Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

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Genetics

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Summary

DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.

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Zhang, P., Rojas, A., Blechacz, B. Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (124), e55689, doi:10.3791/55689 (2017).

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Abstract

DNA 복제 및 수리, DNA 재조합 및 유전자 발현을 포함한 여러 세포 과정은 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 필요로합니다. 따라서 DNA- 단백질 상호 작용은 세포 분화, 세포 증식, 세포주기 조절, 염색체 안정성, 후성 유전자 조절 및 세포 변형과 같은 여러 생리적, 병리 생리 학적 및 생물학적 기능을 조절합니다. 진핵 세포에서 DNA는 히스톤 및 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축됩니다. 전기 이동 (젤) 이동성 이동 분석 (EMSA) 및 DNase I 발자국과 같은 몇 가지 기술 도구를 사용하여 DNA- 단백질 상호 작용을 분석 할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 세포 내에서가 아니라 in vitro에서 단백질 -DNA 상호 작용 분석합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 특정 DNA 결합 부위에서 단백질을 포착하여 DNA- 단백질 상호 작용을 확인하는 기술입니다s의 염색질 컨텍스트 내에서. 이것은 DNA- 단백질 상호 작용을 고정시킨 후 관심 단백질의 면역 침전에 의해 이루어진다. 이어서, 단백질이 결합 된 게놈 부위가 특성화된다. 여기에서 우리는 ChIP를 기술하고 논의하고 티로신 - 아밀로오스의 프로모터 영역 내에서 전사 인자 SMAD2의 SMAD 결합 요소 (SBE) 로의 형질 전환 성장 인자 -β (TGF-β) - 유도 된 결합의 동정을위한 분석적 가치를 입증한다. 단백질 키나아제 키트 (c-KIT) 수용체 리간드 줄기 세포 인자 (SCF).

Introduction

진핵 생물의 핵에서는 DNA가 히스톤 단백질과 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축된다. 생리 학적, 병태 생리 학적 및 세포 생물학적 상황에서 세포 기능은 염색질 - 조정 된 유전자 발현에 의해 공간적 및 일시적으로 조절된다. DNA- 단백질 상호 작용은 DNA 복제, 재조합 및 수리뿐만 아니라 단백질 발현과 같은 세포 과정의 조절에 필수적인 역할을한다. 따라서, DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 발현 및 세포 기능의 평가에 없어서는 안될 도구입니다.

Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA)와 DNase I footprinting 1,2 와 같은 시험 관내에서 DNA- 단백질 상호 작용을 평가하는 몇 가지 기술이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 염색질 및 세포 내에서 단백질 -DNA 상호 작용을 분석하지 못합니다. 칩 i이 기술은 특정 DNA 결합 부위에 결합 된 단백질을 포착하여 염색질 컨텍스트 내에서 DNA- 단백질 상호 작용의 확인을 용이하게합니다. 이 기술은 원래 Gimour와 Lis가 Escherichia coliDrosophila melanogaster 3 , 4 에서 특정 유전자에 결합하는 RNA 중합 효소 II의 평가를 위해 개발되었습니다. 이것은 DNA- 단백질 복합체를 고정시킨 후 염색질 추출을 수행하고 ~ 200 염기쌍 (bp) 단편으로 DNA를 절단함으로써 수행됩니다. 이어서, DNA- 결합 된 관심 단백질은 면역 침전에 의해 분리된다. DNA- 단백질 교차 결합의 역전 후, DNA를 정제하고 분석한다. 몇 가지 방법은 단백질 결합 사이트의 분석을 위해 사용할 수 있으며 대상 유전자 내 단백질 바인딩 사이트의 핵산 시퀀스에 따라 달라질 수 있습니다. DNA 서열이 알려져있는 경우, 표준 Pol알려진 결합 부위에 인접한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 ymerase Chain Reactions (PCR)을 적용 할 수 있습니다. 정량 실시간 PCR (qRT-PCR)도 사용할 수 있습니다 6 . 서열이 알려지지 않은 경우 ChIP는 DNA 마이크로 어레이 (ChIP-on-chip), DNA 시퀀싱 (ChIP-seq) 또는 클로닝 기술 7 , 8 , 9 와 결합 될 수있다.

TGF-β 경로는 강력한 종양 억제 기능을 가지고 있으며 세포 분화의 핵심 경로입니다. TGF-β1 리간드와 동족 수용체 복합체의 결합을 통해 활성화되어 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 - 포스 포 릴화를 일으킨다. 공통 중재자 인 SMAD4와의 결합 이후에, SMAD- 복합체는 핵으로 전위되어 표적 유전자의 프로모터 영역 내의 SBE와 결합하여 세포주기, 세포 사멸 및 세포 특이성을 조절하는 유전자를 조절한다에. TGF-β 자극에 대한 전사 반응은 세포 유형 및 상황에 따라 다릅니다 10 . 최근에 우리는 TGF-β와 c-KIT 경로 사이에 긍정적 인 피드백 고리를 기술했다. 이 모델에서, TGF-β1- 활성화 SMAD2는 c-KIT 리간드 프로모터에 결합하여 그 발현 및 분비를 유도한다. 이어서, c-KIT 리간드는 자동 및 준 - 유사 방식으로 c-KIT 수용체를 활성화시킨다. c-KIT 수용체 활성화는 JAK1 / 2를 통한 STAT3 Tyr705- 인산화를 초래한다. STAT3 활성화 및 핵 전좌 이후, STAT3은 TGF-β1 리간드 유전자에 결합하고 그 발현을 조절한다.

여기에서 우리는 c-KIT 수용체 리간드 프로모터에 대한 SMAD2 결합의 확인과 신호 변환기 (and) Transcription 3 (STAT3의 TGF-β1- 유전자).

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Protocol

1. 솔루션 준비

  1. 각 실험마다 다음과 같은 해결책을 준비하십시오.
    1. 고정 솔루션을 위해서는 37 % 포름 알데히드를 준비하고 RT에 보관하십시오. 1.42 %의 최종 농도로 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)로 희석한다.
      주의 : 포름 알데히드는 자극성, 부식성, 돌연변이 성, 기형 발생 성 및 발암 성으로 분류됩니다. 섭취하지 마십시오. 가스 / 흄 / 증기 / 분무를 흡입하지 말 것. 환기가 충분하지 않은 경우 적절한 호흡 장비를 착용하십시오. 피부 및 눈과의 접촉을 피하십시오. 산화제, 환원제, 산성 물질, 알칼리성 물질 및 습기와 같은 비 양립성 물질로부터 멀리하십시오.
    2. 글리신 정지 - 수정 솔루션을 위해, 1x PBS 솔루션 0.125 M 글리신을 준비하고 RT에 저장하십시오.
    3. 세포 스크래핑 솔루션, dH 2 O에 1x PBS 솔루션을 준비하고 얼음에 저장하십시오. 사용 직전에 proteinase inhibitor 인 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) t최종 농도 0.5 mM.
      주의 : PMSF는 부식성 및 독성으로 분류됩니다. 보호 복을 착용하고 통풍이 잘되는 곳에 사용하십시오.
    4. 세포 용해 용액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5 % NP40)을 사용하기 전에 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; dimethyl oxoxide (DMSO) 중 100X 원액 : 104 mM 4- (AEBSF), 80 μM 아프로 티닌, 4 mM 베타 틴, 1.4 mM E-64, 2 mM 루피 펩틴 및 1.5 mM 펩 스타틴 A) 및 0.5 mM PMSF를 첨가 하였다.
    5. 핵 용해 완충액 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 1 % SDS)을 사용하기 전에, 1X PIC 및 0.5 mM PMSF를 첨가한다.

2. 세포 고정 및 전단

  1. 10cm 조직 배양 접시에 70-80 % 합류로 세포를 성장. 실험 목적에 따라 세포를 자극하십시오.
  2. 조직 배양 배지를 제거하고 고정 용액 5 mL를 넣고 배양한다.떨고있는 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 세포를 세척 하였다.
  3. 고정 솔루션을 제거하고 얼음으로 차가운 1X PBS 10 ML로 세포를 두 번 씻으십시오.
  4. 1x PBS를 제거하고, 글리신 중지 - 수정 솔루션 5 ML을 추가하고 떨고 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 세포를 품어.
  5. 글리신 중지 - 수정 솔루션을 제거하고 얼음으로 차가운 1X PBS 10 ML로 세포를 두 번 씻으십시오.
  6. 1X PBS를 제거하고 세포 스크래핑 용액 2mL를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수거하십시오. 수확 한 세포를 얼음 위에 원뿔형 튜브로 옮긴다.
  7. 600 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 시료를 원심 분리하십시오.
  8. 뜨는을 제거하고, 1X 세포 용해 버퍼의 1 ML에 펠렛을 resuspend하고, 30 분 얼음에 품어. 또는 액체 질소로 펠렛을 스냅 동결하고 -80 ° C에 보관하십시오.
  9. 일단 펠렛이 세포 용해 버퍼에 resuspended되면 얼음 추위 dounce 균 질기에 세포 현탁액을 전송하고 타입 B pestl를 사용하여 10 스트로크에 douncee 세포 파괴.
  10. microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 2,400 XG와 4 ° C에서 10 분 샘플을 원심 분리기.
  11. 뜨는을 폐기하고, 핵 소화 완충액 350 μL에 펠렛을 resuspend, 37 5 분 ° C.에 대한 샘플을 품어.
  12. micrococcal nuclease (1 U / μL)를 추가하고 vortexing하여 섞는다. 37에서 샘플을 품어 ° C 5 ~ 20 분; 2 분마다 반전시켜 시료를 섞는다.
    참고 : 시간과 효소 농도는 세포주마다 다르며 최적 이하 효소 절단의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다.
  13. 또는 상업적으로 이용 가능한 초음파기를 사용하여 초음파로 크로 마틴을 절단 할 수 있습니다.
    참고 : Sonication 조건 최적화가 필요합니다. 아래에 샘플 볼륨 300 μL과 샘플 처리 능력 25 %를 사용하는 최적화 예제 프로토콜이 제공됩니다.
    1. 단계 2.10에 따라, 상등액을 버리고 n을 재현 탁한다1.0 mL의 상업용 전단 버퍼에 넣었다.
    2. 3 분의 1.7 ML microcentrifuge 튜브로 resuspended 핵 펠렛의 나누어지는 300 μL. 얼음 위에 올려 놓으십시오.
    3. 최적 sonication 조건을 결정하는 3 가지 조건을 사용하여 25 % 전력에서 고정 염색질의 3 aliquots을 전단 :
      각각 20 초의 5 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식.
      각각 20 초의 10 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식.
      각각 20 초의 20 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식.
    4. 아래에 설명 된대로 단계 2.15를 계속하십시오.
  14. micrococcal nuclease와 incubation 후, 반응을 멈추기 위해 ice-cold 0.5 M EDTA 7 μL를 첨가한다.
  15. 16,200 XG 및 4 ° C에서 10 분 동안 절단 된 DNA로 샘플을 원심 분리하십시오.
  16. 전단 된 DNA 함유 상층 액을 신선한 미세 원심 분리 관으로 옮긴다. 별도의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 50 μL를 su를 확인하십시오세심한 DNA 절단 (3 절). 면역 침전 (섹션 4)을 위해 나머지 부피를 즉시 사용하거나 -80 ° C에 보관하십시오.

3. 전단 효율의 확인

  1. 단계 2.16에서 잘라낸 염색질의 50 μL 나누어지는 부분에 nuclease없는 dH 2 O 150 μL와 5 M NaCl 10 μL를 추가합니다.
  2. 가교 결합을 반대하기 위해 샘플을 65 ° C에서 4 시간 동안 품는다.
  3. RNase A (10 μg / μL) 2 μL를 넣고 37 ° C에서 15 분간 배양합니다.
  4. proteinase K (0.5 μg / μL) 10 μL를 첨가하고 42 ° C에서 90 분간 배양한다.
  5. DNA 정제를 위해 페놀 / 클로로포름 추출 12을하십시오 .
    1. nuclease-free 물을 200 μL의 최종 부피에 첨가하십시오. 200 μL의 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)을 시료에 넣고 20 초 동안 와동시킨다.
    2. 방에 원심 분리기16000 x g에서 5 분 동안 성숙. 조심스럽게 상부 수성 상을 제거하고 신선한 튜브로 옮긴다. 피펫을 할 때 페놀을 옮기지 않도록주의하십시오.
    3. 0.1 M 3M 초산 나트륨 (NH 4 OAc) (pH 5.2)을 넣고 손가락으로 튜브를 여러 번 가볍게 쳐서 섞는다. 빙냉 된 100 % 에탄올 2.5 부피를 넣고 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다. -20 ° C에서 시료 O / N을 배양하거나 -80 ° C에서 1 시간 이상 배양하십시오.
    4. 4 ° C와 16,000 XG에서 30 분 동안 시료를 원심 분리하여 cDNA를 펠렛으로 만든다.
    5. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. RT, 70 % 에탄올 1 ML을 추가하고 튜브를 여러 번 거꾸로.
    6. 4 ° C 및 16,000 X g에서 2 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. 조심스럽게 상등액을 제거하십시오.
    7. 펠렛을 실온에서 5-10 분 동안 건조시킨다. dH 2 O 30 μL에 펠렛을 Resuspend.
  6. 1 % TAE가있는 겔 전기 영동을 위해 정제 된 DNA의 5 및 10 μL 분취 량을 사용하십시오아가 로스 겔.
    참고 : 성공적인 염색질 전단은 200-1,500 bp DNA 패턴을 초래합니다. 전단이 실패한 경우, 전단 단계 (단계 2.12)의 배양 시간을 5 분, 10 분 및 15 분으로 수정하여 특정 세포에 대한 최적의 전단 조건을 결정합니다.
  7. 나머지 샘플을 사용하여 샘플의 DNA 농도를 분석하십시오. 전단 크로 마틴 샘플에서 DNA 농도를 역 계산 (단계 2.16); immunoprecipitation (섹션 4)에 대한 각 치료 그룹에 대해 동일한 DNA 금액을 사용하십시오.

4. 면역 침전

  1. ChIP 수준의 단백질 G 자성 구슬 25 μL, immunoprecipitation 희석 버퍼 (주식 솔루션 : 0.01 % SDS, 1.1 % 트리톤 X - 100, 16.7 MM의 10 μL)와 가위, crosslinked 염색질 (단계 2.16) 10-25 μg을 결합 Tris-HCl, pH 8.0, 1.2 mM EDTA 및 167 mM NaCl) 및 1 ㎕의 PIC.
  2. 배양 4 시간 후, 1 ~ 10 μg의 항체 (항체 농도항체의 친 화성에 따라 다를 것이다; 처음에는 제조사의 권장 사항에 따라 사용해야하고 필요한 경우 실험적으로 최적화해야 함) 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣고 dH 2 O를 최종 부피 100 μL에 넣으십시오.
    참고 : 직접 immunoprecipitation 방법 대신에 간접 immunoprecipiation 방법 대신에 먼저 항체와 염색질을 결합하여 단백질 G 자성 구슬을 추가하여 사용할 수 있습니다.
  3. 4 ℃에서 4 ~ 12 시간 동안 종단 간 회 전자에서 시료를 배양한다.

5. 용출

  1. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓습니다. 일단 자기 구슬이 튜브의 측면에 응집되면 조심스럽게 제거하고 상등액을 버립니다.
  2. Wash Buffer 1 (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 및 150 mM NaCl) 800 μL로 비즈를 세 번 씻으시오. 튜브를 여러 번 뒤집어서 혼합하십시오. 자성 스탠드 위에 튜브를 놓고자석 비드가 튜브의 측면에서 응집되면 조심스럽게 세척 완충액을 제거하고 폐기하십시오.
  3. Wash Buffer 2 (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 및 500 mM NaCl) 800 μL로 비즈를 한번 씻으십시오. 튜브를 여러 번 뒤집어서 혼합하십시오. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 자석 비드가 튜브의 측면에서 응집되면 조심스럽게 세척 버퍼를 버리고 버립니다.
  4. 용리 버퍼 (1 % SDS와 100 MM NaHCO 3 ) 50 μL에 구슬을 Resuspend하고 RT에서 15 분 동안 엔드 투 엔드 회 전자에 샘플을 품어.
  5. 튜브를 자기 스탠드에 놓고 자석 비드가 튜브 측면에 모이면 상층 액을 새 튜브로 옮깁니다.
  6. 가교 결합을 역전시키기 위해 5 μM NaCl 6 μL를 추가하고 프로 테이나 제 케이 (0.5 μg / μL) 2 μL를 첨가하십시오. 샘플을 혼합 한 후 65 ° C에서 2 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
  7. DNA 정제를 위해 phenol / 클로로포름 추출 12 (단계 3.5) 후 펠렛을 30 μL의 dH 2 O에 재현 탁한다.
    참고 : 시료는 단백질 결합 부위를 직접 분석하거나 (섹션 5) -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.

6. 바인딩 사이트 분석

  1. PCR 또는 qRT-PCR을 사용하여 알려진 핵산 서열 내의 특정 결합 부위에 대한 분석을 수행하십시오. 프라이머 디자인을 위해서는 기존의 PCR 또는 qRT-PCR 프로토콜을 따르십시오. 관심의 단백질 바인딩 사이트 ( 그림 1 )를 교량 150-400 BP amplicon을 합성하는 뇌관을 설계하십시오.
  2. 특이성을 보장하기 위해 4 개의 다른 DNA 템플릿을 사용하여 PCR을 설정합니다 : i) 관심 항체로 면역 침강 된 ChIP의 DNA, ii) 비특이적 IgG 항체로 면역 침전 된 ChIP의 DNA, iii) 입력 DNA 및 iv) 오염을 배제하기 위해 PCR에 대한 음성 대조군. 경로 자극의 경우, immunoprecipitated 단백질의 알려진 바인딩 사이트에 특정 프라이머의 다른 세트를 사용하여 다섯 번째 템플릿을 선택하십시오.
    참고 : c-KIT 리간드 프로모터 분석의 경우 c-KIT 리간드 프로모터 영역 내의 SBE에서 TGF-β 유도 SMAD 결합을 입증하기 위해 기존 PCR을 사용하십시오. 양성 대조군으로, TGF-β 유도 SMAD 결합의 알려진 표적으로 플라스 미노 겐 활성제 억제제 -1 (PAI-1)에 PCR을 수행하십시오.

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Representative Results

동족 수용체 복합체에 대한 TGF-β1 리간드의 결합은 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 - 인산화를 초래하고,이어서 공통 매개체 인 SMAD4와의 결합을 일으킨다. SMAD 복합체는 핵으로 전이합니다. TGF-β는 SMAD가 표적 유전자의 조절 영역 내 SBE에 직접 결합하거나 SMAD가 조절하는 표적 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 자나 억제 자의 표현을 통해 간접적으로 유전자 전사를 조절할 수있다. c-KIT 리간드 SCF가 SMAD2의 직접 프로모터에 대한 TGF-β1 유도 결합에 의해 전사 조절되는지를 시험하기 위해, 우리는 SCF 유전자의 SCF 프로모터를 포함하는 2.4kb, 5 ' SMAD2 결합 모티프, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . 우리는 7 개의 추정 SBEs 업을 확인했습니다.SCF 시작 코돈 ( 그림 1A )의 tream. SCF 프로모터에 대한 SMAD2의 TGF-β1- 유도 된 결합을 확인하기 위해, 여기에 기재된 ChIP 분석을 수행 하였다. TGF-β1 처리는 인간 간암 세포주 HepG2 및 Hep3B 세포에서 SCF 프로모터에 SMAD2가 결합하는 결과를 낳았다 ( 그림 1B ). TGF-β1- 자극이없는 경우, SMAD 결합은 관찰되지 않았다. TGF-β1에 의해 유도 된 SMAD 활성화에 대한 양성 대조군으로서, PAI-1에 대한 ChIP가 수행되었다. PAI-1 프로모터는 TGF-β / SMAD 13 의 알려진 표적입니다. SMAD2 면역 침전의 특이성을 확인하기 위해 비특이적 IgG 항체를 사용 하였다; SBE에 결합하는 SMAD2는 IgG로 면역 침전 후에 관찰되지 않았다.

ChIP 기술의 또 다른 시연을 위해 우리는 STAT3 컨센서스 결합 모티프 5 '에 대한 TGF-β 리간드 유전자의 5'TT (N4) AA-3 '및 5'-TT (N5) AA-3'15. 우리는 위치 -4384 / -4373 (STB-1) 및 -5365 / -5357 (STB-2) ( 도 2A )에서 TGFB 개시 코돈의 상류에 두 개의 상상적인 STAT3 결합 부위를 확인했다. TGF-β1에 의해 유도 된 STAT3의 TGF-β ligand 유전자와의 결합을 확인하기 위해 우리는 TGF-β1 처리 HepG2 및 Hep3B 세포를 사용하여 ChIP 분석을 수행 하였다. TGF-β1 처리는 STAT3가 TGFB 유전자의 두 번째 상상적인 STAT3 결합 부위 (STB-2)에 결합하였으나 첫 번째 것 (STB-1)에는 결합하지 않았다 ( 도 2B ). 이 예에서, STB-2에 양성 STAT3 결합은 내부 양성 대조군으로서 작용한다. 상기 ChIP 실험과 유사하게, IgG를 사용한 면역 침강 후에 STB-2에 결합하는 STAT3은 보이지 않았다.

그림 1
그림 1 ong> : SCF 프로모터에 TGF-β- 유도 SMAD2 결합. ( A ) 시작 코돈과의 상대적인 위치를 가진 박스 (흰 상자 = AGAC)로 표시되는 추정 SBE를 갖는 SCF 프로모터의 도식적 표현. 칩 프라이머 위치는 SCF 개시 코돈 및 PCR 생성물 크기에 대한 상대적 위치와 함께 아래에 제시된다. ( B ) SCF 프로모터에 SMAD2 결합을위한 ChIP. TGF-β1 처리 및 처리하지 않은 HepG2 및 Hep3B 세포의 크로 마틴 - 단백질 복합체를 항 SMAD2 항체로 면역 침전시켰다. PCR은 SCF 특이 적 프라이머를 사용하여 수행 하였다. 왼쪽에는 입력 DNA를 사용한 PCR 결과가 표시됩니다. 중간에 SMAD2 면역 침전 특이성을 확인하기 위해 비 특이성 IgG로 면역 침전시킨 후 PCR 결과를 보여줍니다. 하부 패널에 나타낸 바와 같이, PAI-1 에 대한 SMAD2 결합 용 ChIP를 양성 대조군으로 사용 하였다.ge.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : TGF-β에 의해 ​​유도 된 STAT3의 TGF-β 유전자 결합. ( A ) 시작 코돈에 대한 상대 위치와 함께 회색 박스로 표시 추정 STAT3 바인딩 사이트와 TGF - β 유전자의 도식. 칩 프라이머 위치는 TGF-β 개시 코돈 및 PCR 제품 크기에 대한 상대 위치와 함께 아래에 나타내었다. ( B ) TGF-β1에 의해 유도 된 STAT3가 TGF-β 유전자에 결합하기위한 칩. TGF-β1 처리 및 처리하지 않은 HepG2 및 Hep3B 세포의 크로 마틴 - 단백질 복합체를 항 -STAT3 항체로 면역 침전시켰다. PCR은 TGF-β 특이 적 프라이머를 사용하여 수행 하였다. 왼쪽에는 입력 DNA를 사용한 PCR 결과가 표시됩니다. 중간에, PCR비 특이성 IgG로 면역 침강시킨 결과는 STAT3 면역 침전 특이성의 확인을 위해 나타내었다. 상부 패널은 STAT3 결합 부위 1 (STB-1)에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 결과를 나타내고, 하부 패널은 STAT3 결합 부위 2 (STB-2)에 결합하는 STAT3에 대한 결과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 보고서에서 우리는 c-KIT 리간드 프로모터 내 SBE에 SMAD2의 TGF-β1 유도 된 결합과 TGF-β1 리간드 유전자 내에서 STAT3의 인식 서열에 TGF-β1에 의해 유도 된 결합을 입증했다. 우리는 염색질 면역 침전을 사용하여 두 전사 인자 모두의 사이토 카인 유도 결합을 증명한다.

크로마토 그래피 면역 침전은 DNA에 대한 관심있는 단백질의 직접 결합을 입증하고, DNA에 대한 단백질 결합을 유도하는 자극을 특성화하고, 단백질이 결합하는 DNA 서열을 특성화하는 강력한 도구입니다. 후자의 정보는 관심있는 특정 단백질에 의해 조절되는 유전자의 확인에 도움이 될 수 있으며 ChIP-on-chip, ChIP-seq 또는 복제 전략 7 , 8 , 9 의 사용에 의해 달성된다. ChIP의 주요 장점과 DNA- 단백질 결합을 보여주는 다른 방법 중 하나, 예를 들어 EMSA 나 DNase I 풋 프린팅과 같은 것은 ChIP 기술 에서 생체 내에서 결합이 포획 되는 반면, 다른 것들은 생체 외에서 수행된다는 것입니다. 따라서 ChIP는 세포 내에서 DNA- 단백질 결합에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 기술은 고립 된 시스템을 나타냅니다.

그러나 ChIP 분석은 복잡하며 결과에 영향을 줄 수있는 여러 단계가 필요하며 최적화와 경험이 필요합니다. 성공적인 ChIP를 위해 중요한 첫 번째 단계 중 하나는 교차 결합 단계 (단계 2.2)입니다. UV 가교는 돌이킬 수 없으므로 ChIP에는 적합하지 않습니다. 포름 알데히드 가교 결합이 바람직하지만, 포름 알데히드 농도 및 가교 결합 시간은 모두 염색질 전단 및 항원 침전의 효율에 영향을 줄 수있다. 일반적으로 포름 알데히드 농도 (1 % w / v)가 낮고 가교 시간이 짧다 (5-10 분) 것이 전단 효율을 향상시키기 때문에 바람직합니다. 그러나 포름 알데히드는 효율적이지 않습니다.단백질 - 단백질 가교 결합시에 일어나며 따라서 DNA 16에 직접 결합하지 않는 단백질에 대해서는 차선이다. 이러한 경우, ChIP는 두 단계 접근법으로 수행 될 수 있는데, 먼저 단백질 - 단백질 가교 결합이 글 루타 레이트 디 숙신 이미 딜,이어서 포름 알데하이드 매개 DNA- 단백질 교차 결합과 같은 가교제를 사용하여 수행된다.

다음 중요한 단계는 염색질 전단입니다. 우리의 연구에서, 우리는 micrococcal nuclease를 사용하여 효소 전단을 사용했습니다. 효소 절단은 초음파 처리가 DNA- 단백질 결합을 방해 할 때 비 교차 결합 된 천연 칩 (N-ChIP)에 특히 유용합니다. N-ChIP은 히스톤 및 히스톤 개질제의 분석에 주로 사용됩니다 18 . micrococcal nuclease는 상대적으로 비특이적 인 endo-exonuclease로 간주되지만 서열 특이적인 절단을 유도하는 것으로 나타났습니다 19 . 결과적으로 서열에 따른 바이어스가 발생할 수 있습니다특정 유전자 좌의 과장 표현 20 . 초음파 처리는 서열 바이어스없이 무작위 크기의 DNA 단편을 생성하고 일반적으로 가교 결합 된 칩 (X-ChIP)에 바람직합니다. 그러나 sonication 조건은 각 세포 또는 조직 유형 및 sonicator 모델에 대해 경험적으로 결정되어야하며 결과 DNA 조각은 일반적으로 효소 절단보다 큰 16 입니다. 또한, 샘플의 과도한 초음파 또는 유화는 단백질 변성 및 분해로 인한 항체 에피토프의 손실을 초래할 수있다.

면역 침전 단계는 ChIP의 결과에 큰 영향을 줄 수있는 또 다른 중요한 단계입니다. 아가로 오스 비드는 비특이적으로 DNA에 결합하며, 첨가 된 비드의 수의 변화는 특정 신호 - 배경 비에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 DNA- 단백질 시료에 첨가 할 때 아가로 오스 비드 "슬러리"를 잘 부양하는 것이 중요합니다. 에 사용되는 항체와 관련하여일반적으로 ChIP 급 항체를 사용해야하며 그렇지 않은 경우에는 적어도 면역 침강 급 항체를 선호해야한다. 특정 에피토프는 가교 결합 동안 마스킹 될 수 있기 때문에, 다 클론 항체는 여러 에피토프를 인식하기 때문에 유리하다. 첨가되는 항체의 양은 침전되는 인자를 초과해야하므로 각 인자 / 항체에 대해 실험적으로 결정되어야한다. 또한 항체 결합 평형에 도달하는 동역학이 각 항체마다 다르므로 최적 항온 처리 조건은 각 항체에 대해 결정되어야합니다.

몇 가지 컨트롤을 실험 설정에 포함 할 수 있고 포함시켜야합니다. 특정 DNA- 단백질 결합 반응의 유도가 평가되는 경우 최종 분석 ( 예 : PCR 또는 qRT-PCR)에서 동일한 주형 DNA 양을 나타 내기 위해 입력 DNA 대조군을 포함시키는 것이 중요합니다. 항체 컨트롤이 필요합니다.관심 단백질의 immunoprecipitation의 특이성을 확인합니다. 보통 아이소 타입 일치 면역 글로불린은 음성 대조군으로 적합하지만 아가로 오스 비드도 사용할 수 있습니다. 때때로, 양성 대조군은 ChIP의 기능적 실험 흐름을 확인하는 데 사용되며, 항 히스톤 항체가이 목적으로 자주 사용됩니다. 자극 실험에서, 바람직한 양성 대조군은 자극시 단백질이 결합하는 공지 된 DNA 영역에 대한 후속 서열 분석과 함께 목적 단백질의 면역 침강이다. 우리의 대표 결과에서, PAI-1 프로모터 내의 SBE는 TGF-β1- 유도 된 SMAD 결합에 대한 공지 된 표적으로서 사용되었다. 자극 된 단백질 결합이없는 실험에서 관심 단백질의 표적이되지 않는 것으로 알려진 DNA 서열을 후속 DNA 분석에 사용할 수 있습니다. DNA 분석과 관련하여, 오염을 배제하기 위해 주형 DNA가없는 반응을 포함시키는 것이 중요합니다.

ChIP은 관심있는 단백질이 유전자에 결합하는 것을 직접 입증하는 훌륭한 기술입니다. 그러나 기능적 연구가 아닙니다. 관심있는 단백질이 조절 역할을한다고 생각되는 경우, 리포터 유전자 기반 분석법 ( 예 : 루시퍼 라제)과 같은 기능적 분석법을 수행하는 것이 필수적입니다. 이러한 프로토콜에서, 관심 유전자는 리포터 유전자의 조절 위치에 클로닝된다. 관심 유전자의 유도는 그것이 조절 기능을 가지고있는 경우 리포터 유전자의 발현을 초래한다. 관심있는 특정 단백질의 조절 역할에 대한 추가 확인을 위해, DNA 결합 단백질이 유 전적으로 침묵하는 녹다운 또는 노크 인 세포를 생성 할 수있다. 추가 제어로서, 규제 유전자의 단백질 결합 부위는 돌연변이되어 관심있는 단백질의 결합을 방지 할 수있다. 후자의 두 실험 디자인 중 어느 하나에서, 세포 자극은 마커 g의 발현을 초래하지 않을 것이다ene.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 TX 텍사스 주 MD 앤더슨 암 센터 (Houston, TX) (시작 자금, BB)의 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 cells ATCC HB-8065
Hep3B cells ATCC HB-8064
TGF-β1 R&D Systems 101-B1 Used at a concentration of 10 ng/mL
Anti-SMAD2 antibody Cell Signalling Technology 5339 Amount used/IP: 3 µg
Anti-STAT3 antibody Cell Signalling Technology 4904 Amount used/IP: 3 µg
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads Active Motif 53033
Protease Inhibitor Cocktail Active Motif 37490
Micrococcal Nuclease Cell Signalling Technology 10011
PCR forward primer: PAI-1 Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’
PCR reverse primer: PAI-1 Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’
PCR forward primer: SCF Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ 
PCR reverse primer: SCF Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ 
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ 
PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’    
PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’  

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References

  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81, (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5, (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13, (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3, (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21, (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16, (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19, (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18, (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006, (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94, (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92, (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1, (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9, (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5, (12), 15754 (2010).

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