En flerhulls kryoampulle Eliminerer Frysing Arti når muskelvev er direkte nedsenket i flytende nitrogen

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å fryse muskelvev ved å dyppe dem direkte inn i flytende nitrogen. Denne protokollen fremhever også en ny kryoampulle som kan unngå "teppe effekten" av nitrogengass når flytende nitrogen kommer i kontakt med vev overflaten av et prøvestykke.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Huang, Y., He, M., Zeng, Q., Li, L., Zhang, Z., Ma, J., Duan, Y. A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen. J. Vis. Exp. (122), e55616, doi:10.3791/55616 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studier på skjelettmuskulatur fysiologi møte teknisk utfordring med passende å behandle prøvene for å oppnå seksjoner med klart synlige cytoplasmatiske rom. Et annet hinder er det med tett holding av myofibers til det omgivende vev. Fordi prosessen av vev og fiksering i parafin fører til krymping av muskelfibre, er fryse et optimalt middel for herding muskelvev for seksjonering. Imidlertid er en vanlig forekommende problem, dannelse av iskrystaller, oppstår under fremstillingen av frosne seksjoner på grunn av det høye vanninnhold i muskel. Protokollen presenteres her beskrives først en enkel og effektiv metode for på riktig måte å fryse muskelvev ved å senke dem i flytende nitrogen. Problemet med å bruke flytende nitrogen alene er at det fører til dannelse av en nitrogengass-barriere ved siden av vev, som virker som en isolator og hindrer avkjøling av vev. For å unngå dette "damp teppe" effekt, en new kryoampulle er designet for å øke hastigheten på væskestrømmen rundt vevsoverflaten. Dette ble oppnådd ved å slå sammen 14 innløpshull i veggen av ampullen. Ifølge bobledynamikken, til en høyere hastighet av væskestrøm resulterer i mindre bobler og færre muligheter danne en gassbarriere. Når flytende nitrogen strømmer inn i kryoampulle gjennom innløpshull, strømningshastigheten rundt vevet som er rask nok til å eliminere gassbarriere. Sammenlignet med fremgangsmåten for frysing av muskelvev ved hjelp av pre-avkjølt isopentan, er denne protokollen enklere og mer effektiv, og kan brukes til å fryse muskel i et gjennomløp måte. Videre er denne metode optimal for institusjoner som ikke har adgang til isopentan, som er svært brannfarlig ved romtemperatur.

Introduction

Skjelettmuskulatur er den mest verdifulle komponenten i en kjøttproduserende dyr fra det ernæringsmessige og behandling synspunkt. I kjøttindustrien er det to særlig viktige aspekter: effektiviteten av muskelvekst og kvaliteten av det resulterende kjøtt. Som en hovedkomponent av muskelen, muskelfibre er direkte relatert til vekst ytelse og ferskt kjøttkvaliteten hos dyr 1. For eksempel kan det totale antall av fibre (TNF) og den Tverrsnittsareal av fibre (CSAF) for det meste bestemme muskelmasse og kjøttkvalitet; også, Fiber Type Sammensetning (FTC) sterkt påvirker ferskt kjøtt kvalitet 2. Derfor er det manipulering av muskelfiberegenskaper hos dyr en svært effektiv metode for å øke kjerne lønnsomhet og konkurranse av gårdsbruk 1.

Hittil har flere indre og ytre faktorer blitt identifisert til å manipulere muskelfiber characteristics 1. Denne manipulasjon kan oppnås ved målrettet utvalg av dyr med spesifikke gener, slik som myostatin-genet hos storfe 3, den Callipyge genet i sau 4, og den RYR1 og IGF2 gener hos griser 5. Også, kosthold kontroll og behandling med bestemte hormoner spiller en viktig rolle i muskelfiberegenskaper 6. Dermed kan en tilnærming som kombinerer genetiske og ernæringsmessige faktorer kunne forbedre magert kjøtt innhold og kjøttkvalitet. Imidlertid er studier av muskelfibre begrenset i kjøttindustrien, fordi klarlegging av strukturen av muskelfibre fremdeles er en utfordring.

Muskelfiberegenskaper blir identifisert ved hjelp av histokjemiske metoder, slik som myosin adenosin trifosfatase (ATPase) assay. Denne metode er basert på det faktum at enzymer lokalisert i tynn (6-8 um) frosne seksjoner avmuskelfibre kan reagere kjemisk med visse produkter. Imidlertid er vanninnholdet i muskler som er større enn 75% i griser, kaniner, mus og mennesker, uavhengig av den stilling (dvs., rygg, mage, eller bakbenekstensjon) 7. Et slikt høyt fuktighetsinnhold i musklene forårsaker en vanlig forekommende problem - frysing gjenstander - under fremstilling av frysesnitt, som tidligere beskrevet 8, 9. I de fleste tilfeller er det nesten umulig å riktig fryse muskler i et slakteri produksjonslinje, etter våre erfaringer.

Protokollen som presenteres her beskrives en enkel og effektiv metode som brukes i laboratoriet for å fryse muskelvev for cryosectioning i en high-throughput måte. Høydepunktet av denne metode er en ny kryoampulle som er utformet for flash-frysing muskler i flytende nitrogen. Den nåværende arbeidsflyt kan samtidig lette vevfrysing og prosessering for en utmerket muskel cryosection, med en klart synlig cytoplasmisk rommet og med tett holding av myofibers til det omgivende vev. I tillegg kan denne protokoll brukes på en lang rekke alternativer for vev analyse fordi flytende nitrogen ikke blander seg med vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nåværende metode er blitt etablert og valideres for å høste og lagre mer enn 1000 muskelprøver for histologisk farging i vårt laboratorium. Alle prosedyrer som involverer dyr omsorg og bruk fulgt retningslinjene fastsatt av Landbruksdepartementet i Kina.

1. Utstyr for Prøvetaking

  1. Merk prøven med identitet på hver kryogen hetteglass.
    Merk: Den kryogene ampulle er spesielt utformet for å fryse friske vevsprøver for cryosection prosedyre (figur 1A). Ampullene er laget av polypropylen i en støpeform fabrikk (figur 1C).
  2. Oppnå den følgende utstyr: flytende nitrogen i et passende flytende nitrogen tank, sikkerhetsbriller eller en ansiktsskjerm, fryser hansker, 10 cm tang, 25 cm pinsett, et Styrofoam kjøler (indre dimensjoner: 20 cm x 12 cm bred x 13,5 cm høy ; ytre dimensjoner: 24 cm lang x 16 cm bred x 15 cm høy), plastisk film (2,5 cm lange x 0,8 cm brede x 0,1 mm tykk),en skalpell, og A4 PVC-bindende dekker (21 cm x 29,5 cm) (figur 1B).

2. Fremstilling av muskelprøver

  1. Fyll Styrofoam kjøler med flytende nitrogen 5 min forut for prøvetaking.
    MERK: stor kolonne av flytende nitrogen er viktig fordi en del av den flytende nitrogen koker bort og blir til gass når nye prøver berører den. For å redusere hyppigheten av overføring av flytende nitrogen for å etterfylle den tap, må en passende størrelse Styrofoam kjøleren bli kjøpt på forhånd i henhold til det antall prøver.
  2. Når en prøve blir innhentet, forsiktig plassere den på et stykke av A4-PVC-binding deksel og retningen observeres muskelfibrene.
    MERK: Her har vi brukt tverrsnitt av longissimus doris muskel fra den første til den siste lumbarvirvel hos gris. Prøvestykkene er ca 12 cm lang og 8 cm bred og 5 cm høye.
  3. Bruk en skalpell til å lage to parallelle snitt gjennom prøven in retningen av muskelfibre, ca. 3 cm i lengde og 0,6 cm fra hverandre. Trim risset muskelen til et rektangel omtrent 0,6 cm bredt x 0,6 cm x 1,5 cm lang.
    MERK: påliteligheten av måling av tverrsnittsarealet av muskelfibre for det meste avhenger av fiberorienteringen i den oppsnittede muskelen.
  4. Bruk 10 cm pinsett for å dra ned prøven på et stykke av plastfilm, med den langsgående aksen til snittet muskelen parallelt med den lange kant av filmen (figur 2A).
    MERK: Plastfilmen har to funksjoner: en holdefunksjon som hjelper i å fiksere orienteringen av muskelfibrene, og en adhesjon funksjon som forhindrer sprekker i prøven på grunn av hurtig frysing.
  5. Ved hjelp av pinsett, plasserer muskelvev inn i den nedre midten av en merket kryogen ampulle, mellom innløpshullene, og deretter tett kork på karet (figur 2B).

3. Frysing og lagring av muskelprøvens

  1. Ved hjelp av 25 cm pinsett, raskt dyppes hele ampullen kryogen i flytende nitrogen i den forhåndsavkjølt kjøler Styrofoam, å vente til det flytende nitrogenet ikke koker (ca. 10-20 s).
    MERK: kryoampulle vil flyte når den flytende nitrogen koker, så nøye dyppe glasset i den kokende flytende nitrogen i 10-20 s.
  2. Overfør muskelprøver til en flytende nitrogen-lagrings-tank eller en -80 ° C fryser for langtidslagring.

4. Før Preparat

  1. Forhåndskjøling av en kryostat til mellom -20 ° C og -22 ° C.
  2. Fjern og kast den gamle mikrotomen blad, tørk av knivholderen og stabiliseringsplaten i kryostaten, installere en ny mikrotom blad i kryostaten, og setter skjæretykkelsen til 8 um.
  3. Overfør den muskelprøven i den kryogene ampullen fra den flytende nitrogen-lagrings-tank eller -80 ° C fryser til kryostaten, transportere det i flytende nitrogen eller tørris. Vent i 30 minutter for å få prøven til likevekt med temperaturen i kryostaten.
    MERK: Ethvert utstyr som kan røre prøven må være forhåndsavkjølt, fordi en høy temperatur kan forårsake dannelse av iskrystaller i prøven.
  4. prøven i prøveholderen montere under optimale betingelser under kutt temperatur formulering av vannoppløselige glykoler og harpikser (OCT). Skjær-8 jim snitt.
    MERK: Juster skjærevinkel perpendikulært på orienteringen av muskelfibrene, fordi CSAF er det tverrsnittsarealet av muskelfibre.
  5. Montere seksjonene mot midten av et rom-temperatur microslide. Umiddelbart sleiden inn i en glidekassen i en -80 ° C fryser. Ikke la lysbildet tørke ved romtemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den kryoampulle illustrasjon og vanlig laboratorieutstyr for frysing muskler under fremstillingen av frosne seksjoner er vist i figur 1. De fryseflasker er laget av polypropylen i en støpeform fabrikk. Hver ampulle har en total av 14 innløpshull: den ene er på kapselen; en annen er på bunnen; og de resterende 12 danner fire parallelle linjer, hver med fire hull på 90 ° i forhold til hverandre. Disse innløpshullene kan øke hastigheten av strømningshastigheten av flytende nitrogen ved siden av vev for å unngå "damp teppe" effekt når det flytende nitrogen kommer i kontakt med vev. Følgelig er det svært få iskrystaller dannes i de frosne prøver. Viktigere, isopentan, den ekstremt flyktig og brennbar væske med et kokepunkt ved 28 ° C, er ikke nødvendig i denne fremgangsmåte.

For ytterligere å markere Fordelen med denne metoden, frøs vi longissimus dorsi muskeleni griser ved hjelp av fem frysemetoder og så observert deres fargingsegenskapene og histologiske detaljer ved hjelp av et hematoksylin / eosin (HE) flekk (figur 3). En vanlig forekommende problem var dannelsen av iskrystaller under fremstillingen av musklene for cryosection. Når prøven ble plassert direkte i en -80 ° C fryser (figur 3A), store iskrystaller dannes og bringes deretter til en velkjent "sveitserost" effekt i muskelen cryosection. Videre iskrystaller også dannet når muskelvev ble nedsenket direkte i flytende nitrogen (figur 3B). Selv om flytende nitrogen er en meget kald væske (-190 ° C), er dens varme konstant ekstremt lavt. Når eventuelle prøven kommer i kontakt med flytende nitrogen, kan et dampteppe bygge seg opp ved siden av vev og isolere inntrengning av kald inn i vevet. I tillegg er en rutinemessig prosedyre for frysing prøver i patologiske laboratorier ikke ennå anvendbar for muskelvev. ENs er vist på figur 3C, er mange nållignende iskrystaller som dannes i det cytoplasmatiske rommet myofibers etter at muskelvevet ble dyppet i oktober monteringsmedium i den riktige orientering og deretter hurtig frosset i en oppslemming av isopentan (-160 ° C). Som konklusjon, må et passende frysehastigheten for muskelvev være strengt oppfylt i drift.

Den nåværende protokoll oppnår utmerket integritet prøven, med en klart synlig cytoplasmisk rommet og med tett holding av myofibers til det omgivende vev (Figur 3D). Det gir mulighet for god visualisering av de metabolske egenskaper av muskelfibre ved hjelp av myosin ATPase-analysen (figur 3E). For denne analysen ble myosin ATPase-aktivitet analyseres basert på det faktum at hurtig-kontraherende muskelfibre (pattedyrtypen 2a og 2b) hydrolyseres ATP raskere enn sakte-kontrahering fibre (pattedyr-type 1). Når gitt equivalent ganger, hurtig-kontrahering fibre vises lys, med to grader, og sakte kontrahering fibre svart. Viktigere, kan denne metoden bli anvendt effektivt i en high-throughput miljø fordi det er lett å utføre og sparer tid (figur 4). I dag er en veletablert metode for å senke frysepunktet muskelvev i en oppslemming av isopentan uten kontakt med oktober monteringsmedium, som tidligere beskrevet 8, 9 (figur 3F). I denne fremgangsmåten, det tar omtrentlig 30 min for en faststoff-væske oppslemming av 240 ml av isopentan som skal oppnås ved forkjøling av isopentan i flytende nitrogen og omrøring inntil små hvite utfellinger vises på bunnen (figur 4). Det er tre praktiske vanskeligheter som oppstår ved forskere ved forsøk på å fryse muskler i på forhånd avkjølt isopentan: (1) En fast-væske-oppslemming av isopantane er vanskelig å opprettholde nårprøvetakingstiden er mer enn 1 time. I våre tidligere forsøk, frysing gjenstander vanligvis skjedde i de prøvene som ble gjort på midten og slutten stadier av prosessen, når dusinvis av muskel vev ble samlet inn en gang. (2) Som en farlig væske, isopantane er ikke tillatt hvor som helst på offentlig transport. (3) Isopentan er ikke tilgjengelig, bortsett fra i laboratorier. Mange kjøtt science forskere vanligvis fryse muskler i et slakteri som er langt borte fra et laboratorium, og det er ikke lov til å ha isopentan. I tillegg diagnostiske muskelbiopsi er ofte sub-optimal behandlet på grunn av mangel på isopentan ved medisinske anlegg. Dermed er vår protokoll en viktig utvikling for frysing muskelprøver i situasjoner hvor isopentan er utilgjengelig.

Figur 1
Figur 1: Apparat for muskel frysing. (A) Illustrasjoneneav kryoampulle brukt i denne studien. 14 innløpshullene stanses i rørveggen: den ene er på kapselen; en annen er på bunnen; og de resterende 12 danner fire parallelle linjer, hver med fire hull på 90 ° i forhold til hverandre. (B) Et fotografi av fryseapparatet. En sikker og effektiv måte for frysing muskler i flytende nitrogen innebærer bruk av en kryoampulle, plastfilm, sikkerhetsbriller, fryser hansker, 10 cm tang, pinsetter 25 cm, en Styrofoam kjøler, en skalpell, og A4 PVC binding deksel. (C) Bildene av kryoampulle formen utstyrt med et ingeniør, Yonghua Wang, i formen fabrikken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Fremstilling av muskelprøver. (A (B) Den muskelvev skal plasseres mellom innløpshullene i den kryogene ampullen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Representative Bilder av Histologisk Evaluering av Pig Longissimus dorsi musklene etter de er frosset ved hjelp av fem ulike metoder.
Iskrystaller ødelegge lesbarheten av muskelfrysesnitt bilde av med HE farging når musklene er frosset for histologisk analyse ved hjelp av upassende metoder, som vist i (AC). Betydelige frysing gjenstander oppstod da muskelprøver ble direkte anbragt i en 80 ° C fryseboks (A) eller dyppet i flytendenitrogen (B). Mange nållignende iskrystaller som dannes i de enkelte muskelceller etter at muskelvevet ble dyppet i oktober og deretter direkte satt til en slurry av isopentan (C). Protokollen som presenteres i denne undersøkelse kan eliminere dannelsen av iskrystaller når muskelvevet er ganske enkelt senket ned i flytende nitrogen (D). Denne protokollen er anvendbar for analyse av enzymaktivitet i frosset muskel basert på den myosin ATPase-analyse (E). Standardfrysemetode for muskel utfører ikke bedre; muskelvev er dyppet i en velling av isopentan uten direkte kontakt med oktober monteringsmedium (F). Alle bilder er under et 10X objektiv, bortsett fra de med sorte kanter (20X). Skala barer: 100 um. Pilspissen i figur 3C viser små nål-lignende iskrystaller. Pilspissen og tekst i figur 3E viser type muskelfibre: type 1 representerer langsom myosin tungkjede-fibre, type 2A organer mellom myosin tungkjede fibre, og skriver 2B indikerer hurtig myosin tungkjede fibre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Sammenligning av arbeidsprosesser for flytende nitrogen-baserte og Isopentan-baserte Kjøle prosedyrer. I den flytende nitrogen-basert protokoll, blir muskelvevet i den nye kryoampulle nedsenket i flytende nitrogen. I isopentan-basert protokoll, må en oppslemming av isopentan oppnås på forhånd ved forkjøling av isopentan i flytende nitrogen og omrøring inntil små, hvite bunnfall nederst. Deretter blir muskelvevet dyppet i forkjølte isopentan. Sammenlignet med 35 min i isopentan-basert prosedyre, som beskrevet i figur 3F, tar det bare 5 min t o fullføre frys prosedyren presentert i denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Flytende nitrogen å strømme gjennom en skarpkantet åpning. Ved neddykking av hele flerhulls kryoampulle i flytende nitrogen, atmosfæriske trykk-krefter flytende nitrogen inn i røret gjennom 14 innløpshullene. Tilstedeværelsen av hullene gjør strømmen akselerere gjennom dem, og dermed øke hastigheten. En resirkulerende strøm (i blått) utvikler umiddelbart nedstrøms for åpningen (oransje). D1 indikerer åpningens diameter på veggen av røret, og D2 representerer avstanden mellom åpningen og den muskelprøven (rødt).= "_ Blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en ny, flerhulls kryoampulle for frysing og lagring av muskelvev for å utføre histologiske vurderinger av muskelfunksjonen. Den kritiske modifiserte trinnet i denne protokollen er at prøven i det flerhulls kryoampulle er direkte nedsenket i flytende nitrogen. Så vidt vi vet, er dette den enkleste og rapidest måten å oppnå gode frosne prøver for muskel cryosectioning blant de eksisterende frysemetoder (se representative resultater).

Den tekniske Utfordringen til muskel forskere er at iskrystallene er mest sannsynlig å danne ved bruk av frysing som middel for å herde muskelvev for seksjonering. Som angitt i de representative resultater, tre faktorer spiller en betydelig rolle i å bestemme riktig muskel frysing for patologiske undersøkelser, innbefattende å velge en passende kjøleanordning, å minimalisere fuktigheten av prøven, og å øke andelen av den totale overflate i kontakt med den kalde kilden. Først,graden av frysing er avgjørende for å unngå skade under fremstillingen av det frosne vev til snitting. Når frysingen er langsom, frosne muskler viser den velkjente "sveitserost" effekt fordi store iskrystaller dannes ekstracellulært. Når frysingen er hurtig, men ikke tilstrekkelig hurtig, blir et stort antall små, nål-lignende iskrystaller som dannes i de enkelte muskelceller. Disse nållignende iskrystaller forårsaker lite detekterbar strukturelle skader, men de gir de følgende effekter: mitokondrier blir skadet 10, blir størrelsen av muskelfibrene kunstig økt 11, og integriteten av fiberstrukturer blir ødelagt 11. Således, en kjøleanordning ved en lav nok temperatur og en tilstrekkelig frysehastighet er avgjørende for å unngå dannelsen av iskrystaller i muskelfrysesnitt.

Ideelt, er den kjøleanordning ved ekstremt lave temperaturer, og er innrettet to ta kontakt med alle overflater. Både flytende nitrogen (-190 ° C) og isopentan i en faststoff-væske blandet tilstand (-160 ° C) tilfredsstiller denne betingelse. Men de to frysemedia har sine egne ulemper. Flytende nitrogen har en ekstremt lav spesifikk varme konstant. Resultatet er at kontakten mellom flytende nitrogen og vevet forårsaker en dampsperre som bygger seg opp ved siden av vev og sterkt forsinker inntrengning av kald inn i vevet 12. Således vesentlige fryse gjenstander forekommer inne i frosset muskelen. Oppslemmingen tilstand av isopentan er et utmerket fryse medium som ikke danner dampbarrierer, men hovedproblemet er at isopentan skal brukes i forbindelse med flytende nitrogen for å oppnå et flytende bad-temperatur på 160 ° C. I tillegg er isopentan en meget flyktig og brennbare væsker ved romtemperatur. For det andre inneholder den muskeloverdreven vann (> 75%), slik at en hvilken som helst måte for innføring av eksogene fuktighet i prøve ville forårsake frysing gjenstander. For eksempel legger oktober monteringsmedium ekstra vann til muskelen, slik at iskrystallene er mye mer fremtredende i disse muskelfrysesnitt sammenlignet med de uten oktober monteringsmedium. Til slutt, tykkelsen av muskelvevet er også viktig å hensiktsmessig fryse det fordi frekvensen av frysing avhenger delvis av hvor mange prosent av den totale overflate i kontakt med den kalde kilden (vanligvis, den tykkelse <0,5 cm). Følgelig er den eneste eksisterende måten å riktig fryse vevet er å dyppe muskelvev med en tykkelse som er mindre enn 0,5 cm inn i forhåndsavkjølt isopentan (160 ° C), som tidligere beskrevet 8.

Denne protokollen først beskrives hvordan man skal fryse muskelvev ved å dyppe dem direkte i flytende nitrogen. Problemet med å bruke flytende nitrogen alene er dannelsen av nitrogengass i løpet av vevet overflate, som virker som en isolator og inhibering av avkjøling av vevf "> 13. En slik dampteppe kan dannes bare ved sammensmelting av boblene er så hurtige at nitrogengass kan separere vev fra den flytende nitrogen. I henhold til bobledynamikken, blir en raskere væskestrømning resultere i mindre bobler, som det har færre muligheter til å fusjonere 14. Derfor utstansede vi 14 hull i veggen av den kryoampulle for å øke hastigheten på væskestrømmen rundt vev og for å bidra til å unngå "damp teppe" effekt når det flytende nitrogen kommer i kontakt med vevet.

Tatt i betraktning at en faktor som bestemmer eksperimentelle suksess er hastigheten på væskestrømmen rundt vev, tre parametere av kryoampulle er meget viktig, blant annet den posisjonen og antallet av hull, diameteren på innløpshull, og avstanden mellom åpningen og prøven. Flytende dynamikk viser at strømningshastigheten gjennom en åpning bestemmes av diameteren av hullene, og at et resirkulerende strømning utvikles straks nedstrøm av åpningen (figur 5) 15, 16. Tilsvarende er avstanden mellom åpningen og prøven bestemmer stort sett kontaktarealet mellom den høyhastighetsfluidstrøm og prøven, som vist i figur 5. Følgelig er den flerhulls kryoampulle i figur 1A er egnet for et muskelprøven som er 0,6 cm bredt x 0,6 cm høyde x 1,5 cm lang. For større muskelfragmenter, er det verdt å prøve denne metode med et større rør og flere hull. Imidlertid er denne protokollen ikke er egnet for frysing muskelprøver fra små dyr, for eksempel i en murin modell, fordi innløpshullene kan være for stor for mindre prøver.

I tillegg må tre kritiske trinn følges nøye i protokollen. Først bør det flytende nitrogenet være tilstrekkelig å dyppe hele kryoampulle, og den kryogene hetteglasset må være helt under væskenivået. For det andre er det nødvendig med envoid utilsiktet kontakt mellom frosne muskler og rom-temperatur beholdere eller instrumenter. For eksempel, uten en skånsom transport, kan nye iskrystaller dannes ved overføring av en frossen prøve fra flytende nitrogen-lagrings-tank eller -80 ° C fryser i en kryostat. For det tredje, det bør ikke være for mye oktober brukes når prøvene er montert på holderen på grunn av den høye sannsynligheten for iskrystalldannelse rundt kontaktområdet mellom frosne muskler og oktober

I kjøttindustrien, er en muskel cryosection prosedyre uunnværlig fordi prosessen med formalinfiksering og i parafin forårsaker krymping i muskelfibrene, noe som svekker for å evaluere noen muskel egenskaper, slik som TNF og CSAF. I tillegg er frosset muskel kreves ved vurdering av FTC hjelp av myosin ATPase-analysen. Som vist på figur 3E, kan denne protokollen oppfylle kravene til både patologisk analyse og histokjemiske flekker i muskler. Forberedelsenav en cryosection er en rutineoperasjon i kliniske muskel patologi laboratorier. Som beskrevet av Meng et al. 8, er en standard prosedyre for frysing muskelvev er å dyppe obduksjons prøver i forhåndsavkjølt isopentan. Imidlertid er isopentan utilgjengelig å fryse obduksjons prøver ved institusjoner uten kliniske muskel patologi laboratorier. Følgelig er diagnostiske muskelbiopsi ofte suboptimalt behandlet ved mange medisinske anlegg. Således kunne vår protokoll vesentlig forbedre muligheten for små sykehus eller i laboratorier for å utføre diagnose muskel-biopsier av tilstrekkelig kvalitet. Tatt i betraktning den høye effektiviteten og enkel betjening av denne protokollen, kan det være et lovende alternativ til dagens isopentan baserte frysemetode og som har bred anvendelse for histologiske undersøkelser i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter, økonomisk eller på annen måte, er erklært av forfatterne.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (NSFC): 31301950 og 31671288.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat Microtome  Leica Leica CM1950
Digital Microscope  Nikon Nikon DS-U3
 Cryogenic Vial   Plastic film Designed by ourself
Liquid Nitrogen Commomly-used
Scalpel Commomly-used
10 cm forceps Commomly-used
25 cm tweezer Commomly-used
Safety glass Commomly-used
Freezer gloves Commomly-used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95, (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84, (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2, (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38, (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57, (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69, (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8, (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12, (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53, (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71, (9), 300-309 (2012).

Comments

2 Comments

  1. Excellent article! Could you please provide information on how to obtain the special cryovials?

    Reply
    Posted by: Teresa Z.
    April 28, 2017 - 10:54 AM
  2. Glad to hear that you are interested in this article.

    As for the information of obtaining the special cryovial, here are my suggestions. If your sample number is not very large, you can just use a red hot nail to create holes along common cryovial directly (More details can be seen in the paper in Figure 1. The Apparatus for Muscle Freezing). While, if the sample you need are in a large number, please follow this patent (http://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action) and make it in bulk-production. We are willing to provide some sample template if necessary.

    Best wishes!

    Reply
    Posted by: Yanyu D.
    May 2, 2017 - 9:13 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics