي كيناز WNK1 على جيب حفاز غير نمطي حيث تحولت ليسين الحرجة إلى موقف فريد ومن المعروف أن تلعب الأدوار في تنظيم كوتراتيون كلوريد كوترانسبورترز من خلال كل من وظائف كيناز والسقالات. ومن المعروف أن نشاط كيناز من WNK1 أن يكون عدد دوران منخفضة، حتى على أفضل ركائز يتميز، البروتين كينازس الاكسدة استجابة 1 (OSR1) و سبس / STE20 ذات الصلة البرين ألينين الغنية (سباك). في المقابل، ERK2، جنبا إلى جنب مع كيناز يرتبط ارتباطا وثيقا ERK1، يعرض نشاط كيناز قوية عند تفعيلها 13 ، 14 .

الجانب الأكثر أهمية للمقايسة هو تجميع التفاعل. من أجل إجراء قياسات دقيقة نقطة زمنية، يجب إيلاء عناية خاصة لتهيئة تفاعلات كيناز. هناك أربعة متطلبات أساسية لمقايسة كيناز المضي قدما: كيناز، الركيزة، أتب، وأيون المعادن. لهذا البروتوكول، والذي يستخدم في المقام الأول لالكينازات حقيقية النواة، يستخدم مغكل 2 كمصدر للمغنيسيوم. كل من البروتين المؤتلف كيناز و إب كيناز الاستعدادات عادة تحتوي على المغنيسيوم، مما يجعل مغكل 2 غير كافية باعتبارها بداية رد الفعل. وبالمثل، يمكن إضافة أتب غير المسماة ("الباردة") أتب قبل إضافة المسمى ("الساخنة") أتب رد فعل غير مناسب في وقت مبكر. نوصي إعداد ردود الفعل باستخدام مركزا رد فعل كيناز التفاعل الذي يسهل إضافة في وقت واحد من مغكل

على الرغم من أن هناك بعض التمييز بين المقايسات كيناز إب والفيروسات كيناز المؤتلف المؤتلف، رانه نموذج تجريبي مشترك لكلا يوضح كيف تنوعا هذا الاختبار يمكن أن يكون. في الواقع، هناك حالات عندما يتم مزج سمات كل من أنواع مقايسة كيناز، كما هو الحال مع الدراسات على مسار كيناز كيناز / خارج الخلية ينشط إشارة إشارة (مافك / إرك) تنشيط الميتوجين. في هذا المسار، يتم تنشيط ERK1 / 2 عن طريق ثنائي فسفرة من قبل عامل المنبع مابك / إرك كيناز 1 (MEK1). وقد أظهرت الدراسات السابقة أنه في حين أن MEK1، فضلا عن متحولة نشطة بشكل أساسي يسمى MEK1R4F، قادرة على تفعيل ERK1 / 2، فإنه يؤوي نشاط منخفض جدا نحو مب. ونتيجة لذلك، ERK1 / 2 المنقى من الخلايا البكتيرية عرض نشاط كيناز محدود نحو مب ما لم تعامل مع MEK1R4F، وخلق منصة قوية لمقارنة النشاط كيناز من ويلديب ERK1 / 2 لبنيات متحولة، كما هو مبين في الشكل 2 . إدراج مكونات إمونوبريسيبيتاتد يمكن أن تضيف المزيد من الفروق الدقيقة، وتسليط الضوء على فحص كيناز كطريقة للتكيف للغاية للتحقيق في ن متعدد الأوجهمن هذه الجزيئات إشارة هامة.

في حين أن البعض قد تجد العمل مع المواد المشعة مرهقة، وقابلية التتبع الكمي لفحص كيناز راديولبلد هي واحدة من مزاياه الرئيسية.ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة في مجالات الكيمياء المنتج الطبيعي، علم الجينوم، ومطياف الكتلة خلق الطلب على المقايسات كيناز المعدلة مع قراءات أكثر قابلية للتطبيقات الإنتاجية العالية 15 . لأن هذه المقايسات الاستفادة من مواد وسم مختلفة، يتم تقديم تنازلات من حيث الدقة، ولكن هذه يمكن التغلب عليها باستخدام فحص راديولبلد للتحقق من صحة النتائج الشاشة. كما فهمنا للإشارات البروتين كيناز الزيادات، فإنه لا يزال واضحا أن التقنيات قادرة على ندف من تفاصيل وظائف التنظيمية كيناز سوف تستمر في المساعدة في تطوير الأدوات والعلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير للمساعدة الإدارية. وقد دعمت هذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R37 DK34128 و مؤسسة ولش منحة I1243 إلى مهك

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366, (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16, (16), 7788-7794 (2008).
  6. Cold Spring Harbor Protocols. Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
  7. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121, (51), 12215 (1999).
  8. Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
  9. Autoradiography. Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
  10. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. 3 edn, Humana Press. (2009).
  11. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275, (22), 16795-16801 (2000).
  12. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55, (12), 1909-1917 (2016).
  13. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4, (196), rs11 (2011).
  14. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  15. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18, (8), 444-455 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics