En metode til at teste effekten af ​​miljøvinkler på parringsadfærd i
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi demonstrerer en analyse for at analysere de miljømæssige og genetiske signaler, der påvirker parringsadfærd i frugtfly Drosophila melanogaster .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gorter, J. A., Billeter, J. C. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En persons seksuelle drev påvirkes af genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorer interagerer med at modulere seksuel adfærd forbliver dårligt forstået. I Drosophila melanogaster påvirker miljømæssige signaler, såsom fødevaretilgængelighed, parringsaktivitet, der tilbyder et traktabelt system til at undersøge mekanismerne, der modulerer seksuel adfærd. I D. melanogaster registreres miljømærker ofte via kemosensoriske gustatoriske og olfaktoriske systemer. Her præsenterer vi en metode til at teste virkningen af ​​miljømæssige kemiske tegn på parringsadfærd. Assayet består af en lille parringsarena indeholdende madmedium og parringpar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåges kontinuerligt i 24 timer. Her præsenterer vi anvendeligheden af ​​dette assay for at teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gennem et trykluftsystem samt manipulering af miljøkomponenterne direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykluftsystem er især nyttigt til at teste virkningen af ​​meget flygtige forbindelser, mens manipulering af komponenter direkte i parringsarenaen kan være af værdi for at fastslå en forbindelses tilstedeværelse. Dette assay kan tilpasses til at svare på spørgsmål om indflydelse af genetiske og miljømæssige tegn på parringsadfærd og fecundity samt andre reproduktive adfærd hos mænd og kvinder.

Introduction

Reproduktiv adfærd har typisk høje energikostnader, især for kvinder, der producerer større gameter end mænd og skal omhyggeligt vælge vilkårene for at hæve deres udviklende afkom. På grund af energikostnaden er det ikke overraskende, at reproduktion er forbundet med ernæringsmæssige forhold. Dette gælder i de fleste, om ikke alle, dyr, herunder pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes af underernæring, og hvis seksuelle drev kan blive negativt påvirket af fødevarebegrænsning 1 .

Reproduktionen af ​​den genetiske modelorganisme Drosophila melanogaster påvirkes også af næringsbetingelser. Haner domstol på højere niveau i nærværelse af fødevarer flygtige 2 , og kvinder er mere seksuelt modtagelige i nærværelse af gær, et vigtigt næringsstof til ægproduktion og afkom overlevelse 3 , 4 , 5 . Det herEvolutionært konserveret reproduktivt respons på mad giver mulighed for at studere mekanismer, der forbinder miljøtilgængeligheden til seksuel reproduktion i en genetisk tålelig og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbejdet i D. melanogaster impliceret insulinvejen som en vigtig regulator for forbindelsen mellem mad og parringsadfærd 6 . Det har også vist, at handlingen med parring selv ændrer kvindens madpræference såvel som de tilhørende kemosensoriske neuroner 7 , 8 , 9 .

Det er klart, at fødevaresignaler påvirker reproduktive adfærd i D. melanogaster . Disse virkninger synes primært at påvirke kvinder, især dem, der allerede har parret 5 . For at teste disse akutte virkninger af miljømæssige forhold kan analysen klassisk anvendt til kvindelig parringsadfærd dogIkke meget passende på grund af de lange afbrydelser mellem parringspisoder. I den klassiske remitterende analyse mødes en jomfru kvinde først med en mand, og isoleres straks og præsenteres med en ny mand 24 til 48 timer senere. Dette klassiske assay er blevet anvendt med stor succes til at identificere komponenter af det mandlige ejakulat, der ændrer den kvindelige opførsel og kvindespørgsmålet 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalyse demonstreret her er derfor en tilføjelse til klassiske parringsanalyser, der kan anvendes til at studere den akutte virkning af miljømæssige forhold på reproduktionsadfærd.

Ved hjælp af det kontinuerlige assay for parringsadfærd, der forklares her, viste vi tidligere, at et par fluer udsat for gær vil remate sEveral gange over en 24 timers observationsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke udsættes for mad, vil kun remate en gang 5 . Denne opdagelse kan være uoverskuelig i lyset af en stor del af D. melanogaster litteraturen, der tyder på, at kvinder ikke remitterer i flere dage efter en indledende parring (gennemgået i henvisninger 10 , 11 ). Denne uoverensstemmelse kan dog let forklares ved analysevilkår, hvor en kvinde er isoleret i en til flere dage, før der gives en ny parring mulighed. Hvis parret ikke parrer i denne times lange observationsperiode, er kvinden karakteriseret som ikke modtagelig. Desuden bør den høje parringsfrekvens ikke være overraskende, da dataene fra vildefangne ​​fluer viser, at kvinder indeholder sæd fra 4 til 6 mænd i deres opbevaringsorganer; Således iDicere, at kvinder normalt afholder flere gange 22 , 23 .

Her demonstrerer vi brugen af ​​denne kontinuerlige parringsanalyse for at ophæve, hvordan fluer samler og kombinerer information om miljøforhold for at modulere parringsfrekvens. Dette assay gør det muligt for en at teste et relativt stort antal parringspar til genetiske undersøgelser og for at teste indflydelsen af ​​flygtige og ikke-flygtige miljøindikatorer. Assayet løber typisk i 24 timer, men kan forlænges til 48 timer, hvilket muliggør afprøvning af cykliske miljøindikatorer, såsom den lysmørke (LD) cyklus. Vi demonstrerer denne analyse ved at teste indflydelsen af ​​flygtige signaler fra en gærkultur i et trykluftsystem i kombination med tilgængeligheden af ​​ikke-flygtigt gærnæringsstof i fødevaresubstratet.

Trykluftsystemet pumper kontinuerligt flygtige signaler ind i en parringsarena, der indeholderEt fødevaresubstrat og et testpar (hvis parringsadfærd overvåges). For yderligere at bestemme de særlige forhold, hvorigennem gær påvirker parring, tester vi en større flygtig forbindelse af gær, nemlig eddikesyre 24 , i kombination med et aminosyreindhold, der svarer til gærets i fødevaresubstratet i form af pepton (amino Syrer afledt af enzymatisk fordøjelse af animalske proteiner). Sammen viser disse eksperimenter, hvordan effekten af ​​miljøindikatorer på D. melanogasters parringsadfærd kan testes med dette assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Miljøstyret parringsboks

  1. For at sikre et kontrolleret og let at rengøre testområde skal du oprette et køkkenskab af rustfrit stål på 120 cm x 64 cm x 85 cm som vist i figur 1A.
    1. Bor et hul bag på kabinettet lige under loftet og fire sæt med fire huller i siderne, hver med en diameter på 2 cm. Bor de to første sæt med fire huller på hver side af kassen i en højde på 7 cm fra bunden af ​​kassen og med 12,5 cm mellem hullerne. Bor de to andre sæt på hver side af kassen i en højde på 35 cm fra bunden.
      BEMÆRK: De fire sæt med fire huller bruges til kamerakraftkabler og luftpumpe rør til at komme ind og ud af kabinettet. Hullet på bagsiden bruges til strømkablerne i et lyskort.
    2. Byg et lyskort med 18 rækker af 40 alternerende hvide og røde lysdioder (LED) med 2,5 cm mellemrum mellem hvert lys. Montér de hvide og røde LED'er i en cirkulærT med strømforsyning. Tilslut hver LED i serie med en modstand på 560 Ω, 0,25 W og 5% tolerance.
      BEMÆRK: Emissionsbølgelængderne på det røde lys spændte fra 590-661 nm med en skarp top ved 627 nm. Den resulterende lysintensitet i forsøgsområdet er ca. 900 lux med både lys på og 90 lux med kun de røde lyser på; Dette blev målt ved hjælp af en smartphone light meter app.
    3. Fastgør lyspladen til toppen af ​​kabinettet i rustfrit stål og send strømkablerne gennem hullet bagpå.
    4. Tilslut adapteren fra de hvide LED'er til en strømstyringstimer for at tillade at slukke for den hvide LED i den mørke fase af eksperimentet. Tilslut adapteren til det røde lys, hvilke fluer er blinde til 25 , til en almindelig strømforsyning for at holde dem på i hele eksperimentets varighed.
    5. Fix en 110 cm og to 54 cm lange metalbeslag, hver med en bredde på 0,5 cm, til indersiden af ​​kassen i en højde 50Cm fra bunden af ​​kassen. Placer en frostet glasdiffusionsplade (dimensioner på 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) på disse beslag.
    6. Tilføj tre lag filterpapir (120 cm x 50 cm) imellem lyspladen og glaspladen for at diffundere lyset og begrænse blænding på overfladen af ​​parringsarenaerne (beskrevet i afsnit 4). Pin to filterpapir sammen på deres lange kant på 120 cm lange træstænger ved hjælp af magneter (på siden) for at holde dem på indersiden af ​​metalskabet; Udfør denne handling 3 gange.
    7. Vedhæft fire fans på siderne af kassen for at skabe en luftstrøm, der kontinuerligt ventilerer parringskassen. Vedhæft det første sæt 8 cm ventilatorer mellem lyspladen og glaspladen med luftindgangen til venstre og udstødningen på højre side af kassen for at minimere opbygningen af ​​varme fra lyspladen.
    8. Vedhæft det andet sæt 12 cm fans 25 cm over bunden af ​​kabinettet for at skabe et udadgående luftstrøm, der ventilerer iNside af kabinettet og afkøler den til en stabil 26 ° C. Fastgør ventilatorerne ved udstødningssiden til en sugeslange og før luftstrømmen ud af rummet for at forhindre genbrug af luften i kabinettet.
  2. Opsæt to stande (ca. 48 cm høje) monteret med to klemmer, en på 28 cm og en på 30 cm fra bunden af ​​stativet. Fix et webcam på hver af klemmerne. Tilslut de 4 kameraer til en computer, der kører overvågningssoftware.
  3. Placer A4 ark under hvert webcam. Brug uprintede hvide ark eller plader med prænummer nummer på 7 til 5 firkanter med 4 cm akser for at rumme parringsarealer (beskrevet i afsnit 4).
    BEMÆRK: Et HD webcam kamera med 78 ° vidvinkel visning og 5 millioner pixel opløsning kan dække et område på 21 cm x 30 cm svarende til et A4 ark og skærm mellem 20 og 35 parringsarenaer.

2. Flybearbejdning og indsamling

  1. Placer 20 mandlige og 20 kvindelige vildtype Canton-SFlyver i flyveopdrætflasker indeholdende 45 ml rige flyvefødemedium (se afsnit 3) i tre til fire dage. Overfør de samme voksne tre gange ved først at trykke dem ned og derefter i friske flasker.
    1. Anbring flaskerne i en inkubator ved 25 ° C og 12 timer: 12 timer lys mørk cyklus med lys på kl. 09.00 (Zeitgeber tid (ZT) 0). En ny generation vil blive vist omkring 10 dage senere.
  2. Bedøves de resulterende, nyligt lukkede fluer på kuldioxidpuder i ikke mere end 5 minutter, og saml dem i flydende hætteglas med en pensel.
    1. Saml jomfru (nyligt afsondret) kvinder og jomfruer fra de vildtype Canton-S- flasker i 2,5 cm x 9,5 cm flydende opbevaringshætteglas med 6,5 ml rich fly-fødevaremedium.
  3. Alder flyver i samme køn grupper på 20 flyver hver i flyveopdrækshætteglas i 5 til 8 dage ved 25 ° C og 12 timer: 12 timer lys mørk cyklus og lyser kl 09:00 (ZT 0).
  4. TransEr fluerne til frisk flyopdræt hætteglas dagen før forsøget.

3. Madmedieforberedelse

  1. Forbered 1 l rige flymedium som følger.
    1. Hæld 1 l ledningsvand i et 2 L glasbægre med en magnetisk omrøringsbjælke og læg bægeret på en magnetisk varmeplade. Hold omrøringen af ​​og drej opvarmningen op til 300 ° C, indtil kogetemperaturen er nået.
      BEMÆRK: Under den lange kogningstid i de følgende trin vil en del vand fordampe, men sammen med de tilsatte ingredienser resulterer denne protokol i 1 liter rige flymedium, når det fremstilles ved stuetemperatur på ca. 22 ° C.
    2. Tilsæt omrøringen til 500 runder pr. Minut (o / min) og tilsæt kogevandet de følgende ingredienser: 10 g agar, 30 g glucose, 15 g saccharose, 15 g majsmel, 10 g hvedekim, 10 g sojamel, 30 g Melasse, 35 g aktiv tør gær. Vent til gæren skum kraftigt, og drej derefter varmepladen tempEratur til 120 ° C.
    3. Efter 10 minutter drejes varmepladen ned til 30 ° C, og blandingen omrøres, indtil den afkøles til 48 ° C. Overvåg temperatur ved at indsætte et termometer direkte i fødevaren.
    4. Opløs 2 g p-hydroxybenzoesyremethylester (tegosept, 100%) i 10 ml 96% ethanol. Tilsæt dette og 5 ml 1 M propionsyre til blandingen. Rør i 3 min.
    5. Hæld flymidlet til arenaerne (beskrevet i afsnit 4) for at skabe et 0,3 cm tykt lag i bunden af ​​arenaen.
      1. Brug et 200 ml glasbægre til hældning. Når nøjagtige mængder er vigtige, brug en 10 ml serologisk pipette.
  2. Forbered flymedium minus gær nøjagtigt som beskrevet i trin 3.1.1 til 3.1.5, men udlad gæren i trin 3.1.2.
  3. Forbered medium med agar med eller uden pepton ved at blande 10 g agar og 35 g pepton i 1 liter kogende vand og udfør trin 3.1.4 til 3.1.5.

4. MatinG Arena forberedelse

  1. Pierce et hul ca. 0,3 cm i diameter på oversiden af ​​en 3,5 cm x 1,0 cm plast petriskål ved hjælp af en opvarmet præparationsnål (opvarmet til rødhed i en Bunsen-brænder). Alternativt kan du bruge et loddejern.
  2. Ved tilberedning af fødevaremedium med lugtforbindelser, første pipette 30 μl (1% af det endelige fødevaremedium, f.eks. Eddikesyreglacial 100%) af den ønskede forbindelse i skålen til halvdelen af ​​de eksperimentelle retter. Lad den anden halvdel af opvasken stå til sammenligning.
    BEMÆRK: Med opsætningen beskrevet her kan maksimalt 140 arenaer testes på én gang.
  3. Brug en 10 ml serologisk pipette, hæld 3 ml fødevaremedium i bunden af ​​skålen oven på den ønskede forbindelse. Dæk det med en ost klud for at forhindre forurening, og lad mediet stivne i ca. 1 time ved stuetemperatur.
  4. Læg et låg på tallerkenen og bånd hver lukket på to sider. Forbered små paraffinfilmstik til at dække hullerne iSkålene ved rullende stykker paraffinfilm i 0,2 cm tykke ruller og skær dem derefter i 0,5 cm segmenter.

5. Gærkultur til lugt

  1. Voks tør aktiv gær på gær ekstrakt pepton dextrose (YPD) agar i en 14,0 cm x 2,06 cm petriskål. Brug handsker for at forhindre forurening i dette trin.
    1. Forbered YPD agarplader ved at tilsætte 10 g gær ekstrakt, 20 g pepton, 22 g glucose (0 (+) - glucose monohydrat) og 15 g agar (ren) til 1 liter kogende ultrapure vand. Lav bunden af ​​Petri-skålen, når alt er opløst og opbevares på hovedet i køleskabet ved 4 ° C i op til 2 måneder.
    2. Drys nogle få korn af tørret gær på en YPD-mediumplade, lad dem opløse. Strik derefter mellempladen ved hjælp af en steril løkke. Opbevar pladen i en 30 ° C inkubator natten over. Bagefter opbevares kulturen i køleskabet i højst 1 uge.
  2. Forbered YPD flydende medium iN 1 L flasker ved at tilsætte 10 g gær ekstrakt, 20 g pepton, 22 g glucose (0 (+) - glucose monohydrat) og en omrøringsbjælke til 1 liter ultrabærende vand.
    1. Autoklav i 25 minutter ved 120 ° C og 1 bar tryk. Herefter opbevares flaskerne ved 4 ° C i op til 2 måneder indtil brug.
  3. Monter åbne flaskehætter (4,5 cm) med en 0,32 cm tykt silikonseptum.
    1. Skær to små huller i septumet til nøjagtigt tilpasning af tærskelbeslag. Vedhæft den lille polyvinylchlorid (PVC) rør (diametre: yderste 0,8 cm og indvendig 0,5 cm) til begge udløb, der afslutter flasken og til kun en af ​​indløbene, der kommer ind i flasken. Se figur 1B for illustration.
    2. Pak de monterede kapper og slanger i aluminiumsfolie og autoklav i 25 minutter ved 120 ° C og 1 bar tryk.
  4. Brug handsker til at beskytte mod forurening i dette trin. Dip en steril 100 μl pipettip i en af ​​gærkolonierne fra YPD agarpladen (dEscribed i 5.1) og slip det i den autoklaverede YPD flydende medium flaske.
    1. Læg denne gær-inokulerede YPD-flydende mediumflaske samt en YPD-mediumkontrolflaske (ikke tilsat gær) med autoklaverede hætter monteret med in- og udløb (beskrevet i trin 5.3). Sæt begge flasker på separate magnetiske plader og omrør ved 100 omdr./min. Ved stuetemperatur i 24 timer før forsøgets start for at tillade gærkulturen at vokse.
    2. Tilslut indløbene på begge flasker til at adskille akvariepumper for at give luft til gærkulturen. Sørg for at forbinde udgangen af ​​den eksperimentelle gærflaske til et rør, der udluftning af gærluften ud af forsøgsrummet for at forhindre indblanding i eksperimentet.

6. Luftpumpeopsætning

  1. Fastgør den store PVC-rør (diametre: ydre 1,2 cm og indvendig 0,9 cm) til trykluftforsyning og før det gennem to 1 L glas Erlenmeyer-kolber fyldt med aktivt kul til 800 mlLinje for at rense luften. Brug enten trykluft, der almindeligvis leveres i laboratorier som luftforsyning, eller forbind rørene til en luftpumpe (trykluft blev brugt her).
    BEMÆRK: Slangematerialet bør vælges ud fra de flygtige kemiske egenskaber og testes for at forhindre, at flygtige klæber til slangenes foring (f.eks. Polytetrafluorethylen, nylon eller rustfrit stål).
  2. Lav to luftklyvere fra 15 ml rør og tre 1000 μL pipettespidser hver.
    1. Lav tre huller med en diameter på 1 cm. Først skal du brænde to huller ved hjælp af en opvarmet forberedelsesnål (opvarmet rød i en Bunsen-brænder), der støder op til hinanden lige under låget på 15 ml rør. Derefter gør det tredje hul ved at fjerne bunden af ​​røret.
    2. Lim 1 000 μL pipettespidserne ind i hullerne med den smalle ende pegende udad. Skær enden af ​​pipettespidserne for at give større luftgennemstrømning.
  3. Tilslut det store PVC-rør fra udløbet af cKol-fyldt Erlenmeyer-kolbe til pipettespidsen i bunden af ​​15 ml rør. Tilsæt små PVC-rørudløb til de to vandrette pipettespidser og før dem hen mod en kontrol og en eksperimentel flaske.
  4. For at forhindre forurening af YPD-mediet med mikroorganismer skal du sætte det lille rør til et sterilt sprøjtefilter (0,45 μm porestørrelse) med en plastik på skubbeforbindelsen, der går mod filteret, og en skrue på plastikstikket, der forlader filtret. Derefter fastgør slangen til indgangen til YPD-kulturflasken (se figur 1B ).
  5. For at forhindre luftbåren gær fra at rejse fra kulturflasken til forsøgsarenaen, skal du vedlægge et glasrør (6,5 cm lang, ydre diameter = 0,5 cm og indvendig diameter = 0,3 cm) til udgangen af ​​hver YPD-kulturflaske ved hjælp af små rør. Fastgør PVC-rør til den anden side af glasrøret og før dette mod de nederste huller (boret på hver side) af forsøgsboksen.
    1. Fyld røret med glasfiber og autoklaver det før brug.
  6. Tilsæt en anden 15 ml rørdeler (beskrevet i afsnit 6.2) til den lille PVC-rør på hver side af forsøgsboksen for at få to rør, der løber ind i kassen på begge forsøgssiden (nærmest udstødning af ventilatorluftstrømmen til højre) Og kontrolsiden (tættest på indløb af ventilatorluftstrømmen, venstre).
  7. Forbered 8x 25 ml serologiske pipetter hver med 10 udløb for at teste 80 parringspar på samme tid, dvs. 40 for hver klimaanlæg.
    1. Brænd 10 huller med en diameter på 0,8 cm, 2 cm fra hinanden ind i pipetten.
    2. Skær den ydre del af en 1 ml sprøjte i en lille (2,5 cm) og en stor (5 cm) udgang.
    3. Lim disse udløb i hullerne med varm lim.
    4. Sæt et lille bånd af plastisk paraffinfilm rundt om afslutningerne og sæt en 1000 μL pipettespids fast. Spidsåbningens diameter er 0,1 cm. Brug rene tips til hvert eksperiment.
    5. Vedhæft to serologiske pipetter ved hjælp af en T-splitter med ydre diameter ≥0,5 cm og korte stykker små PVC-rør til hver af de to udgange på begge sider. Tape pipetterne fladt på hvidpapirarket (under kameraerne i stålkassen).
    6. Ved hjælp af en luftstrømskærm skal luftstrømmen indstilles således, at lufthastigheden ved udgangen af ​​1000 μL pipettespidsen er 0,5 m / s. Dette svarer til en luftstrøm på 0,0017 l / s pr. Spids.

    7. Overvågning af parringsadfærd

    1. Brug en mundpipette (som beskrevet i reference 26 ) til at placere en eksperimentel kvinde i en lille petriskål (beskrevet i afsnit 4) kl. 15:00 (ZT 6) og give hende 1 h til at akklimatisere til parringsarenaen.
    2. Indstil forsøgsboksen (beskrevet i afsnit 1) som følger:
      1. Tænd lyset, dvs. hvide lysdioder i en 12 h: 12 h lys mørk cyklus tilsluttet en timer, der tændesLys kl 09:00 (ZT0) og kontinuerlige rødt lysdioder for at tillade overvågning af fluerne i den mørke fase af eksperimentet. Tænd ventilatorerne for at begrænse opvarmning af kabinettet af lyskilden, og for at sikre, at overskydende lugte udluftes uden for testområdet.
      2. Slut webcam kameraer til en computer og start dem med overvågningssoftware til billedovervågning.
      3. For hvert kamera skal du indstille fokus, lysstyrke og zoome ind i overvågningssoftware.
        1. Højreklik på kameraets skærm, åben "kameraegenskaber" og fjern "automatisk fokus". Juster "fokus" for at afklare netværket eller eventuelle skriftlige ord på papirarket. Om nødvendigt ændrer du "lysstyrke" og "zoom".
      4. Indstil programmet til overvågningsprogrammet til at fange 1 billede hver 2 min. Højreklik på hver kameraskærm og vælg "Rediger kamera" og derefter "Handlinger". Klik for at starte handlingerne "Ved almindelig intErvals "og skift tiden til" 2 minutter. "Vælg" Take Photo "for at vælge de handlinger, der skal udføres, og til sidst klikke på" ok ".
      5. Højreklik på hver kameraskærm og vælg "start overvågning."
    3. Efter 1 time (ved ZT 7) skal du overføre en wildtype-mand til Petri-skålen ved hjælp af mundpipetten, læg skålen på A4-papirarkene under webcamkameraerne og klik på "start overvågning" i 24 timer. Til luftpumpens forsøg skal du placere fadet på en sådan måde, at en pipetteudgang er forbundet med indgangshullet på parringsarenaen.
    4. For at analysere parrets parringsadfærd skal du gøre følgende.
      1. Vælg og åben alle billeder i et billedvisningsprogram og blad dem gennem kronologisk rækkefølge.
      2. Skriv ned datoen, eksperimentnummeret, skålnummeret og starttidspunktet i et regneark inden for samme række. Tag starttiden for hver arena fra det øjeblik, den er placeret under webcaM kamera. Optag tidsstempelet fra billederne.
      3. Marker starttidspunktet for hver kopiering i samme række i regnearket. Tæl en parring som en hændelse, når hanen har monteret kvinden, og parret forbliver moderat stationært og i samme kropsholdning i mindst fem på hinanden følgende rammer (10 min).
        BEMÆRK: Dette kriterium er baseret på den rapporterede længde af kopulationen, der spænder fra 12 til 27 minutter i D. melanogaster , og observeringen at copuleringer på 10 min og derover er frugtbare 27 , 28 .
      4. Tæl antallet af kopuleringer for hver række i regnearket for at bestemme parringsfrekvensen. Alternativt trækker forsøgs starttidspunkt fra tidspunktet for første parring for hver række som et mål for parring latens eller trækker tidspunktet for den første parring fra tidspunktet for den anden parring som et mål for at remittere latency.
        1. For at beregne den tilbagelagte latens skal du sørge forDefiner datoerne for den første og den anden parring som sammenhængende dage i regnearksoftwaren.
      5. Analyser dataene med blandede effektmodeller under forudsætning af normal distribution af dataene og indbefattet datoen for eksperimentet som en tilfældig faktor ved hjælp af en statistisk software (se materialebordet) for at bestemme den statistiske betydning af de uafhængige variabler-fødevaremedium, Lufttype og interaktion - som tidligere beskrevet 5 .
      6. Vælg den bedste forklaringsmodel ved at udføre baglæns eliminering af ikke-signifikante uafhængige variabler ved hjælp af log-sandsynlighedsforholdstest og tilhørende Akaike-oplysninger. Efter at have kørt modellen skal du undersøge datareserverne visuelt for at bekræfte normaliteten. Bekræft homogeniteten af ​​variationer ved hjælp af Levene testen. I tilfælde af uensartet homogenitet transformerer kvadratroden dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved anvendelse af denne kontinuerlige analyse, parringsadfærd og parringsfrekvens i specifikke kan bestemmes under eksperimentelle miljøforhold. For at styre miljøforholdene forvandlede vi et køkkenskab af rustfrit stål til et testområde med egen lyskilde og diffusion, hvilket sikrer en høj overflod af lys og et minimum af blænding fra toppen af ​​parringsarenaerne ( Figur 1A ) . Det indre testområde er helt indkapslet af rustfrit stål og glas, hvilket gør det muligt at rengøre med organiske opløsningsmidler, såsom hexan eller ethanol. Desuden er kabinettet udstyret med huller, der fungerer som indløb til slanger, hvilket giver flygtige signaler fra trykluftsystemet (se figur 1A og 1B ). Tryksluftsystemet, justeret for gær lugt, består af en luftstrøm styret gennem en flydende gærkultur, før de kommer ind i testarenerne gennem 4 pipette splittere med10 afsætninger hver ( figur 1C ). Hele systemet er lufttæt og forsynet med flere partikelfiltre, både før og efter indtrængen i gærkulturen, for at minimere forurening med forstyrrende lugt ( figur 1B ).

For at demonstrere brugen af ​​dette assay testede vi, om flygtige signaler fra en gærkultur kan påvirke parringsadfærd. Luft blev boblet gennem en flydende gærkultur i 24 timer, og luftudløbene blev anbragt i indgangen til hver parringsarena (se figur 2A ). Halvdelen af ​​parringsarealerne indeholdt flydende mad med gær (Food + yeast), og den anden halvdel indeholdt flydende mad uden gær tilsat (Food - yeast). En vildtype mand og kvinde blev udsat for lugterne fra den eksterne gærkultur, og deres parringsfrekvens blev registreret. For at bestemme hvilke variabler der er nødvendige for at forklare de graferede resultater, kørte vi blandede effekter modeller, enten med eller ekskluderetDe uafhængige variabler af fødevaremedium, gærluft og en interaktion mellem de to. Dataene i figur 2B er bedst repræsenteret af en model, der indbefatter de uafhængige variabler af fødevaremedium (p = 0,001) og gærluft (p = 0,061), men der er ingen forklaring på interaktionseffekt. Selvom gærluftvariablen ikke er signifikant i dette fulde datasæt, er det nødvendigt at forklare resultaterne. Analyse af gærluft adskilt for fødevaremedium viser, at et parret par ikke reagerer på gær lugt, når der ikke er nogen gær til stede i fødemediet (luft: p = 0,992), men de forøger deres parringsfrekvens i gærluft, når gær er Tilsættes også til fødevaremediet (luft: p = 0,018). Sammen viser disse resultater anvendelse af trykluftsystemet for at teste indflydelsen af ​​miljømæssige lugt i kombination med fødevaremediumforhold.

Vi illustrerer også, hvordan trykluftsystemet kan være bypVurdere ved at tilføje miljømæssige kemiske signaler direkte til testarenaen. For at demonstrere hvilke specifikke gærforbindelser, der påvirker parringsfrekvensen, testede vi hypotesen om, at aminosyreindholdet i gær er nødvendigt for dets virkning på parring ved at placere en dosis pepton (hydrolyserede proteiner) svarende til aminosyrerne leveret af gæren i agar Substrat foring parring arenaen. Vi testede også nødvendigheden af ​​eddikesyre, en af ​​de vigtigste flygtige gæringsprodukter af gær, for at øge parringsfrekvensen. Dette blev gjort ved at tilsætte eddikesyre direkte til fødevaremediet. En wildtype mand og kvinde blev testet i arenaer indeholdende agar eller agar med pepton, med eller uden eddikesyre direkte i fødevaremediet ( figur 3B ). Dette giver et meget simpelt fødevaremedium og et dårligt miljø; Derfor reduceres den gennemsnitlige parringsfrekvens også i sammenligning med figur 2B. Dataene i figur 3B er bedst repræsenteret af en model, der indbefatterUafhængige variabler af fødevaremedium (p = 0,002), eddikesyreluft (p = 0,001) og interaktionen mellem de to (p = 0,022). Kvindelig modtagelighed forøges ved tilstedeværelsen af ​​eddikesyre, men kun i den tilstand, hvor pepton er til stede i mediet. Dette viser, at fluer samtidig skal mærke aminosyrer og eddikesyre for at øge deres parringsfrekvens ( figur 3B ). Dette viser, at tilsætning af lugtstoffer direkte til testarena kan påvirke parringsadfærd, og at disse påvirkninger kan påvises under meget enkle miljømæssige forhold.

figur 1
Figur 1: Diagram af forsøgskassen og trykluftsystemet med gær. ( A ) Skematisk illustration af den miljømæssigt styrede parringsboks beskrevet i afsnit 1. Beskrivelse af de annoterede tal og pile: 1. lysplade med al Ternerende hvide og røde lys; 2. lille fan; 3. 3 lag filterpapir, hvert lag bestående af to filterpapirark; 4. Glasdiffusionsplade hviler på beslag fastgjort til 3 sider af kassen; 5. stor fan; 6. huller til slanger og kabler; 7. forsøgsområde Stor pil, 50 cm til glaspladen; Midterste pil, 35 cm højde for kabelhullerne; Og lille pil, 7 cm højde for rørhullerne. ( B ) Skematisk illustration af den flydende gærkultur med luftstrøm som beskrevet i afsnit 5, 6.4 og 6.5. Beskrivelse af de annoterede numre: 1. Engangsfilterenhed; 2. Hætte med silikonsept og ud- og indløb 3. flydende medium Og 4. glasrør med glasfiber. ( C ) Skematisk illustration af luftudtagene som beskrevet i afsnit 6.7. Beskrivelse af de anførte numre: 1. serologisk pipette; 2. slange udskåret fra 1 ml sprøjte og 3. 1000 μL pipettespids.Target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Gærlugt øger kvindelig modtagelighed i nærvær af gær i fødevaresubstratet. ( A ) Skematisk illustration af en parringsarena med en mandlig og en kvinde og en pipettespids fra luftudløbet i figur 1C, der kommer ind gennem indgangshullet. ( B ) Grafisk præsentation af svaret i parringsfrekvensen af ​​et Canton-S parret til gærlugt med og uden gær i flyvefødemediet (Fødevaregær: mediumluft n = 12, gærluft n = 13 og Food + gær : Medium luft n = 24, gærluft n = 23). Linjediagram med SEM fejlstænger og statistisk output af blandede effekter modeller med luft som den uafhængige variabel og datoen som en tilfældig variabel for hvert fødevaremedium uafhængigt. Den vigtigste statisticaL-modellen omfatter mad (p = 0,001) og gærluft (p = 0,061). Tilpasset fra reference 5 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Eddikesyre i flydende fødevaresubstrat øger kvindelig modtagelighed i nærvær af pepton. ( A ) Skematisk illustration af en parringsarena med flydende madmedium indeholdende eddikesyre og en plastparafinfilmprop, der lukker indgangshullet. ( B ) En grafisk præsentation af parringsfrekvensen for et Canton-S parringspar som reaktion på eddikesyre enten på agar eller peptonmedium (agar: eddikesyre n = 52, + eddikesyre n = 40 og pepton: eddikesyre N = 28, + eddikesyre n = 25). Linjediagram med SEM fejlstænger og statiStisk output af blandingseffektmodellen med fødevaremedium (p = 0,002), eddikesyre luft (p = 0,001) og mad * luft (p = 0,022) som uafhængige variabler og datoen som en tilfældig variabel. Tilpasset fra reference 5 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver et test for at teste parringsadfærd i løbet af 24 timer, mens du løbende styrer de miljømæssige signaler, som et parretpar er hypotetiseret til at bruge til at bestemme parringsfrekvensen. Det er muligt at øge parringsfrekvensen som reaktion på gærluft leveret gennem et trykluftsystem, når mediet også indeholder gær ( figur 2B ). Derudover kan et lignende svar i parringsfrekvens observeres med et forenklet fødevaremedium indeholdende kun agar-, pepton- og eddikesyrelugt direkte i mediet ( figur 3B )

Med de her viste eksperimenter kan der kun drages konklusioner om parrets generelle parringsadfærd, da begge køn udsættes for de samme miljøforhold. Imidlertid ved vi fra tidligere undersøgelser, at 47% af variationen i parringsfrekvensen bestemmes af kvinden, mens det mandlige bidrag kun tegner sig for 11% af variationen20 . Derfor er de fleste af de ændringer, der ses i parringsfrekvens, sandsynligvis et resultat af kvindelig seksuel modtagelighed. Øget mænds hofskab forlader fortsat kvinden for at acceptere eller afvise parring, da voksne D. melanogaster- kvinder med succes kan afbøde parringsforsøg 29 . For konkrete konklusioner og specifikt at tildele forskelle i parringsfrekvens til kvindelig seksuel modtagelighed er det nødvendigt at teste yderligere parringspar, hvor kvindens genotype er varieret, men den af ​​mændene holdes konstant.

Denne protokol har vist to måder at levere lugtstoffer til et parret par, enten med et trykluftsystem eller direkte i fødevaremediet. Tryksluftsystemet har den fordel, at enhver virkning kan tilskrives forbindelserne, som leveres via luften, mens dette ikke kan konkluderes, når forbindelserne sættes direkte i fødevaremediet. På den anden side wHøne ingen effekt er fundet med trykluftsystemet, betyder det ikke automatisk, at køen ikke påvirker adfærd. Det kan også betyde, at forbindelsen ikke leveres effektivt gennem trykluftsystemet. Luftens sammensætning ved udløbet af lufttilførselssystemet kan analyseres ved at anbringe et carbonhydridfilter og analysere det fangede luftindhold med gaskromatografi koblet med massespektrometri. Trykluftsystemet er et godt test til at teste forbindelser, som let kan laves luftbårne over et længere interval. Mindre flygtige forbindelser må muligvis sættes direkte i fødevaremediet. En anden ulempe ved trykluftsystemet er effektluftshastigheden kan have på flyveadfærd. Fluer holder op med at bevæge sig, når lufthastigheden er for høj (over 0,7-1,6 m / s) 30 . Derudover kan trykluftsystemet gøre et simpelt miljø af lav kvalitet uacceptabelt ved at tørre fødevaremediet. I begge tilfælde er fluerne måske ikke perfekteOrm lige så godt, og ingen konklusioner kan så tilskrives de testede specifikke forbindelser.

Flere trin er essentielle under forberedelse til optimal udførelse af disse analyser. Det første skridt, der kræver opmærksomhed, er forberedelse af mediet. Det er vigtigt, at mediet, herunder lugtfyldte flygtige forbindelser, såsom eddikesyre, fremstilles på forsøgsdagen og ikke før for at undgå fordampning. Mediumet skal også hærde på en overflade uden ekstra luftstrøm (undgå at bruge dampkåler til dette), fordi luftstrømmen kan stimulere forureningen af ​​lugten. Det andet skridt, der kræver særlig pleje, er etableringen af ​​trykluftsystemet. Luftstrømmen skal være høj nok til forsigtigt at boble gærkulturen uden at overføre noget væske til arenaen.

Denne protokol demonstrerer et adfærdsmæssigt assay med gær lugt i kombination med parringsadfærd. Dette system kan dog anvendes til enhverType lugt, samt andre former for adfærd. For at bruge dette system til andre lugte er det nødvendigt at justere luftstrøm og lugtmedium for at optimere overførslen af ​​forbindelserne til opvasken. Generelt kan enhver forbindelse, som kan overføres med luft, testes med dette system. Derudover kan enhver form for adfærd, både hos mænd og kvinder, afprøves enten ved at bruge samme type skåle eller ved at justere slangen for at nå og forbinde til større eller mindre testområder. Når mere detaljerede adfærd testes, skal rammeprocesserne og opløsningerne for de anvendte kameraer endvidere tages op til fornyet overvejelse. Under alle omstændigheder, hvis begge forsøg med og uden forsøgslugt køres samtidigt og med samme luftkilde, kan ethvert svar på miljøet detekteres uanset ændringer i tryk eller koncentration fra et eksperiment til det andet. Endelig kan analysen vist her forlænges i mindst en anden LD-cyklus (op til 48 timer), så længe fOod forsyning tørrer ikke ud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at offentliggøre.

Acknowledgements

Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøg på at udvikle trykluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrkning af gær Og Rezza Azanchi og Joel Levine for oprindeligt at udvikle time-lapse overvågningen af Drosophila parringsadfærd. JA Gorter blev støttet af et stipendium fra Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program. Dette arbejde blev delvist støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (reference: 821.02.020) til JC Billeter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25x95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42, (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23, (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278, (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25, (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14, (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56, (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100, (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3, (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451, (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61, (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61, (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280, (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279, (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79, (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26, (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35, (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011, (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155, (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276, (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84, (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457, (7235), 201-205 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics