Метод проверки влияния экологических сигналов на поведение спаривания в
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Мы демонстрируем анализ для анализа экологических и генетических сигналов, влияющих на поведение спаривания в плодовой мушке Drosophila melanogaster .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

На сексуальную активность человека влияет генотип, опыт и условия окружающей среды. Как эти факторы взаимодействуют для модуляции сексуального поведения, остается слабо понимаемым. В Drosophila melanogaster экологические сигналы, такие как доступность продуктов питания, влияют на спаривающую активность, предлагая приемлемую систему для исследования механизмов, модулирующих сексуальное поведение. В D. melanogaster , экологические сигналы часто ощущаются через хемосенсорные вкусовые и обонятельные системы. Здесь мы представляем метод проверки влияния экологических химических сигналов на поведение спаривания. Анализ состоит из небольшой спаривающей арены, содержащей пищевую среду и пару спаривания. Частота спаривания для каждой пары непрерывно контролируется в течение 24 часов. Здесь мы представляем применимость этого анализа для проверки соединений окружающей среды от внешнего источника через систему сжатого воздуха, а также манипуляции с компонентами окружающей среды непосредственно на арене спаривания. УSe системы сжатого воздуха особенно полезна для проверки влияния очень летучих соединений, в то время как манипулирование компонентами непосредственно на арене сопряжения может иметь значение для определения присутствия соединения. Этот анализ может быть адаптирован для ответа на вопросы о влиянии генетических и экологических сигналов на поведение спаривания и плодовитость, а также на другие репродуктивные поведения мужчин и женщин.

Introduction

Репродуктивное поведение обычно имеет высокие затраты на энергию, особенно для женщин, которые производят большие гаметы, чем мужчины, и должны тщательно выбирать условия для воспитания своего развивающегося потомства. Из-за стоимости энергии неудивительно, что воспроизведение связано с питательными условиями. Это справедливо для большинства, если не для всех, животных, включая млекопитающих, чье половое созревание может быть отсрочено вследствие недоедания, а на сексуальный всадник которого может отрицательно сказаться ограничение на питание 1 .

Репродукция генетического модельного организма Drosophila melanogaster также зависит от условий питания. Самцы суда на более высоком уровне в присутствии летучих продуктов 2 , а самки более восприимчивы к сексуальному влечению в присутствии дрожжей, основного питательного вещества для производства яиц и выживаемости потомства 3 , 4 , 5 . ЭтаЭволюционно-консервативная репродуктивная реакция на питание дает возможность изучить механизмы, которые связывают экологическую доступность продуктов питания с половым размножением в генетически приемлемом и экономически эффективном организме. В самом деле, работа в дрозофиле была вовлечена в пути к инсулину в качестве важного регулятора соединения между пищевой и сопрягаемым поведением 6. Он также показал, что сам акт спаривания меняет предпочтение пищи женщин, а также ассоциированные хемосенсорные нейроны 7 , 8 , 9 .

Понятно, что пищевые сигналы влияют на репродуктивное поведение в D. melanogaster . Эти эффекты, по-видимому, в основном затрагивают женщин, особенно тех, кто уже спал 5 . Однако для проверки этих острых последствий условий окружающей среды анализ, классически используемый для женского спаривания, можетНе очень подходят из-за длительных перерывов между эпизодами спаривания. В классическом репарационном анализе девственная женщина впервые встречается с мужчиной и сразу же изолирована и представлена ​​новым мужчиной через 24-48 часов. Этот классический анализ был использован с большим успехом для идентификации компонентов мужского эякулята, которые изменяют поведение женщины и женский отклик 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Таким образом, описанный здесь непрерывный анализ спаривания является дополнением к классическим анализам спаривания, которые могут быть использованы для изучения острого влияния условий окружающей среды на репродуктивное поведение.

Используя непрерывный анализ спаривания, описанный здесь, мы ранее показали, что пара мух, подвергнутых воздействию дрожжей, будет восстанавливатьсяeveral раз в течение 24 - часового периода наблюдения 5, 19, 20, 21, в то время как мухи , не подвергается воздействию пищи будет только один раз Remate 5. Это открытие может быть озадачивающим в свете большой части литературы D. melanogaster, свидетельствующей о том, что самки не рематуются в течение нескольких дней после первоначального спаривания (см. Рекомендации 10 , 11 ). Однако это расхождение легко объясняется условиями анализа, когда женщина изолирована на один-несколько дней, прежде чем будет предоставлена ​​новая возможность спаривания. Если пара не сопряжена в этом часовом периоде наблюдения, самка характеризуется как нечувствительная. Более того, высокая частота спаривания не должна удивлять, учитывая, что данные от пойманных мух мух показывают, что женщины содержат сперму от 4 до 6 мужчин в своих органах хранения; Таким образом, вЧто женщины, естественно, репараты несколько раз 22 , 23 .

Здесь мы демонстрируем использование этого метода непрерывного спаривания, чтобы разгадать, как мухи собираются и объединяют информацию об условиях окружающей среды для модуляции частоты спаривания. Этот анализ позволяет тестировать относительно большое количество спаривающих пар для генетических исследований и проверять влияние летучих и нелетучих экологических сигналов. Анализ обычно проходит в течение 24 часов, но может быть увеличен до 48 часов, что позволяет тестировать циклические экологические сигналы, такие как светло-темный (LD) цикл. Мы демонстрируем этот анализ, проверяя влияние летучих сигналов от культуры дрожжей в воздушной системе под давлением в сочетании с наличием нелетучего питательного вещества дрожжей в пищевом субстрате.

Система сжатого воздуха непрерывно подает волатильные сигналы на сопрягаемую арену, которая содержитСа пищевой субстрат и тестовую пару (чье поведение при поведении контролируется). Чтобы дополнительно определить особенности, с которыми дрожжи влияют на спаривание, мы тестируем основное летучее соединение дрожжей, а именно уксусную кислоту 24 , в сочетании с содержанием аминокислоты, которое соответствует количеству дрожжей в пищевом субстрате, в форме пептона (амино Кислоты, полученные из ферментативного переваривания животных белков). Вместе эти эксперименты демонстрируют, как эффект экологического сигнала на поведение спаривания D. melanogaster можно проверить с помощью этого анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экологически контролируемая соединительная коробка

  1. Чтобы обеспечить контролируемую и легко очищаемую зону тестирования, установите кухонный шкаф из нержавеющей стали размером 120 см х 64 см х 85 см, как показано на рисунке 1А.
    1. Просверлите одно отверстие в задней части шкафа чуть ниже потолка и четыре комплекта из четырех отверстий в стороны, каждый с диаметром 2 см. Просверлите первые два набора из четырех отверстий на каждой стороне коробки на высоте 7 см от нижней части коробки и 12,5 см между отверстиями. Просверлите два других набора на каждой стороне коробки на высоте 35 см от дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Четыре набора из четырех отверстий используются для кабелей питания камеры и насосно-компрессорных труб для входа и выхода из шкафа. Отверстие сзади используется для силовых кабелей световой доски.
    2. Постройте световую доску с восемью рядами из 40 чередующихся белых и красных светодиодов (LED) с пространством 2,5 см между каждым светом. Установите белый и красный светодиоды в циркеT с источником питания. Подключите каждый светодиод последовательно с резистором 560 Ом, 0,25 Вт и 5% -ным допуском.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Длины волн излучения красного света, отслоенного от 590-661 нм с резким пиком при 627 нм. Результирующая интенсивность света в экспериментальной зоне составляет приблизительно 900 люкс с включенным освещением и 90 люкс с включенным только красным светом; Это было измерено с помощью приложения для измерения яркости смартфона.
    3. Прикрепите световую панель к верхней части шкафа из нержавеющей стали и пропустите силовые кабели через отверстие сзади.
    4. Подключите адаптер белых светодиодов к таймеру управления мощностью, чтобы можно было отключить белый светодиод во время темной фазы эксперимента. Подключите адаптер красного света, который летает слепой до 25 , к обычным источникам питания, чтобы держать их на всю продолжительность эксперимента.
    5. Закрепите один металлический кронштейн длиной 110 см и два 54 см, каждый с шириной 0,5 см, с внутренней стороны коробки на высоте 50См от нижней части коробки. Поместите в эти скобки пластину диффузии из матового стекла (размеры 119,0 см х 54,5 см х 0,5 см).
    6. Добавьте три слоя фильтровальной бумаги (120 см x 50 см) между световой доской и стеклянной пластиной, чтобы рассеять свет и ограничить блики на поверхности сопрягаемых аренов (описано в разделе 4). Вставьте два листа бумаги для фильтров вместе на их длинном крае на деревянных стержнях длиной 120 см, используя магниты (сбоку), чтобы приклеить их к внутренностям металлического шкафа; Выполните это действие 3 раза.
    7. Прикрепите четыре вентилятора по бокам коробки, чтобы создать воздушный поток, который непрерывно разъединяет спаренную коробку. Прикрепите первый комплект вентиляторов 8 см между световой доской и стеклянной пластиной, с входом воздуха с левой стороны и выхлопом в правой части коробки, чтобы свести к минимуму нарастание тепла, создаваемого световой доской.
    8. Прикрепите второй комплект вентиляторов 12 см на 25 см выше нижней части шкафа, чтобы создать наружный поток воздуха, который выделяет iNside шкафа и охлаждает его до стабильного 26 ° C. Прикрепите вентиляторы со стороны выхлопных газов к всасывающему шлангу и выведите воздушный поток из помещения, чтобы предотвратить повторное движение воздуха в шкафу.
  2. Настройте две стойки (приблизительно 48 см в высоту), установленные с двумя хомутами, один на 28 см и один на 30 см от основания подставки. Закрепите веб-камеру на каждом зажиме. Подключите 4 камеры к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение для мониторинга.
  3. Разместите листы A4 под каждой веб-камерой. Используйте незапечатанные белые листы или листы с предварительно пронумерованной сеткой 7 на 5 квадратов с осями 4 см для размещения спаривающих арен (описанных в разделе 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Камера веб-камеры HD с широкоугольным углом обзора 78 ° и разрешением 5 миллионов пикселей может охватывать площадь 21 см х 30 см, соответствующую листу формата A4, и монитор от 20 до 35 спаривающих арен.

2. Подъем и сбор мух

  1. Место 20 мужчин и 20 женщин дикого типа Кантон-СВылетает в летающие бутылки для выращивания, содержащие 45 мл богатой мучной пищевой среды (см. Раздел 3) в течение трех-четырех дней. Перенесите тех же взрослых три раза, сначала нажав их вниз, а затем в свежие бутылки.
    1. Поместите бутылки в инкубатор при 25 ° C и 12 часов: 12 часов светло-темного цикла с включенным освещением в 09:00 (время Zeitgeber (ZT) 0). Новое поколение появится примерно через 10 дней.
  2. Анестезируйте полученные недавно закрытые мухи на подушечки для углекислого газа не более 5 минут и соберите их в флаконы для мух с помощью кисти.
    1. Соберите девственных (недавно закрытых) самок и девственных самцов из бутылок из дикого типа Canton-S в 2,5 мл х 9,5 см летающих флаконов с 6,5 мл богатой мучной пищевой среды.
  3. Возраст мух в тех же половых группах по 20 мух каждый в летающих флаконах для выдержки в течение 5-8 дней при 25 ° C и 12 часов: 12 часов светло-темного цикла и загорается в 09:00 (ZT 0).
  4. TransfВылетают на свежие флаконы для выпечки на день перед экспериментом.

3. Подготовка пищевой среды

  1. Подготовьте 1 л богатой среды для мух следующим образом.
    1. Налейте 1 л водопроводной воды в стеклянный стакан емкостью 2 л с магнитной мешалкой и установите стакан на магнитную горячую плиту. Продолжайте перемешивание и включите нагрев до 300 ° C до достижения температуры кипения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В течение длительного времени кипения на следующих этапах доля воды будет испаряться, но вместе с добавленными ингредиентами в этом протоколе получается 1 л богатой среды для мух при приготовлении при комнатной температуре приблизительно 22 ° C.
    2. Включить перемешивание до 500 об. / Мин (об / мин) и добавить следующие ингредиенты в кипящую воду: 10 г агара, 30 г глюкозы, 15 г сахарозы, 15 г кукурузной муки, 10 г зародышей пшеницы, 10 г соевой муки, 30 г Мелассы, 35 г активных сухих дрожжей. Подождите, пока дрожжи будут пены энергично, затем отпустите температуру горячей плитыДо 120 ° C.
    3. Через 10 мин нагревают до 30 ° С и перемешивают до охлаждения до 48 ° С. Контролируйте температуру, вставив термометр непосредственно в пищу.
    4. Растворяют 2 г метилового эфира п-гидроксибензойной кислоты (тегосепт, 100%) в 10 мл 96% этанола. Добавьте это и 5 мл 1 М пропионовой кислоты в смесь. Перемешать в течение 3 мин.
    5. Налейте питательную среду мухи на арены (описанные в разделе 4), чтобы создать слой толщиной 0,3 см на дне арены.
      1. Используйте 200 мл стеклянный стакан для заливки. Когда точные количества важны, используйте 10 мл серологической пипетки.
  2. Подготовьте мутную среду минус дрожжи точно так, как описано на этапе 3.1.1, до 3.1.5, но не оставляйте дрожжи на этапе 3.1.2.
  3. Подготовьте среду с агаром с пептином или без него, смешав 10 г агара и 35 г пептона в 1 л кипящей воды и выполните шаги с 3.1.4 до 3.1.5.

4. MatinG Подготовка к аренде

  1. Проденьте отверстие диаметром приблизительно 0,3 см на верхней стороне пластиковой чашки Петри размером 3,5 см х 1,0 см с использованием нагретой иглы для подготовки (нагретой до покраснения в горелке Бунзена). В качестве альтернативы используйте паяльник.
  2. При приготовлении питательной среды с запахами для приготовления первой пипетки 30 мкл (1% конечной пищевой среды, например, 100% ледяной уксусной кислоты) желаемого соединения в чашку для половины экспериментальных блюд. Оставьте другую половину посуды пустой для сравнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При настройке, описанной здесь, можно одновременно протестировать максимум 140 арен.
  3. Используя 10 мл серологическую пипетку, залейте 3 мл пищевой среды на дно блюда сверху желаемого соединения. Накройте его сырной тканью, чтобы предотвратить загрязнение, и оставьте среду затвердеть приблизительно на 1 час при комнатной температуре.
  4. Поместите крышку на посуду и заклеивайте каждую пленку с двух сторон. Подготовьте небольшие пробки из парафиновой пленки, чтобы покрыть отверстияЧашки путем прокатки кусков парафиновой пленки в рулоны толщиной 0,2 см, а затем разрезают их на 0,5 см сегментов.

5. Дрожжевая культура для запаха

  1. Выращивают сухие активные дрожжи на дрожжевом экстракте пептон-декстрозу (YPD) агар в чашке Петри 14,0 см х 2,06 см. Наденьте перчатки, чтобы предотвратить загрязнение на этом этапе.
    1. Приготовление агаровых пластинок YPD путем добавления 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 22 г глюкозы (0 (+) - глюкозы моногидрата) и 15 г агара (чистый) до 1 л кипящей сверхчистой воды. Нанесите нижнюю часть чашки Петри, когда все растворится и храните вверх дном в холодильнике при 4 ° C на срок до 2 месяцев.
    2. Посыпьте несколько зерен сушеных дрожжей на среднюю пластину YPD, позвольте им раствориться. Затем протрите среднюю пластину, используя стерильную петлю. Храните тарелку в инкубаторе 30 ° C в течение ночи. Затем храните культуру в холодильнике не более 1 недели.
  2. Подготовьте жидкую среду YPD iN 1 л, добавив 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 22 г глюкозы (0 (+) - моногидрат глюкозы) и перемешивающий бар до 1 л сверхчистой воды.
    1. Автоклав в течение 25 мин при 120 ° С и давлении 1 бар. Затем храните бутылки при температуре 4 ° C в течение 2 месяцев до использования.
  3. Установите открытые колпачки (4,5 см) с силиконовой перегородкой толщиной 0,32 см.
    1. Вырежьте два небольших отверстия в перегородке, чтобы плотно прилегать к колючей арматуре. Прикрепите небольшую трубу из поливинила хлорида (ПВХ) (диаметр: внешний 0,8 см и внутренний 0,5 см) к обоим выходам, выходящим из бутылки, и к одному из впускных отверстий, входящих в бутылку. См. Рисунок 1B для иллюстрации.
    2. Оберните установленные колпачки и трубки в алюминиевой фольге и автоклаве в течение 25 минут при 120 ° C и давлении 1 бар.
  4. Наденьте перчатки для защиты от загрязнения на этом этапе. Окуните стерильный наконечник пипетки 100 мкл в одну из колоний дрожжей с пластины агара YPD (dОписанной в 5.1) и отбрасывают в автоклавную бутылку жидкой среды YPD.
    1. Закройте эту бутылку с жидкостной средой YPD с привитой дрожжей, а также контрольную бутылку YPD (дрожжи, не добавленные) с автоклавированными колпачками, установленными с входом и выходом (описанные на шаге 5.3). Поместите обе бутылки на отдельные магнитные пластины и перемешайте со скоростью 100 об / мин при комнатной температуре в течение 24 часов до начала эксперимента, чтобы культура дрожжей увеличивалась.
    2. Соедините входы обеих бутылок, чтобы отделить аквариумные насосы для подачи воздуха в культуру дрожжей. Обязательно подключите выход экспериментальной дрожжевой бутылки к трубе, выпускающей запах дрожжей из экспериментальной комнаты, чтобы предотвратить помехи в эксперименте.

6. Настройка пневматического насоса

  1. Прикрепите большую трубку из ПВХ (диаметр: внешний 1,2 см и внутренний 0,9 см) к источнику сжатого воздуха и проведите его через две 1 л стеклянные колбы Эрленмейера, заполненные активированным углем, до 800 млЧтобы очистить воздух. Используйте либо сжатый воздух, обычно поставляемый в лабораториях в качестве подачи воздуха, либо подсоединяйте трубки к воздушному насосу (здесь использовался сжатый воздух).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Материал трубы следует выбирать на основе химических свойств летучих веществ и проверять на предмет предотвращения прилипания летучих веществ к прокладке трубки (например, политетрафторэтилена, нейлона или нержавеющей стали).
  2. Сделайте два воздушных разделителя из 15 мл пробирки и три 1000 мкл пипетки каждый.
    1. Сделайте три отверстия диаметром ~ 1 см. Сначала сжечь два отверстия, используя нагретую иглу для подготовки (нагретую красным светом в горелке Бунзена), рядом друг с другом чуть ниже крышки трубки 15 мл. Затем сделайте третье отверстие, удалив нижнюю часть трубки.
    2. Приклейте наконечники пипетки 1000 мкл в отверстия с узким концом, направленным наружу. Отрежьте конец наконечников пипетки, чтобы обеспечить больший поток воздуха.
  3. Соедините большую трубку из ПВХ с выходом cЗаполненную углем колбу Эрленмейера до наконечника пипетки в нижней части трубки 15 мл. Добавьте небольшие отверстия для труб из ПВХ в два горизонтальных наконечника пипетки и подведите их к контрольной и экспериментальной бутылке.
  4. Чтобы предотвратить загрязнение среды YPD микроорганизмами, прикрепите небольшую трубу к стерильному фильтру шприца (размер пор 0,45 мкм) с пластмассовым нажимным штекером для перемычки трубки, идущим к фильтру, и винт на пластиковой переборке, выходящий из фильтра. Затем присоедините трубку к входу в бутылку культуры YPD (см. Рисунок 1B ).
  5. Чтобы предотвратить перемещение дрожжей, перемещаемых в воздухе, из культуральной колбы на экспериментальную арену, прикрепите стеклянную трубку (длиной 6,5 см, наружный диаметр = 0,5 см и внутренний диаметр = 0,3 см) к выпускному отверстию каждой бутылки с культурой YPD с использованием небольших трубок. Прикрепите ПВХ-трубку к другой стороне стеклянной трубки и проведите ее по направлению к нижним отверстиям (просверленным с каждой стороны) блока эксперимента.
    1. Заполните трубу стекловолокном и автоклавируйте его перед использованием.
  6. Добавьте еще один 15-миллилитровый трубчатый сплиттер (описанный в разделе 6.2) к маленькой трубе из ПВХ на каждой стороне экспериментальной коробки, чтобы получить две трубки, которые попадают в коробку на обеих сторонах эксперимента (ближе всего к выхлопному потоку воздуха вентилятора, справа) И контрольной стороной (ближе всего к входу воздушного потока вентилятора, слева).
  7. Подготовьте 8x 25 мл серологических пипеток, каждый из которых имеет 10 выходов для одновременного тестирования 80 спаривающих пар, т.е. 40 для каждого состояния воздуха.
    1. Сжечь 10 отверстий диаметром ~ 0,8 см, 2 см друг от друга в пипетке.
    2. Отрежьте внешнюю часть 1 мл шприца в один маленький (2,5 см) и один большой (5 см) выход.
    3. Приклейте эти отверстия в отверстия с помощью горячего клея.
    4. Оберните небольшую полосу пластиковой парафиновой пленки вокруг конца выходов и прикрепите наконечник пипетки объемом 1000 мкл. Диаметр отверстия наконечника составляет 0,1 см. Используйте чистые советы для каждого эксперимента.
    5. Прикрепите две серологические пипетки, используя Т-сплиттер с наружным диаметром ≥ 0,5 см и короткие кусочки небольших труб из ПВХ, к каждому из двух выходов с обеих сторон. Наденьте пипетки на лист белой бумаги (под камерами в стальной коробке).
    6. Используя монитор потока воздуха, установите поток воздуха так, чтобы скорость воздуха на выходе из наконечника пипетки 1000 мкл составляла 0,5 м / с. Это соответствует потоку воздуха 0,0017 л / с на наконечник.

    7. Мониторинг поведения спаривания

    1. Используйте пипетку для рта (как описано в ссылке 26 ), чтобы помещать одну экспериментальную женщину в маленькую чашку Петри (описанную в разделе 4) в 15:00 (ZT 6) и дать ей 1 час для акклиматизации на спаривающую арену.
    2. Настройте экспериментальный блок (описанный в разделе 1) следующим образом:
      1. Включите свет, то есть светодиоды белого света в 12-часовом 12-часовом светло-темном цикле, подключенные к таймеру, который включаетСвет в 09:00 (ZT0) и непрерывные светодиоды красного света, позволяющие контролировать мухи во время темной фазы эксперимента. Включите вентиляторы, чтобы ограничить нагрев шкафа источником света и обеспечить, чтобы избыточные запахи вентилировались вне испытательной зоны.
      2. Подключите камеры веб-камеры к компьютеру и запустите их с помощью программного обеспечения для мониторинга изображения.
      3. Для каждой камеры задайте фокус, яркость и масштабирование программного обеспечения для мониторинга.
        1. Щелкните правой кнопкой мыши на экране камеры, откройте «свойства камеры» и откройте «автоматическую фокусировку». Отрегулируйте «фокус», чтобы уточнить сетку или любые письменные слова на листе бумаги. При необходимости измените «яркость» и «увеличение».
      4. Установите программу программного обеспечения для мониторинга, чтобы захватить 1 изображение каждые 2 минуты. Щелкните правой кнопкой мыши на каждом экране камеры и выберите «изменить камеру», а затем «Действия». Нажмите, чтобы начать действия «При регулярном intErvals "и измените время на« 2 минуты ». Выберите« Take Photo »для выполнения выбранных действий и, наконец, нажмите« ok ».
      5. Щелкните правой кнопкой мыши на каждом экране камеры и выберите «начать мониторинг».
    3. Через 1 ч (при ZT 7) переведите самеца дикого типа в чашку Петри с помощью пипетки для рта, поместите блюдо на листы бумаги формата A4 под камерами веб-камеры и нажмите «начать мониторинг» в течение 24 часов. Для эксперимента с воздушным насосом поместите блюдо таким образом, чтобы выход пипетки был подключен к входному отверстию спаривающейся арены.
    4. Чтобы проанализировать поведение спаривания пары, сделайте следующее.
      1. Выберите и откройте все изображения в программном обеспечении для просмотра изображений и просмотрите их в хронологическом порядке.
      2. Запишите дату, номер эксперимента, номер блюда и время начала в таблицу в той же строке. Возьмите время начала каждой арены с момента ее размещения под веб-сайтомМ камерой. Запишите метку времени с изображений.
      3. Отметьте время начала каждой совокупности в одной строке в таблице. Подсчитайте спаривание как инцидент, когда самец установил самку, а пара остается умеренно неподвижной и в той же позе, по крайней мере, для пяти последовательных кадров (10 мин).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот критерий основан на сообщенной длине спаривания, от 12 до 27 минут в D. melanogaster , и наблюдении, что совокупление 10 минут и более плодородное 27 , 28 .
      4. Подсчитайте количество совокупностей для каждой строки в электронной таблице, чтобы определить частоту спаривания. В качестве альтернативы, вычесть время начала эксперимента с момента первого спаривания для каждой строки в качестве меры спаривания или вычесть время первого спаривания с момента второго спаривания как мера восстановления латентности.
        1. Чтобы вычислить латентность восстановления, убедитесь, чтоОпределить даты первого и второго спаривания как последовательные дни в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
      5. Проанализируйте данные с помощью моделей смешанных эффектов, предполагая нормальное распределение данных и включая дату эксперимента как случайный фактор, используя статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для определения статистической значимости независимых переменных - пищевой среды, Тип воздуха и взаимодействие - как описано выше 5 .
      6. Выберите лучшую объясняющую модель, выполнив обратное устранение несущественных независимых переменных с использованием тестов отношения правдоподобия и связанной с ними информации Akaike. После запуска модели визуально проверьте остатки данных, чтобы подтвердить нормальность. Подтвердите однородность дисперсий, используя тест Levene. В случае неравной однородности, квадрат-корень преобразует данные.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя этот непрерывный анализ, поведение спаривания и частоту спаривания в конкретных условиях, можно определить в экспериментальных условиях окружающей среды. Чтобы контролировать условия окружающей среды, мы превратили кухонный шкаф из нержавеющей стали в испытательную зону с собственным источником света и диффузией, что обеспечивает высокий уровень света и минимальное количество бликов с верхушки спаривающих арен ( рис. 1А ) , Внутренняя испытательная площадка полностью герметизирована нержавеющей сталью и стеклом, что позволяет очищать органические растворители, такие как гексан или этанол. Кроме того, шкаф оснащен отверстиями, которые выступают в качестве впускных отверстий для трубопроводов, принося летучие сигналы из системы сжатого воздуха (см. Рисунки 1A и 1B ). Система сжатого воздуха, настроенная на запахи дрожжей, состоит из воздушного потока, направляемого через жидкую дрожжевую культуру перед тем, как войти в тестовые арены через 4 пипетки сплиттера с10 точек ( рис. 1C ). Вся система герметична и снабжена несколькими фильтрами частиц, как до, так и после входа в дрожжевую культуру, чтобы минимизировать загрязнение путаными запахами ( рисунок 1B ).

Чтобы продемонстрировать использование этого анализа, мы проверили, влияют ли волатильные сигналы от культуры дрожжей на спаривание. Через 24 ч через жидкую дрожжу культивировали пузырек воздуха, а воздуховыпускные отверстия помещали на вход каждой сопряженной арены (см. Рисунок 2А ). Половина спаривающих аренах содержала муку с дрожжами (Пища + дрожжи), а другая половина содержала муку без добавления дрожжей (Пища - дрожжи). У мужчин и женщин дикого типа были обнаружены запахи, исходящие из внешней культуры дрожжей, и была зарегистрирована их частота спаривания. Чтобы определить, какие переменные необходимы для объяснения графических результатов, мы запускали модели смешанных эффектов, включая или исключаяНезависимые переменные пищевой среды, дрожжевой воздух и взаимодействие двух. Данные на рисунке 2B лучше всего представлены моделью, включающей независимые переменные пищевой среды (p = 0,001) и воздуха дрожжей (p = 0,061), но нет объясняющего эффекта взаимодействия. Несмотря на то, что переменная воздуха дрожжей не является существенной в этом полном наборе данных, необходимо объяснить результаты. Анализ воздуха дрожжей, выделенных для пищевой среды, показывает, что спаривающая пара не реагирует на запахи дрожжей, когда в пищевой среде нет дрожжей (воздух: p = 0,992), но они увеличивают частоту их спаривания в дрожжевом воздухе, когда дрожжи Также добавляется в пищевую среду (воздух: p = 0,018). Вместе эти результаты демонстрируют применимость системы сжатого воздуха для проверки влияния запахов окружающей среды в сочетании с условиями пищевой среды.

Мы также иллюстрируем, как воздушная система под давлением может бытьЗа счет добавления экологических химических сигналов непосредственно на тестовую арену. Чтобы продемонстрировать, какие конкретные дрожжевые соединения влияют на частоту спаривания, мы проверили гипотезу о том, что содержание аминокислот в дрожжах необходимо для его влияния на спаривание путем размещения дозы пептона (гидролизованных белков), соответствующей аминокислотам, подаваемым дрожжами в агаре Подложка, выстилающая спаривающую арену. Мы также испытали необходимость уксусной кислоты, одного из основных летучих продуктов брожения дрожжей, для увеличения частоты спаривания. Это было сделано путем добавления уксусной кислоты непосредственно к пищевой среде. Самцов и самцов дикого типа испытывали на аренах, содержащих агар или агар с пептоном, с уксусной кислотой или без нее непосредственно в пищевой среде ( фиг. 3В ). Это создает очень простую пищевую среду и плохую среду; Поэтому средняя частота спаривания также уменьшается по сравнению с рисунком 2B. Данные на рисунке 3B лучше всего представлены моделью, включающейНезависимые переменные пищевой среды (p = 0,002), воздух уксусной кислоты (p = 0,001) и взаимодействие двух (p = 0,022). Восприимчивость женщин возрастает при наличии уксусной кислоты, но только в том состоянии, в котором пептон присутствует в среде. Это показывает, что мухам необходимо одновременно ощущать аминокислоты и уксусную кислоту, чтобы увеличить их частоту спаривания ( рис. 3B ). Это демонстрирует, что добавление пахучих соединений непосредственно на тестовую арену может влиять на поведение спаривания и что эти воздействия могут быть обнаружены в очень простых условиях окружающей среды.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема экспериментальной коробки и системы сжатого воздуха с дрожжами. ( A ) Схематическая иллюстрация защищаемого от окружающей среды спаривания, описанного в разделе 1. Описание аннотированных чисел и стрелок: 1. световая доска с al Красные огни; 2. небольшой вентилятор; 3. 3 слоя фильтровальной бумаги, каждый слой состоит из двух листов фильтровальной бумаги; 4. стеклянная диффузионная пластина, опирающаяся на кронштейны, прикрепленные к 3 сторонам коробки; 5. большой вентилятор; 6. отверстия для труб и кабелей; 7. экспериментальная область; Большая стрелка, 50 см до стеклянной пластины; Средняя стрелка, высота 35 см для кабельных отверстий; И маленькая стрелка, высота 7 см для отверстий для труб. ( B ) Схематическое изображение жидкой дрожжевой культуры с воздушным потоком, как описано в разделах 5, 6.4 и 6.5. Описание аннотированных номеров: 1. одноразовый фильтр; 2. колпачок с силиконовой перегородкой и выходными отверстиями; 3. жидкая среда; И 4. стеклянную трубку со стекловолокном. ( C ) Схематическая иллюстрация воздуховодов, как описано в разделе 6.7. Описание аннотированных номеров: 1. серологическая пипетка; 2. Трубка вырезается из 1 мл шприца и 3. 1000 мкл наконечника пипетки.Target = "_ blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Запах дрожжей увеличивает восприимчивость женщин в присутствии дрожжей в пищевом субстрате. ( A ) Схематическая иллюстрация сопряженной арены с одной охватывающей и одной самкой и наконечником пипетки от выпускного отверстия для воздуха на фиг. 1C, поступающим через входное отверстие. ( B ) Графическое представление реакции при частоте спаривания пары спаривания Canton-S с запахом дрожжей с дрожжами и без дрожжей в питательной среде для мух (Пища - дрожжи: средний воздух n = 12, дрожжевой воздух n = 13 и пища + дрожжи : Средний воздух n = 24, воздух дрожжей n = 23). Линейный график с ошибками SEM и статистический вывод моделей смешанных эффектов с воздухом как независимая переменная и дата как случайная величина для каждой пищевой среды независимо. Основная статистикаL модель включает пищу (p = 0,001) и воздух дрожжей (p = 0,061). Адаптировано из ссылки 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Уксусная кислота в мухомолекулярном субстрате повышает восприимчивость женщин в присутствии пептона. ( A ) Схематическая иллюстрация сопряженной арены с мухомольной пищевой средой, содержащей уксусную кислоту, и пластиковой пробкой из парафиновой пленки, закрывающей входное отверстие. ( B ) Графическое представление частоты спаривания пары спаривания Canton-S в ответ на уксусную кислоту либо на агаровой, либо пептонной среде (агар: уксусная кислота n = 52, + уксусная кислота n = 40 и пептон: -уксусная кислота N = 28, + уксусная кислота = 25). График строк с ошибками SEM и stati(P = 0,002), воздух уксусной кислоты (p = 0,001) и пищевой воздух (p = 0,022) в качестве независимых переменных и дату как случайную величину. Адаптировано из ссылки 5 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает анализ для проверки поведения спаривания в течение 24 часов, непрерывно контролируя экологические сигналы, которые гипотетическая пара предполагает использовать для определения частоты спаривания. Можно увеличить частоту спаривания в ответ на воздух дрожжей, подаваемый через систему сжатого воздуха, когда среда содержит дрожжи ( рис. 2B ). Кроме того, аналогичный ответ на частоту спаривания можно наблюдать с помощью упрощенной пищевой среды, содержащей только агар, пептон и уксусную кислоту непосредственно в среде ( фиг. 3В )

В экспериментах, продемонстрированных здесь, можно сделать выводы только об общем спаривании пары, поскольку оба пола подвергаются воздействию одних и тех же условий окружающей среды. Однако из предыдущих исследований мы знаем, что 47% вариации частоты спаривания определяется самкой, тогда как мужской вклад составляет только 11% вариации20 . Поэтому большинство изменений наблюдаемой частоты спаривания, вероятно, являются результатом сексуальной восприимчивости женщин. Увеличение ухаживания мужчин по-прежнему оставляет женщину принимать или отклонять спаривание, так как взрослые самки D. melanogaster могут успешно отклонять попытки спаривания 29 . Для твердых выводов и для специфического различия различий в частоте спаривания с женской сексуальной восприимчивостью необходимо протестировать дополнительные спаривающиеся пары, где генотип самки варьируется, а у мужчин - постоянный.

Этот протокол продемонстрировал два способа доставки пахучих соединений в пару спаривания либо с помощью системы сжатого воздуха, либо непосредственно в пищевую среду. Система сжатого воздуха имеет то преимущество, что любой эффект может быть отнесен к соединениям, которые поступают через воздух, в то время как это невозможно сделать, когда соединения помещаются непосредственно в пищевую среду. С другой стороны, wНе обнаружено никакого эффекта в системе сжатого воздуха, это автоматически не означает, что кий не влияет на поведение. Это также может означать, что соединение не эффективно доставляется через систему сжатого воздуха. Состав воздуха на выходе из системы подачи воздуха может быть проанализирован путем размещения углеводородного фильтра и анализа содержания захваченного воздуха с газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией. Система сжатого воздуха является хорошим анализом для испытаний соединений, которые могут быть легко перемещены в воздухе в течение длительного времени. Меньше летучих соединений, возможно, придется вводить непосредственно в пищевую среду. Другим недостатком системы сжатого воздуха является то, что скорость воздушного потока может влиять на поведение на лету. Мухи прекращают движение, когда скорость воздуха слишком высока (выше 0,7-1,6 м / с) 30 . Кроме того, система сжатого воздуха может сделать невысокую непринужденную среду низкого качества путем высыхания пищевой среды. В обоих случаях мухи могут не быть первымиOrm одинаково хорошо, и тогда никакие выводы не могут быть отнесены к тестируемым конкретным соединениям.

При подготовке к оптимальному использованию этих анализов необходимы несколько этапов. Первым шагом, требующим внимания, является подготовка среды. Важно, чтобы среда, включая пахучие летучие соединения, такие как уксусная кислота, была приготовлена ​​в день эксперимента и не раньше, чтобы избежать испарения. Кроме того, среда должна затвердевать на поверхности без дополнительного воздушного потока (избегайте использования вытяжных шкафов для этого), поскольку воздушный поток может стимулировать испарение запаха. Второй шаг, требующий особого внимания, - создание системы сжатого воздуха. Воздушный поток должен быть достаточно высоким, чтобы осторожно пузырить культуру дрожжей без переноса жидкости на арену.

Этот протокол демонстрирует поведенческий анализ с запахами дрожжей в сочетании с поведением спаривания. Однако эта система может применяться к любымТип запаха, а также другие типы поведения. Чтобы использовать эту систему для других запахов, необходимо отрегулировать поток воздуха и запаха, чтобы оптимизировать перенос соединений в посуду. Однако, как правило, любое соединение, которое может переноситься воздухом, может быть проверено с помощью этой системы. Кроме того, любой тип поведения, как у мужчин, так и у женщин, может быть проверен либо с использованием тарелок того же типа, либо путем регулировки трубки для достижения и подключения к более крупным или меньшим участкам тестирования. Кроме того, при тестировании более подробного поведения частоты кадров и разрешения используемых камер необходимо пересмотреть. В любом случае, если оба эксперимента с пробным запахом и без него выполняются одновременно и с одним и тем же источником воздуха, любой ответ на экологический сигнал может быть обнаружен независимо от изменений давления или концентрации от одного эксперимента к другому. Наконец, анализ, продемонстрированный здесь, может быть расширен для, по меньшей мере, еще одного цикла LD (до 48 часов), если fOod поставка не высыхает.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

Acknowledgements

Мы благодарим Bloomington Drosophila Stock Center за запасы мух; C. Gahr, JT Alkema и S. van Hasselt за их раннюю попытку разработать анализ сжатого воздуха; Джаспер Босман за советом по выращиванию дрожжей; И Rezza Azanchi и Joel Levine для первоначального развития временного мониторинга поведения спаривания Drosophila . JA Gorter поддерживалась грантом программы выпускников BCN / NWO по исследованиям Neuroscience Research School. Эта работа была частично поддержана голландской организацией по научным исследованиям (NWO) (ссылка: 821.02.020) JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42, (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23, (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278, (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25, (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14, (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56, (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100, (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3, (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451, (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61, (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61, (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280, (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279, (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79, (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26, (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011, (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155, (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276, (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84, (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457, (7235), 201-205 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics