A Rat Tibial Growth Plate Injury Model til at karakterisere reparationsmekanismer og evaluere vækstpladens regenereringsstrategier

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vækstpladen er en bruskhinde i børns lange knogler, hvor langsgående vækst forekommer. Når det er skadet, kan knoglevæv danne og forringe væksten. Vi beskriver en rottemodel af vækstpladeskader, der fører til knoglet reparationsvæv, hvilket gør det muligt at studere reparationsmekanismer og vækstpladens regenereringsstrategier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En tredjedel af alle pædiatriske frakturer involverer vækstpladen og kan resultere i nedsat knoglevækst. Vækstpladen (eller physis) er bruskvæv fundet ved enden af ​​alle lange knogler hos børn, som er ansvarlig for langsgående knoglevækst. Når det er beskadiget, kan bruskvæv inden for vækstpladen undergå for tidlig henvendelse og føre til uønsket benagtigt reparationsvæv, som danner en "bony bar". I nogle tilfælde kan denne knoglebjælke resultere i knoglevækst deformiteter, såsom vinkeldeformiteter, eller det kan helt stoppe langsgående knoglevæksten. Der er i øjeblikket ingen klinisk behandling, som fuldt ud kan reparere en skadet vækstplade. Ved hjælp af en dyremodel af vækstpladeskade for bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for bonybardannelse og at identificere måder at hæmme på, er det en god mulighed for at udvikle bedre behandlinger for vækstpladeskader. Denne protokol beskriver, hvordan man forstyrrer den rotte proximale tibial vækstplade ved hjælp af en borehulsdefekt. Denne smaLl dyremodel producerer pålideligt en benstang og kan resultere i vækstdeformiteter svarende til dem, der ses hos børn. Denne model giver mulighed for undersøgelse af de molekylære mekanismer for knoglestangdannelse og tjener som et middel til at teste potentielle behandlingsmuligheder for vækstpladeskader.

Introduction

Vækstpladeskader udgør 30% af alle pædiatriske frakturer og kan resultere i nedsat knoglevækst 1 . Ud over brud kan vækstpladeskader være forårsaget af andre ætiologier, herunder osteomyelitis 2 , primære knogletumorer 3 , stråling og kemoterapi 4 og iatrogene skader 5 . Vækstpladen (eller physis) er en bruskregion i slutningen af ​​børns lange knogler, som er ansvarlig for langsgående knoglevækst. Det kører knogleforlængelse gennem endokondralbenifikation Chondrocytter gennemgår proliferation og hypertrofi og omdannes derefter ved indkommende osteoblaster til dannelse af trabekulær knogle 6 . Vækstpladen er også et svagt område af det udviklende skelet, hvilket gør det udsat for skade. Den største bekymring med væksten plade frakturer eller skader er, at det beskadigede bruskvæv inden for vækstpladen kan bE erstattet med uønsket benagtigt reparationsvæv, også kendt som en "bony bar". Afhængig af dens størrelse og placering inden for vækstpladen kan den bony bar føre til vinkeldeformiteter eller komplet vækststop, en ødelæggende sequela for små børn, der endnu ikke har nået deres fulde højde 7 .

Der er i øjeblikket ingen behandling, der fuldt ud kan reparere en skadet vækstplade. Når knoglerne er dannet, skal klinikeren afgøre, om den skal fjernes kirurgisk eller ej. Patienter med mindst 2 år eller 2 cm tilbageværende skeletvækst og med en benstang, der spænder mindre end 50% af vækstpladsområdet, er sædvanligvis kandidater til bony bar resection 8 . Kirurgisk fjernelse af benbenet efterfølges ofte af interpolering af et autologt fedttransplantat for at forhindre reformering af det knoglede væv og at tillade den omgivende ujordede vækstplade at genoprette væksten. Imidlertid er disse teknikker problEmatisk og ofte fejler, hvilket fører til tilbagevenden af ​​knogler og fortsat negativ effekt på vækst 9 . Der er et kritisk behov for at udvikle effektive behandlinger, som ikke kun forhindrer knoglespringdannelse, men også regenererer vækstbruskebroen og genopretter normal knogleforlængelse.

De molekylære mekanismer, der ligger til grund for bonybardannelse, er endnu ikke fuldt ud belyst. En større forståelse af disse biologiske mekanismer kan føre til mere effektive terapeutiske indgreb for børn, der lider af vækstpladeskader. Da det er svært at studere disse mekanismer hos mennesker, er dyremodeller blevet anvendt, især rottemodellen for vækstpladeskader 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Metoden præsenteret i dettePapir beskriver, hvordan en borehulsdefekt i rotte-tibial vækstpladen fører til forudsigeligt og reproducerbart reparationsvæv, der begynder at blive vendt så tidligt som 7 dage efter skaden og danner en fuldt moden knoglestang med remodeling 28 dage efter skade 10 . Dette tilvejebringer et lille dyr in vivo model, hvor man studerer de biologiske mekanismer for knoglebjælkens dannelse såvel som at evaluere nye terapier, der kunne forhindre knoglebjælken og / eller regenerere vækstpladskrækken. For eksempel kan denne model bruges til at teste chondrogene biomaterialer, som kan regenerere vækstpladskræbel og tilbyde værdifuld behandling for børn, der lider af vækstpladeskader. De teknikker, der præsenteres i dette papir, beskriver de kirurgiske metoder, der anvendes til at producere vækstpladeskade og den efterfølgende levering af biomaterialer til skadestedet. Vi vil også diskutere metoder til vurdering af knoglet bar formation og reparation væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprocedurer skal godkendes af det lokale institut for dyrepleje og brug (IACUC). Dyreprotokollen til den følgende procedure blev godkendt af University of Colorado Denver IACUC.

1. få rotter

BEMÆRK: Medmindre genetisk modificerede dyr er ønsket, er 6 uger gamle, skeletmæssigt umodne Sprague-Dawley rotter påkrævet på operationstidspunktet. Andre stammer kunne potentielt anvendes; De fleste offentliggjorte undersøgelser er imidlertid blevet udført på Sprague-Dawley-rotter.

2. Forberedelse af kirurgiske forsyninger

  1. Autoklave kirurgiske forsyningspakker, der indeholder en af ​​følgende: # 3 skalpels håndtag, nåleholder, Adson tang og iris saks.
  2. Autoklaver de nøglefri borekroner. Drill chucks kan være perle steriliseret mellem dyr operationer, når de opererer på flere dyr.
    BEMÆRK: Lokale IACUC-regler vedrørende brugen af ​​steril surgIcal værktøjer på flere dyr skal overholdes. For eksempel gør det muligt for University of Colorado Denver IACUC at et kirurgisk værktøjssæt anvendes til op til 5 dyr, før de seponeres. Desuden skal kirurgiske værktøjer være varmsteriliseret ved anvendelse af en perlesterilisator mellem dyr. Yderligere sterile kirurgiske pakninger skal anvendes til yderligere dyr.
  3. Autoklave 5 cm Steinmann pins, en til hvert dyr.
    BEMÆRK: For at mindske risikoen for infektion må Steinmann-stifterne ikke bruges til flere dyr.
  4. Autoklave 1,8 mm dental burs, en for hvert dyr.
    BEMÆRK: For at mindske risikoen for infektion må tandbørsterne ikke bruges til flere dyr.
  5. Autoklaver en sårklipsapplikator, hvis det er relevant. Alternativt kan begravet suturer anvendes til at lukke det kutane lag. Se trin 7.3.
  6. Hvis det er muligt, steriliser en roterende borer ved hjælp af bestråling eller gassterilisering.
  7. Saml følgende ekstra forsyninger: elektriske barbermaskiner, steRile 3-0 polyglycolsyre suturer, steril gaze, povidon-jod, steril saltvand, sterile 10 ml sprøjter, sterile 23 gauge nåle, isopropylalkohol swabs, isofluran, kalipre, postkirurgiske analgetika ( fx NSAID'er og buprenorphin), Sterile kirurgiske gardiner, sterile kirurgiske handsker, sterile # 15 skalpeblade, sterile sårklemmer, anæstesiemaskine, perlesterilisator, opvarmningspude og absorberende underlag.

3. Anæstesi og fremstilling af dyr

  1. Bedøves dyret ved at introducere det til et 1- til 2-L induktionskammer, der modtager 1 l / min oxygenstrøm med 5% isofluran fra et fordampningssystem med et passivt opfangningssystem.
    BEMÆRK: Eksponering for 5% isofluran bør bedøve 6 uger gamle rotter inden for 5 minutter.
  2. Flyt dyret til det kirurgiske sted og oprethold dyret under anæstesi med 2 - 3% isofluran ved hjælp af en næse kegle for resten af ​​proceduren. Placer dyret liggende på en varmepude og en absorberEnt underpad.
    BEMÆRK: Dyret behøver ikke at blive fastgjort til kirurgisk bord. At holde benet som angivet i trinene nedenfor er en tilstrækkelig stabiliseringsmetode.
    BEMÆRK: Alle efterfølgende procedurer skal udføres med dyret under anæstesi. 2 - 3% isofluran bør være tilstrækkeligt til at opretholde anæstesi hos rotter i denne alder. Dette kan bekræftes ved at teste den bipedale tilbagetrækningsrefleks.
  3. Administrer intraoperative analgetika i overensstemmelse med institutionelt godkendte politikker ( fx buprenorphin ved 0,05 mg / kg og carprofen ved 5 mg / kg).

4. Fremstilling af Tibia til kirurgi

  1. Barber hele bagbenet / benene fra medial malleolus til bækkenet med en elektrisk barbermaskin.
  2. Mål og optag tibiallængden fra det fremre tibialplateau til den underliggende side af medial malleolus ved hjælp af kaliper. Alternativt måles hele tibialængden ved hjælp af røntgen eller microCT 11 Sup> , 12 , 14 . Eventuelt måler vækstpladens mål før kirurgi ved hjælp af røntgen eller microCT.
  3. Rengør det kirurgiske sted ved at tørre hele benet / benene, underlivet og kønsorganer med alkoholpindene og derefter med povidon-jod-gennemblødt gasbind.
    BEMÆRK: For at minimere risikoen for infektion skal alle efterfølgende procedurer, indtil dyret fjernes fra anæstesi (trin 7.4), foretages under sterile forhold. Alle de kirurgiske materialer skal tilgås ved hjælp af steril teknik. Brugen af ​​en kirurgisk assistent anbefales stærkt til at opretholde sterilitet gennem kirurgi.
  4. Bær sterile kirurgiske handsker, læg en fængslet steril kirurgisk drapering over dyret, og lad benene blive udsat gennem den centrale fænestration.

5. Kirurgisk procedure for at få adgang til vækstpladen

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversigt over den kirurgiske procedure.
A)
Placering af flere anatomiske markører anvendt til at skabe en vellykket vækstpladeskade. Knækapslen er straks bagved knæskallen (hvid) og adskiller tibia fra lårbenet. Tibialvækstpladen (mørk rød) kan ses dårligere end knæskallen og omgå tibia. Den proksimale vækstplade er et stort set fladt plan, undtagen for det forreste kvarter, der danner et diagonalt plan. Krydsningen af ​​disse to planer danner vækstpladens vinkel, som anvendes til passende borevinkulation. Semitendinosus-indsættelsen er, hvor quadriceps muskler indsætter i den bageste tibia. B) Indsnit gennem det anterior-mediale aspekt af det tibiale bløde væv for at få adgang til den kortikale knogle. C) Placering af det kortikale vindue ved hjælp af justering med den distale semitendinosus insertion som referencepunkt. D) EvalueringDybden af ​​skaden ved at justere skråningen på tandkassen med det kortikale vindue.

  1. Lav en ~ 1 cm snit gennem huden langs medial-forreste side af den proximale tibia ved hjælp af et # 3 skalpelshåndtag og et # 15 blad, der starter ved den distale ende af den mediale femoral kondylen ( Figur 1A ).
    1. Træk huden tæt på den underliggende knogle og hold benet fast, mens du tager snit.
      BEMÆRK: Dette vil holde huden indsnit på det ønskede sted og vil hjælpe med at skabe et rent snit. Tryk ikke for hårdt på skalpinden for at undgå at punktere knækapslen, hvilket vil resultere i massiv blødning og vil gøre de resterende trin vanskelige.
  2. Vær opmærksom på vigtige anatomiske markører, herunder: 1) vækstpladen, 2) vækstpladens vinkel, 3) knækapslen og 4) semitendinosusindsatsen ( figur 1A ).
  3. Ved hjælp af skalpel skal du lave en 0,5 cm snit gennem thE-fascia og blødt væv på det mediale-forreste aspekt af den proximale tibia, fra vækstpladen til bunden af ​​hudindsnittet ( figur 1B ).
  4. Dissolutér eller skraber forsigtigt fascia og blødt væv fra tibia med scalpel ( figur 1B ).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne eller skrabe så meget blødt væv fra tibia som muligt for ikke at forstyrre boretrin.
  5. Bør et kortikalt vindue gennem den tibiale kortikale knogle ved diaphysen med en Steinmann-stift fastgjort til et roterende værktøj ved 10.000 omdrejninger pr. Minut (lav hastighed på det roterende værktøj, der er angivet i materialesektionen). Opret det kortikale vindue sådan, at det justerer sig med den distale semitendinosus insertion ( figur 1C ).
    1. Hold boret vinkelret på tibial diaphysis og bor langsomt og pas på ikke at bore gennem den anden side af diaphysisen; Det kortikale vindue skal kun være ~ 2 mm dybtgående og vil blive lavet, når nejModstand er følt.
    2. Som ovenfor, hold benet fast med den anden hånd.
      BEMÆRK: En tandbur kan bruges til dette trin. Men hvis en tandbur er brugt, skal benet holdes meget fast for at lave et rent kortikalt vindue og for at sikre, at buret griber og skærer benet på det ønskede sted. En Steinmann-pin anbefales til dette trin, da den har en langt bedre skæreevne.
  6. Dab det kortikale vindue med gasbind, da det forventes let blødning.

6. Oprettelse af Vækstplade Skaden

  1. Skab en boreskadesskade gennem den centrale vækstplade ved hjælp af en 1,8 mm tandkasse, der er fastgjort til et roterende værktøj.
    BEMÆRK: Korrekt dybde, vinkel og retning er afgørende for at forstyrre den centrale vækstplade ( Figur 1C og D ). Instruktioner til opnåelse af passende dybde, vinkel og retning er angivet nedenfor.
    1. For at måle den passende dybde ved hjælp af tandkassen, startN ved at tilpasse enden af ​​tandkassen med den proximale tibia, hvor semitendinosus krydser knækapslen ( figur 1C ).
    2. Med slutningen af ​​tandkassen på knækapslen skal du følge burstakslen langs semitendinosus og notere, hvor buret passer med det kortikale vindue. Dette er den rette dybde for, at buret fuldt ud kan forstyrre vækstpladen uden at forstyrre ledfladen ( figur 1C ).
      BEMÆRK: Tandkassen bruges til at måle den passende dybde. Buren kan være mærket med en permanent markør på det sted, hvor den justeres med det kortikale vindue for at henvise til dybden under boringen. Men hvis de anatomiske markører og ovennævnte protokol er nøje henvist, vil den første skråning på de dentalburser, der er angivet her (FG6), justeres hensigtsmæssigt med det kortikale vindue (som det ses i figur 1C ).
    3. For at opnå den rette borevinkel skal du holde det roterende værktøj i en vinkel på mindre tHan 30 ° med hensyn til tibial diaphysis.
      BEMÆRK: Dette er en visuel tilnærmelse.
    4. For at opnå den rette boreretning skal du målrette mod vækstpladens vinkel ( figur 1C ). Tegn en vis linje langs tandkassen til vækstpladens vinkel for at hjælpe med at skabe en central defekt.
    5. Tænd rotationsværktøjet til 10.000 omdrejninger (lav hastighed på det roterende værktøj, der er angivet i materialesektionen), inden du går ind i det kortikale vindue.
    6. Med det roterende værktøj i en passende vinkel og retning, skal du indtaste det kortikale vindue og skubbe rotationsværktøjet, indtil burmarkøren er i overensstemmelse med det kortikale vindue. Når den rigtige dybde er nået, skal du fjerne det roterende værktøj.
      BEMÆRK: Udfør vekstpladeafbrydelsen i en hurtig bevægelse ved at bruge minimal tid med buret i vækstpladen for at skabe en ren skade. Dette er vigtigt for dataanalyse.
  2. Dab det kortikale vindue med gasbind i ~ 30 s, da blødning forventes.
  3. Sørg for den passende dybde af skaden ved igen at måle burlængden (trin 6.1.2).
    1. Indsæt buret i boresporet (med rotationsværktøjet slukket) og juster den markerede bur med det kortikale vindue ( Figur 1D ).
  4. Hvis dybden er utilstrækkelig, skal du dreje rotationsværktøjet og skubbe til den ønskede dybde.
    BEMÆRK: Selv om en anden runde af boring ikke er ideel, er det helt afgørende for udviklingen af ​​benbjælken at forstyrre vækstpladen helt.
  5. Skyl boresporet med ~ 3 ml steril saltvand med en 10 ml sprøjte og en 23 gauge nål.
  6. Tør såret med gasbind.

7. Skadesprocedurer

  1. Hvis du vurderer en biomaterialebaseret vækstpladebehandling, skal du injicere biomaterialet gennem boresporet til skadestedet ved hjælp af en nål med passende størrelse (18 til 26 gauge afhængigt af biomaterialeviskositeten).
    BEMÆRK: Volumenet af vækstpladeskaden er ~ 3 & #181; L, og boresporets volumen er ~ 20 μl. Den maksimale mængde materiale, der kan injiceres i vækstpladeskader og borespor, er mellem 20 og 25 μl.
  2. Luk såret ved at suture fascia med 3-0 polyglycolsyre suturer. Påfør knogle voks over det kortikale vindue for at isolere den underliggende knogle (valgfri).
  3. Luk hudens snit med begravet suturer eller sårklip.
    BEMÆRK: Sårklip anbefales, da dyret vil ridse på skadestedet og åbne såret.
  4. Fjern dyret fra isofluranbedøvelse, læg det på et opvarmningstæppe og overvåg det, indtil det er vågen.
  5. For at mindske risikoen for infektion, sæt dyret i et nyt bur indeholdende tørt, autoklaveret sengetøj.
  6. Lad dyret bære vægt postoperativt.
  7. Overvåg dyret hver 12. time i 72 timer efter operation for at kontrollere tegn på infektion, for at sikre, at sårklip forbliver på plads og at administrere postoperativE-analgetika i overensstemmelse med institutionelt godkendte politikker ( fx buprenorphin ved 0,05 mg / kg hver 12. time i 36 timer og carprofen ved 5 mg / kg hver 24. time i 72 timer).
  8. Fjern sårklip 10 - 14 dage efter operationen under anæstesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesfuld vækstpladeskade ved anvendelse af denne metode indebærer forstyrrelsen af ​​midten af ​​tibialvækstpladen uden at forstyrre ledbruskoverfladen. Bony reparationsvæv er blevet rapporteret at begynde på ca. 7 dage efter skaden og bliver fuldt udviklet af 28 dage efter skaden 13 , som visualiseret ved mikro-computertomografi (mikro CT) ( figur 2 ). Selv om disse tidspunkter blev valgt her for at vise begyndelsen og modningen af ​​knogledannelse baseret på tidligere offentliggjorte data, kan andre tidspunkter bruges til at undersøge de forskellige trin i reparationsprocessen fra dag 1 til 6 måneder efter operationen 17 . Tabel 1 giver et overblik over dannelse af knoglevolumen inden for kirurgisk skadede rottevækstplader 28 dage efter kirurgi fra tre uafhængige kørsler ved at tilvejebringe (1) knoglevolumenfraktionen inden for hele vækstpladen og (2) boenNe volumenfraktion i reparationsvævsområdet kun 15 . Dataene rapporteres som den gennemsnitlige procent ± standardafvigelsen og indikerer, at lignende resultater blev opnået mellem de uafhængige kørsler. Variansen mellem de forskellige kørsler blev analyseret ved en envejsanalyse af varians (ANOVA) og viser ingen statistisk signifikant forskel mellem kørslen, hvilket tyder på reproducerbarheden af ​​modellen. Alcian blå hæmatoxylin (ABH) med Orange G / Eosin counterstain 18 blev brugt til histologisk at vise en række reparationsvæv i forskellige stadier af knoglestangdannelse ( figur 2 ). Ved anvendelse af denne histologiske plet kan forskellige typer reparationsvæv, herunder mesenkymal, brusk, knoglet trabekula og knoglemarv identificeres og kvantificeres 16 .

Adskillige problemer kan opstå som følge af ovennævnte procedurer. En insufficie Nt bore dybde vil ikke forstyrre vækstpladen, hvilket vil resultere i ringe eller ingen knoglestangsdannelse. Afbrydelse af ledbruskoverfladen skaber en større skade, der kan introducere leddbrusk ind i vækstpladeskaderstedet, hvilket komplicerer helingsprocessen ( figur 3A ). Afbrydelse af vækstpladen i uhensigtsmæssig vinkel eller retning resulterer i en ikke-central skade ( figur 3B ). I dette tilfælde vil bony bar formation stadig forekomme, selvom det vil være lateralt eller medialt til det ønskede sted. Samlet set kan reparationsvæv dannet efter vækstpladeskader analyseres på forskellige måder, herunder mikroCT, kvantitativ PCR, histologisk farvning og immunhistokemi. Ud over histologiske og molekylære målinger giver lemlængde og vækstplademålinger et vigtigt mål for hel knoglevækst. Berørte lemmer er blevet rapporteret at opleve vækstreduktion i forhold til ubeskadigede kontrollemmer> 13. Limlængden kan måles på forskellige tidspunkter i løbet af studiet ved hjælp af microCT-billeder til undersøgelse af forskelle i lemlængde 14 . Eksempler på tidspunkter, der tidligere blev brugt, omfatter 28 dage og 56 dage efter skaden. Vækstplade målinger, herunder samlet højde, zonal højder og tether formation, kan også give vigtige oplysninger om vævsreparationsprocessen 13 , 14 , 15 . Ideelt set bør man tage lem længder og vækstplade målinger før operationen har en baseline værdi. For yderligere at belyse biologiske mekanismer eller for at teste effektiviteten af ​​en behandling, skal passende kontrolgrupper udformes og omfatte upåvirkede lemmer og lemmer, der blev gennemgået operation, men som ikke behandles.

Biomaterialer kan også testes i denne vækstpladeskadesmodel. Som et eksempel, en chiTosan-mikrogel 19 blev injiceret i vækstpladeskadesiden, som beskrevet i trin 7.1, og det ses tydeligt på skadestedet i figur 4 . Efterfølgende analyse kan indebære bestemmelse af virkningerne af biomaterialet på reparationsvævssammensætning, lem længde og vækstplademålinger som diskuteret tidligere.

Figur 2
Figur 2. Succesfuld vækstpladeafbrydelse og bony barformation.
Bony bar formation ses 7 dage efter skader med microCT og bekræftet ved Alcian Blue Hematoxylin (ABH) farvning. Den benede bar er fuldt moden efter dag 28 efter skader som set med mikroCT og ABH farvning. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 3. Potentielle resultater af ukorrekt boring.
A) At
bore for langt gennem tibia kan forstyrre ledfladen, hvilket komplicerer helingsprocessen og kan føre til ufuldstændige resultater. B) Forkert vinkling af boret kan føre til en ikke-central vækstpladeskade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4. Behandling af et vækstpladeskader med et biomateriale.
ABH-farvning viser chitosanmikrogelen i den skadede vækstplade.

metric Kør 1 Kør 2 Kør 3 P-værdi
Bone volumen fraktion inden for hele vækstpladen 9,76 +/- 3,81% 10,52 +/- 4,06% 11,93 +/- 2,04% 0,5493
Bone volumen fraktion inden for reparationsvævsområdet 41,5 +/- 8,33% 46,08 +/- 10,12% 46,77 +/- 8,14% 0,5128

Tabel 1. Bone Volume Fraction Data.
Data var fra mikro CT-billeder ved 28 dage efter skader på ubehandlede rotter fra tre uafhængige kørsler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En dyrkningsmodel med vækstpladeskader bidrager meget til vores forståelse af de biologiske mekanismer i denne skade, hvilket potentielt fører til mere effektive terapeutiske interventioner til børn, der lider af skader på vækstpladerne. For at kunne oprette en knoglestang og studere dens dannelse in vivo ved hjælp af modellen fremlagt i dette værk er det kritisk at forstyrre vækstpladen ved at bore til en tilstrækkelig dybde uden at forstyrre leddbrusk. Variation i kirurgisk implementering blandt dyr og i mindre grad variation i anatomiske markører kan føre til problematiske resultater. Vi anbefaler at praktisere de ovenfor beskrevne procedurer på kadaveriske dyr for at sikre en vellykket vækstpladeskade, før du udfører proceduren for levende dyrestudier. Mens kadaveriske dyr mangler vævspålidelighed og ikke vil bløde, vil vækstpladeskaderproceduren og anatomiske egenskaber på disse dyr ligner dem hos levende dyr. FurtHermore, den cadaveric tibial vækstpladen kan let dissekeres, da epifysen adskiller sig fra metafysen ved anvendelse af lyskraft, og boringens placering kan observeres. Denne hurtige analyse muliggør teknologiske modifikationer for at lære den rette boredybde og vinkling på kadaveriske dyr uden behov for billeddannelse.

Det skal bemærkes, at der findes andre dyremodeller af vækstpladeskader. En lignende transfyse-defekt er blevet udført i musen og ført til knoglet bardannelse 20 . På trods af sin mindre størrelse kan den også bruges til at studere de mekanismer, der er involveret i knoglestangdannelse. Coleman et al . Rapporteret om en anden gyldig rotte-model af vækstpladeskader, hvor en central transfysefejl blev skabt i den distale lårben ved at bore gennem leddbrusk 21 . Denne fremgangsmåde førte også til dannelsen af ​​en bony bar og lammelængde uligheder, som iModel præsenteret her. Andre dyremodeller af vækstpladeskade og behandling har indbefattet kaniner 22 , svin 23 og får 24 . Mens større dyrebeskadigelsesmodeller kan repræsentere mere klinisk kvæstelser, er rottemodellen nyttig til forskning i de biologiske mekanismer for fyseskader. For eksempel er rottemodellen, der præsenteres her, blevet anvendt i vid udstrækning for at undersøge molekylære mekanismer af fysealskader og knoglestangdannelsesprocessen 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Desuden kan rottemodellen bruges til at teste forskellige fysebehandlinger, før de flyttes til større dyremodeller. En udfordring ved denne rotte-model af vækstpladskader er imidlertid, at boringen er færdig inden i benet, maKonge det umuligt at observere, hvor borebrøndet er placeret inden for vækstpladen. Således kan vellykket forstyrrelse af vækstpladen på levende dyr kun bekræftes ved anvendelse af billedbehandlingsteknikker på tidspunktet for operationen eller ved vurdering af knogletablering mellem 7 til 28 dage efter operationen. Med praksis kan en høj grad af succes med opnåelse af knoglestangdannelse opnås, men tidlige undersøgelser kan resultere i et antal dyr, der mangler dannelse af en knoglestang, enten på grund af en ubeskadiget vækstplade eller utilstrækkelig forstyrrelse af væksten plade.

En anden begrænsning af denne model er, at borehulsskader ikke repræsenterer normale vækstpladskader hos børn, som normalt opstår på grund af brud 25 . Frakturer inden for vækstpladen kan klassificeres ved anvendelse af Salter-Harris klassifikationssystemet 26 . Type III og type IV vækstpladebrakturer bidrager sædvanligvis til de fytiske skader, der førerTil knoglet bar formation. Vækstpladebeskadigelsestypen, der her fremgår mest, vedrører en type VI-vækstpladeskade, en sjælden klasse af skade, hvor physis fjernes ved et traume eller punkteringssår. Da de patofysiologiske mekanismer, der ligger til grund for bonybjælkens dannelse, efter vækstpladskader forbliver uvæsentlige, er rottemodellen imidlertid fortsat vigtig for at afdække denne proces for at udvikle nye behandlingsmuligheder for børn, der lider af alle former for vækstpladeskader. Den her beskrevne metode skaber pålideligt en knoglestang og kan anvendes til at studere flere aspekter af vækstpladeskaderreparationsprocessen in vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . Det har også vist sig, at denne rotte model resulterer i reduceret tibial vækst efter vækstpladen iJury 13 , hvilket gør det til en endnu mere interessant dyremodel til at teste nye behandlingsmuligheder, der fører til regenerering af vækstplader og den potentielle genopretning af knogleforlængelse.

Afslutningsvis beskriver dette papir metoderne til at skabe en vækstpladeskadesmodel, hvormed man undersøger knoglespring og potentielle behandlinger for vækstpladeskader in vivo. Denne rotte model muliggør relativt billige og hurtige undersøgelser, da en knoglestang er fuldt moden 28 dage efter vækstpladeskade. Ud over at udvikle vores forståelse af de molekylære mekanismer for knoglebjælkedannelse in vivo , kan denne model bruges til at teste biomaterialer, der hæmmer knoglebjælkdannelse og tilskynde til regenerering af vækstpladebrusk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Forfatterne anerkender finansieringsstøtte fra National Institute of Arthritis og Muskuloskeletale og Hudsygdomme hos National Institutes of Health (NIH) under prisnummer R03AR068087, Akademisk berigelsesfond ved University of Colorado School of Medicine og Gates Center for Regenerativ Medicin . Dette arbejde blev også støttet af NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Nummer UL1 TR001082. Indholdet er forfatterens eget ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis officielle NIH-synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics