क्रायोजेनिक तापमान पर एक्शस चश्मा की घनत्व को मापना

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Summary

कांच के चरण घनत्व को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है- पीको-लीटर का आकार क्रायोजेनिक तापमान पर जलीय मिश्रणों की बूंदों से होता है।

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Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

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Abstract

हम जलीय मिश्रणों के कांच का चरण क्रायोजेनिक तापमान घनत्व, और अन्य नमूनों का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हैं जो वांछित क्रायोजेनिक तापमान चरण तैयार करने के लिए तेजी से कूलिंग की आवश्यकता होती है। पिक्लिकर आकार की सूजन के लिए माइक्रोलाइटर एक तरल नाइट्रोजन-आर्गन (एन 2- एआर) मिश्रण में प्रक्षेपण से ठंडा हो जाता है। ड्रॉप के क्रायोजेनिक तापमान चरण एक्स-रे विवर्तन माप के साथ सहसंबंधित एक दृश्य परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। तरल एन 2 -एर मिश्रण की घनत्व को एन 2 या एआर जोड़कर समायोजित किया जाता है जब तक कि ड्रॉप नपुंसक रूप से प्रसन्न न हो जाए। इस मिश्रण का घनत्व और इस तरह ड्रॉप के एक परीक्षण जन और आर्किमिडीज सिद्धांत का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। ड्रॉप तैयारी में उचित देखभाल के साथ, लिक्विड क्रायोजेन मिश्रण से ऊपर के टुकड़े को कम करने के लिए प्रबंधन, और घनत्व स्तरीकरण और चरण पृथक्करण को रोकने के लिए क्रायोजेनिक मिश्रण का नियमित मिश्रण, <0.5% बूंदों के लिए सटीक, 50 पीएल जितना छोटा हो सकता हैआसानी से निर्धारित किया जाना चाहिए जलीय cryoprotectant मिश्रण पर माप cryoprotectant कार्रवाई में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और जैविक cryopreservation में थर्मल संकुचन मिलान की सुविधा के लिए मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं।

Introduction

उनके विभिन्न चरणों में पानी और जलीय मिश्रणों के भौतिक गुण मूलभूत हित हैं, और विवो और जैविक प्रणालियों के इन विट्रो समझ में महत्वपूर्ण हैं। समकालीन रोबोटोलॉजी और जैविक क्रायोएपर्सेशन में, जलीय cryoprotectant मिश्रण का कांच या अनाकार चरण विशेष रुचि 1 , 2 के हैं । न्यूक्लेईशन और बर्फ क्रिस्टल की वृद्धि कोशिकाओं और ऊतकों को बाधित कर सकती है, और प्रोटीन विकार और एकत्रीकरण को बढ़ावा दे सकती है, इसलिए क्रोनोकेशेशेशन प्रोटोकॉल जो विलायक काटते हैं, वे तेजी से लोकप्रिय हो गए हैं बायोमोलेक्युलर क्रिस्टलोग्राफी में, बायोमोलेक्लस के बीच के चैनलों में विलायक का क्रिस्टलीकरण क्रिस्टल लैटेस को विघटित करता है और विवर्तन गुणों को घटाता है। ग्लिसरॉल, एथिलीन ग्लाइकॉल, पॉलीथिलीन ग्लाइकोल (पीईजीएस) जैसे क्रिप्ट्रोक्टेक्टीक विलायकों के तेजी से ठंडा, निर्जलीकरण और जोड़ के विट्रिफिकेशन को प्राप्त किया जाता है,अल्कोहल, और लवण

विट्रीफिकेशन बर्फ क्रिस्टलीकरण और विकास को सीमित करता है, लेकिन सभी ठंडा-संबंधित नमूना क्षति को खत्म नहीं करता है। उदाहरण के लिए, क्रिस्टल मोसाइसिटी (क्रिस्टल प्लेन ओरिएंटेशन के वितरण का एक उपाय) नियमित रूप से 10 से 100 के एक कारक से बढ़ जाता है, जब प्रोटीन क्रिस्टल एक वर्ट्रिफाइड राज्य 3 में ठंडा हो जाते हैं, और वर्ट्रिफाइड शुक्राणु कोशिकाओं और ओक्साइट्स के बाद के पिघलना अस्तित्व दर व्यापक रूप से भिन्न होते हैं ।

एक क्षति तंत्र 3 , 4 , 5 को ठंडा करने के दौरान विलायक और आस-पास की सामग्री के अंतर के संकुचन है। एक क्रिस्टल, कोशिका या ऊतक के भीतर संतुलन विलायक और घुलनशील सांद्रता तापमान पर निर्भर होती है, और विलायक प्लस से घुलनशील और आस-पास की सामग्री विभिन्न मात्राओं से अनुबंधित हो सकती है। रैपिड कूलिंग से विलायक और विलायक पुनर्वितरण को विच्छेद करने से पहले, और विभेदक संविदा को रोक सकता है पर बड़े, अघोषित हो सकता है, कोई भी नहीं है कि नमूना क्षति का कारण बनता है।

ठंडा-प्रेरित क्षति को कम करने के लिए तर्कसंगत दृष्टिकोण इस प्रकार तरल और vitrified जलीय मिश्रण की तापमान-निर्भर घनत्व के ज्ञान से लाभ उठा सकता है। समाधान (वजन / डब्ल्यू) के वजन के लिए 50% से अधिक घनत्व पर सॉल्यूस सांद्रता पर, अधिकांश जलीय क्रियोप्रोटेक्टेंट मिश्रण को 10 के / या उससे कम की मामूली शीतलन दर से काट दिया जा सकता है, जिससे बड़े कांच के नमूनों का उपयोग करके उत्पादन और घनत्व माप की अनुमति मिलती है। नाइट्रोजन जैसे तरल क्रायोजेन में निलंबित होने पर नमूने के स्पष्ट भार को मापकर घनत्व को आर्किमिडीज़ के सिद्धांत का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, चूल्हे की एकाग्रता घट जाती है, व्रितकरण में तेजी से बढ़ने के लिए आवश्यक शीतलन दर तेजी से बढ़ जाती है: जलीय ग्लिसरॉल मिश्रण के लिए शीतलक दरें <10 के / एस से बढ़ जाती है, जी में घुलनतन का 50% भार एमएल (डब्ल्यू / वी) में> 1,000> के / एस में 25% w / vAss = "xref"> 7 हीट ट्रांसफर सीमा-परत सीमित हो जाता है, जिससे बड़े शीतलन दर को प्राप्त करने के लिए छोटे और छोटे नमूने 8 की आवश्यकता होती है।

शुद्ध-कांच के पानी और बर्फ की घनत्व का माप एक सूक्ष्म-ठंडा सतह पर एक वैक्यूम में सूक्ष्म-व्यास-व्यास (फेटेटोलिटर वॉल्यूम) जमा करके प्राप्त किया गया है ताकि एक मैक्रोस्कोपिक (ग्राम द्रव्यमान) नमूना तैयार किया जा सके। इस नमूने का घनत्व एक तरल नाइट्रोजन-आर्गन मिश्रण में cryoflotation द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसमें क्रायोजेनिक तरल का घनत्व समायोजित किया गया था जब तक नमूना neutrally 9 प्रसन्नता नहीं हो। हालांकि, बड़ी संख्या में छोटे बूंदों से बड़े पैमाने पर उत्पन्न होने वाले तरीके से शून्य मात्रा को कम करता है - पिछले कांच का घनत्व माप में त्रुटि का एक महत्वपूर्ण स्रोत - गैर तुच्छ है जलीय मिश्रण के लिए, वैक्यूम में एयरोसोलिज़न और बयान के दौरान समाधान घटकों के अंतर वाष्पीकरण को जन्म दे सकता हैजमा सांद्रता में पर्याप्त अनिश्चितताएं

हमने एक विधि विकसित की है, जो कि cryoflotation के आधार पर है, जो व्यक्तिगत घोल के उपयोग से जलीय मिश्रण के सटीक घनत्व निर्धारण को छोटे रूप में 50 पीएल 10 की अनुमति देता है । इन बूँदें तेजी से अपने मूल सांद्रता को बनाए रखने के दौरान ठंडा हो सकती हैं, और उनके क्रायोजेनिक तापमान राज्य (vitrified या क्रिस्टलीय) एक्स-रे विवर्तन माप के साथ संबंध है कि एक सरल दृश्य परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। यह विधि मोटे तौर पर जलीय और गैर-जलीय मिश्र धातुओं पर लागू होती है, और कोशिकाओं ( जैसे , स्टेम और अंडे), ऊतक के नमूनों और प्रोटीन क्रिस्टल सहित कई जैविक नमूनों में विस्तारित किया जा सकता है जो 0.8 और 1.4 ग्राम / एमएल।

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Protocol

सावधानी: कृपया उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) से संपर्क करें। उचित कैलिब्रेटेड गैस हैंडलिंग नियामकों और वाल्व और स्वीकृत गैस टयूबिंग सहित, संपीड़ित गैसों का उपयोग करते समय कृपया सभी उपयुक्त सुरक्षा पद्धतियों का उपयोग करें। तरल cryogens के साथ संपर्क गंभीर शीतदंश और परिगलन के कारण हो सकता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (चेहरा ढाल, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, बंद-पैर के जूते) का उपयोग करें, जो सभी को तरल नाइट्रोजन के लिए अभेद्य होना चाहिए। लिक्विड क्रायोजेन्स का प्रयोग करते समय खड़े रहें और उपकरण से एक अबाधित निकास पथ को सुनिश्चित करें। संपीड़ित गैसों और तरल cryogens का उपयोग करते समय अस्थिरता खतरे से अवगत रहें, और पर्याप्त मेक-अप वायु (एक धूआं हुड या एक उच्च वायु टर्नओवर दर कमरे) के साथ अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में काम करें।

1. घनत्व मापन के लिए जलीय समाधान की तैयारी

नोट: क्योंकि वॉल्यूम को वॉल से अधिक सटीकता से मापा जाता हैUmes, समाधान सांद्रता w / w इकाइयों में मापा जाता है। सभी घनत्व और पिघलने या उबलते तापमान ~ 100 केपीए के वायुमंडलीय दबाव को ग्रहण करते हैं। निम्नलिखित चरण 35% w / w ग्लिसरॉल समाधान की तैयारी का वर्णन करते हैं। उसी प्रक्रिया का उपयोग अन्य सांद्रता और विलेय के लिए किया जा सकता है।

  1. प्रत्येक सॉल्क्शन प्रकार और ब्याज की एकाग्रता के लिए , कुल समाधान मात्रा के लिए वांछित अंतिम एकाग्रता ( उदाहरण के लिए , 25% w / w और 100% w / w) प्राप्त करने के लिए आवश्यक सॉल्ट द्रव्यमान का लगभग अनुमान लगाता है, वी योग = 10 एमएल समाधान मात्रा । उदाहरण के लिए, 35% w / w ग्लिसरॉल समाधान ( ρ s = 1.26 g / mL) के लिए, solute mass, m s है:
    समीकरण
    जहां x एकस्यूट जन अंश (0.35) है और ρ वा = 1 ग्रा / एमएल पानी का घनत्व है।
  2. पैन पर 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (या अन्य वॉल्यूम-कैलिब्रेटेड पानी-अभिकारक कंटेनर) रखेंएक विश्लेषणात्मक microbalance की ट्यूब में वांछित द्रव / cryoprotectant ( उदाहरण के लिए , 35% w / w समाधान के लिए 3.77 ग्राम ग्लिसरॉल) को बांटने और वास्तविक विलेय जन द्रव्य रिकॉर्ड करें।
  3. कुल शुद्धता 10.0 ग्राम तक लाने के लिए उच्च शुद्धता (> 18 एमयू) विआयनीकृत पानी जोड़ें
  4. भंवर को 30 एस (तरल विलेय के लिए) या 5 मिनट (ठोस विलेय के लिए) के लिए कंटेनर, जब तक कि समाधान ऑप्टिकली एकरूप नहीं होता है
  5. समाधान के अंतिम द्रव्यमान को मापें और रिकॉर्ड करें कंटेनर को एक एयरटैड कैप के साथ सील करें और लगातार तापमान पर स्टोर करें (293-298 कश्मीर)

2. नमूना शीतलक कक्ष की तैयारी

  1. संलग्नक में नीचे वर्णित प्रायोगिक उपकरण रखें और शुष्क सूखी हवा (> 5% सापेक्षिक आर्द्रता (आरए)) बाड़े में रखें।
    नोट: संलग्नक एक सरल धातु फ्रेम हो सकता है, इसकी शीर्ष और तीनों पक्षों को स्पष्ट प्लास्टिक शीट के साथ सील कर दिया गया है और एक चौथाई तरफ लचीला प्लास्टिक शीट के साथ प्रयोग के उपयोग के साथ। पहन लेनाप्रयोगकर्ता द्वारा शुरू की गई नमी को कम करने के लिए चेहरे ढाल और पूरे शरीर को ढंकना। नमी संक्षेपण और बर्फ गठन क्रायोजेनिक तापमान घनत्व माप के साथ कई तरह से हस्तक्षेप कर सकते हैं, और इसलिए इसे कम किया जाना चाहिए।
  2. क्षति से दिवार्ड फ्लास्क की रक्षा के लिए, 4.5 एल ग्लास डेवर फ्लास्क के तल पर न्योप्रीन रबर की एक डिस्क रखें।
  3. सावधानी से एक उच्च तापीय चालकता तांबा चैम्बर (एक मोहरबंद नीचे के साथ एक खोखले सिलेंडर) फ्लास्क में डालने के लिए जब तक यह रबर डिस्क पर निर्भर करता है। चेंबर से देवर की दीवारों तक बाहरी रूप से पेश करने वाले स्ट्रट्स को समायोजित करें ताकि चैंबर केंद्रित हो और रॉक की कोई प्रवृत्ति न हो।
    नोट: देवर फ्लास्क तरल नाइट्रोजन बनाए रखेगा, और बहुत कम मात्रा तांबे के चैम्बर में तरल एन 2- ए आर मिश्रण होगा। तरल नाइट्रोजन एक थर्मल बाथ प्रदान करता है जो तम्बाकू कक्ष और इसकी सामग्री को 77 के लगातार तापमान पर रखता है और चैम्बर में उबलते और बाष्पीकरणीय नुकसान को कम करता है। कक्ष&#39; छोटा व्यास सतह तरंगों को दबाता है जो उछाल माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, और उपकरण में ठंड और बर्फ से बने चैम्बर के भीतर तरल को अलग करने में मदद करता है।
  4. कॉपर कक्ष के नीचे ~ 2 एल / मिनट नीचे सूखी एन 2 गैस के साथ एक गैस ट्यूब के आउटलेट को सम्मिलित करें, और नम हवा के कक्ष को शुद्ध करें।
  5. धीरे-धीरे नाइट्रोजन उबाल-बंद के लिए समय की अनुमति देते हुए, तांबा कक्ष के बाहर, देवर फ्लास्क में तरल नाइट्रोजन डालना।
    नोट: उबलते समाप्त होने के बाद, अंतिम भराव स्तर, तांबा कक्ष के शीर्ष के लगभग 4 सेंटीमीटर के भीतर होना चाहिए।
  6. एक कुंडल फोम इन्सुलेट ढक्कन के साथ देवदार फ्लास्क के बाहरी भाग को कवर करें। कॉपर चैम्बर से सूखी एन 2 गैस पर्ज ट्यूब निकालें और ढक्कन में एक मेलिंग खोलने में डालें।
    नोट: द्वायर फ्लास्क में फोड़े से एन 2 गैस का संयोजन और शुद्ध प्रवाह से कोई नम हवा निकलता है और इसे कंडेनसिंग और क्रिस्टिलाइजिंग से रोकता हैN ठंड सतहों।
  7. कॉपर कक्ष में धीरे-धीरे तरल नाइट्रोजन डालना उबलने का समय समाप्त होने के बाद, अंतिम भरण स्तर, तांबा कक्ष के शीर्ष के लगभग 4 सेमी के भीतर होना चाहिए।
  8. केन्द्रीय खोलने पर ढक्कन में एक पतली, ऑप्टिकली पारदर्शी प्लास्टिक शीट रखें और एन 2 गैस प्रवाह की दर ~ 0.2 एल / मिनट में कम करें, जिससे क्रायोजेनिक तरल पदार्थ के ऊपर गैस स्थान के भीतर एन 2 गैस की थोड़ी अधिक दबाव दूर हो।
    नोट: जब तक क्रायोजेनिक तरल पदार्थ देवर और चैंबर में मौजूद होते हैं, यह अधिक दबाव बनाए रखने के लिए एन 2 गैस प्रवाह को समायोजित करना जारी रखता है और नमी को देवर में प्रवेश करने से रोकने और बर्फ बनाने से रोकता है

3. टेस्ट मास की मात्रा और घनत्व का निर्धारण टी = 2 9 8 के और टी = 77 कश्मीर में

  1. एक ~ 1 ग्रा के स्पष्ट द्रव्यमान, ~ 0.4 एमएल पीटीएफ परीक्षण द्रव्यमान ( तालिका की सामग्री ) हवा में टी = 298 कश्मीर पर इसे पैन पर रखकर निर्धारित करेंएक कैलिब्रेटेड विश्लेषणात्मक माइक्रोबलियन का
  2. गैस पिक्चरमापी का उपयोग करके टी = 2 9 8 K में परीक्षण द्रव्यमान की मात्रा V (298 के) का निर्धारण करें, या कैलिपर का उपयोग करके आयामी माप। यदि आयामी मापन का प्रयोग कर रहे हैं, तो परीक्षण द्रव्यमान में एक सरल, सटीक आकार (कोई टेंपर या गोलाकार कोनों) नहीं होना चाहिए और बीच-छेद (निलंबित लाइन के लिए) निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. निम्नलिखित के अनुसार हवा द्वारा बनाए गए प्रसन्नचित्त बल के लिए मापा स्पष्ट द्रव्यमान को ठीक करके परीक्षण द्रव्यमान के द्रव्यमान की गणना करें:
    समीकरण
    जहां ρ हवा = 1.23 ग्राम / एल (~ 0.1% सुधार)।
  4. देवर फ्लास्क से करीब 10 सेमी ऊपर एक स्थिर मंच पर माइक्रोबलायन रखें और इसके अंशांकन की पुष्टि करें। Microbalance (बड़े पैमाने पर मापने के लिए डिज़ाइन किए गए) के नीचे पर हुक से घिरे 2 लाख (50 माइक्रोन) मोनोफिलामेंट लाइन का उपयोग करके टेस्ट जन को निलंबित करना और थ्रोपरीक्षण के द्रव्यमान में एक छेद स्पष्ट द्रव्यमान को हवा में निर्धारित करें, और चरण 3.3 में माप के साथ तुलना करें, लाइन के द्रव्यमान के लिए आवश्यकतानुसार सुधार करें।
  5. शुद्ध द्रव नाइट्रोजन में एमएम ऐप एलएन 2 में अपने स्पष्ट द्रव्यमान को मापकर टी = 77 कश्मीर में परीक्षण द्रव्यमान की मात्रा V (77 K) निर्धारित करें। तांबे के चैम्बर के भीतर तरल नाइट्रोजन में परीक्षण द्रव्यमान को कम करें, जब तक कि यह पूरी तरह जलमग्न नहीं हो। उबलते समय समाप्त हो जाने पर, स्पष्ट द्रव्यमान को मापें।
    नोट: यदि तांबा कक्ष में तरल नाइट्रोजन सूक्ष्मता और तरल सतह के बीच शांत और हवा में धाराएं हैं, तो यह द्रव्यमान ± 0.0002 जी सटीकता से अधिक मापा जा सकता है।
  6. लाइन के जलमग्न भाग पर प्रसन्नचित्त बल का अनुमान लगाएं, और सत्यापित करें कि माप त्रुटियों की तुलना में यह छोटा है।
  7. 77 कश्मीर में 77 K में एमएन ऐप में ज्ञात जन मीटर और एलएन 2 में मापा स्पष्ट द्रव्यमान का उपयोग 77 किलो में परीक्षण द्रव्यमान की मात्रा और घनत्व की गणना करें Iएन एल एन 2, निम्नानुसार:
    समीकरण
    जहां ρ एलएन 2 ( (77 के) = 0.807 ग्रा / एमएल

4. प्रारंभिक तरल एन 2 -एर मिश्रण की तैयारी

  1. फ्लो एआर गैस की एक प्रवाहित दर ~ 2 एल / मिनट से एक कॉयल ट्यूब के माध्यम से इसकी आउटलेट में। तरल नाइट्रोजन स्तर के ऊपर और देवदार की ऊपरी सतह के नीचे, तांबा चैम्बर की स्थिति को स्थिर करने वाले ऊपरी पचड़ों के शीर्ष पर तार युक्त ट्यूब रखें। कोल्ड एन 2 और आर गैस क्रायोजेनिक तरल पदार्थ से ऊपर का निर्माण करते हैं, और थर्मल चालन, संवहन, और विकिरण के भीतर टयूबिंग और आर गैस शांत होगा।
  2. कोयला ट्यूब को 5 मिनट के लिए शांत करने की अनुमति देने के बाद, तरल नाइट्रोजन की सतह के नीचे से कम से कम 10 सेमी, तांबा कक्ष में ट्यूब के आउटलेट को रखें। फिर देवदार ढक्कन और पारदर्शी शीट के साथ देवर को कवर करें।
  3. एआर बुलबुले उठने तक आर प्रवाह की दर को समायोजित करेंट्यूब आउटलेट से तरल नाइट्रोजन की ऊपरी सतह तक। फिर प्रवाह की दर को कम करें जब तक बुलबुले आउटलेट पर न हो जाए, तरल तरल नाइट्रोजन सतह को तोड़ने से पहले भंग या लिक्वीफाई करें।
    नोट: जैसा कि तांबे के चैम्बर में आर की एकाग्रता बढ़ जाती है, बबल के गठन को बनाए रखने के लिए समय-समय पर आर प्रवाह की दर को समायोजित करता है। यदि आर प्रवाह दर बहुत कम है, तो आर ट्यूब के अंदर फ्रीज कर सकता है और प्रवाह को रोक सकता है।
  4. आसपास के देववार में अपने स्तर को बनाए रखने के लिए तरल नाइट्रोजन जोड़ें। बर्फ को निकालें क्योंकि यह ठंडे सतहों पर जम जाता है।
  5. एक पतली ( उदाहरण के लिए , 35 माइक्रोन), तांबे की पन्नी के परिपत्र शीट को तांबे के चैम्बर में एक पतली इन्सुलेट रॉड से जोड़कर, और धीरे-धीरे इसे एक पिस्टन की तरह ऊपर और नीचे ले जाकर तरल मिलाकर मिश्रित करें। इससे एकाग्रता के ढाल को कम किया जा सकता है और एआर के लिए समाधान से बाहर निकलने की प्रवृत्ति कम हो सकती है।

5. प्रारंभिक एन 2 घनत्व के घनत्व को मापने और समायोजित करनासंरचना

  1. नमूना के टी = 77 कश्मीर घनत्व का अनुमान लगाने के द्वारा एन -2- ए मिश्रण के लिए लक्ष्य घनत्व की गणना करें, उदाहरण के लिए , नमूने के गैर-जलीय घटक के उच्च सांद्रता पर माप।
  2. मोनोफिलामेंट लाइन का इस्तेमाल करते हुए टेस्ट मास को माइक्रोबालियंस मापने के पैन को मापने के लिए हुक को अटैच करें, हवा में अपनी स्पष्ट जन को मापें और चरण 3.1 में माप के साथ समझौते की पुष्टि करें।
  3. कदम 4.5 के रूप में एकाग्रता और घनत्व ग्रेडियेंट को खत्म करने के लिए एन 2 -एर समाधान को मिलाएं।
  4. प्रीकोल को टेस्ट जन को टी = 77 कश्मीर में तांबा चैम्बर के बाहर तरल नाइट्रोजन में कम करके। परीक्षण द्रव्यमान को तरल नाइट्रोजन के ऊपर नाइट्रोजन गैस की ठंडी परत में बढ़ा दें, अवशिष्ट द्रव नाइट्रोजन के लिए परीक्षण द्रव्यमान को उखाड़ने के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर ठंडा, सूखी परीक्षण द्रव्यमान को एन 2- एर मिश्रण तक कम करें, जब तक कि यह पूरी तरह जलमग्न नहीं हो और तरल सतह के 2 सेमी के भीतर
  5. एम और टी = 77 K मात्रा V (77K) का उपयोग करके समाधान घनत्व की गणना करें:
    समीकरण
  6. वांछित प्रारंभिक घनत्व प्राप्त होने तक अतिरिक्त एर बहते हुए समाधान घनत्व बढ़ाएं। नमूना यह याद दिलाता है कि सिंक आसानी से खो दिया जा सकता है, इसलिए प्रारंभिक घनत्व अपेक्षाकृत नमूना घनत्व से कम से कम कुछ प्रतिशत अधिक होना चाहिए। नमूना तो फ्लोट करेगा, इसे ट्रैक करना आसान बना देगा, और एन 2- ए आर मिश्रण घनत्व तब तरल एन 2 जोड़कर केवल नीचे समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
  7. एआर को कूल्हे ट्यूब से ढंकना और अगले उपयोग से पहले गर्म और सूखने की अनुमति दें।

6. नमूना समाधान के ठंडे बूँदें

  1. वितरण और कूलिंग को छोड़ने से पहले चरण 1.5 से मील दोहराएंएक्स नाइट्रोजन / आर्गन क्रायोजेनिक तरल किसी भी बुलबुले को पेश करने के लिए सावधान रहें
  2. नमूना ट्यूब की एयरटैम कैप निकालें स्वच्छ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करना, समाधान के 1 एमएल तक निकालने और कैप को बदलना। सिरिंज पर एक 27 से 33 जी सुई संलग्न करें, और फिर हवा को बाहर निकालने के लिए सुई के माध्यम से और पिछले डिस्पेंसिंग के किसी भी अवशेष के माध्यम से एक छोटे से नमूना को दबाएं।
  3. दो तरीकों का इस्तेमाल एन 2- एआर मिश्रण में नमूना ड्रॉप करने के लिए किया जा सकता है।
    1. बड़े गैर-जलीय घटक सांद्रता (> 45% w / w) के नमूनों के लिए जिसे सामान्य शीतलन दर से काट दिया जा सकता है, हल्के से एक छोटे (250 μm से 1 मिमी) व्यास को विस्थापित करने के लिए सिरिंज को दबाएं, ~ 10 एनएल से 1 μL ड्रॉप जो सतह तनाव से सुई टिप से लटका हुआ है। तरल एन 2 -एर मिश्रण की ओर ड्रॉप करने के लिए सुई को धीरे से टैप करें।
    2. नमूनों के लिए जो व्रितकरण के लिए तेजी से शीतलन की आवश्यकता होती है, वैक्यूम जनरेट से जुड़े गैस ट्यूब के आउटलेट को रखेंया तरल एन 2 -A मिश्रण से ऊपर गैस स्थान में (प्रयोगशाला संपीड़ित हवा द्वारा आपूर्ति की जाती है), और धीरे-धीरे ठंडे गैस परत को सक्शन कर देती है इससे छोटे नमूने 11 के लिए शीतलन दर बढ़ जाती है
      1. नमूना के एक छोटे से मात्रा (<10 एनएल, एक बूंद व्यास <200 माइक्रोन) के अनुरूप करने के लिए 25-75 माइक्रोन मोटी स्पष्ट पॉलिमर पट्टी में सुई टिप को ध्यान से स्पर्श करें।
        नोट: सबसे छोटी, लगभग सबसे गोलाकार और सबसे आसानी से हटाए गए बूंदों को प्राप्त करने के लिए, पट्टी को 10 मिनट के लिए एक हाइड्रोफोबिक कोटिंग समाधान में भिगोएँ और नमूनों के वितरण से पहले सूखे जाने दें।
      2. एक संलग्न प्लास्टिक या लकड़ी की छड़ी का उपयोग करके पट्टी को पकड़ो, और रॉड प्लस स्ट्रिप को मैन्युअल रूप से तरल एन 2 -एर मिश्रण में डाल दें।
      3. एक बार जब बूंद मजबूत हो जाता है और उबलते रह गए हैं, तो चिमटी का उपयोग कर छड़ी के सामने पट्टी का किनारा पकड़ो। फ्लेक्स पट्टी, यह तरल N 2 -Ar में डुबोकर रखता है, जब तक कि नमूना ड्रॉप बंद नहीं होता है और सर्फ को फ़्लोट करता हैइक्का।

7. नमूने के राज्य का आकलन

  1. एक लंबी यातायात दूरी (5-10 सेमी) द्विनेत्री माइक्रोस्कोप और एलईडी या फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक से उज्ज्वल, शांत रोशनी का उपयोग करना, इसे तरल एन 2 -एर में डुबोए रखने के दौरान ध्यानपूर्वक जांच करें। विवरित अवशोषण स्पष्ट दिखाई देना चाहिए 12 , 13 धुंधला या धुंधला (जो एक से अधिक चरण वाले होते हैं) और / या उस दरार को अस्वीकार कर देते हैं जिसमें दरारें सहित ऑप्टिकल अपूर्णताएं होती हैं (जो कि आवाज़ें जो औसत घनत्व बदलती हैं) के साथ जुड़ी हो सकती हैं।
    नोट: एक काले रंग की पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए तांबा कक्ष के अंदर की सतह को चित्रकारी, नमूना खामियों की पहचान की सुविधा प्रदान कर सकता है।

8. नमूने की घनत्व का निर्धारण

  1. वितरित ड्रॉप प्रारंभिक रूप से फ्लोट, सिंक, या (शायद ही कभी) एन 2 -Ar मिश्रण में neutrally प्रसन्न होना होगा।फ्लोटिंग ड्रॉप्स को कभी-कभी सतह तनाव, छोटे बुलबुले, या बर्फ कणों का पालन किया जा सकता है। सूक्ष्मदर्शी के साथ पूरे ड्रॉप सतह का निरीक्षण करें। तरल सतह से एक छोटे (2-3 मिमी व्यास, 10 सेमी लंबा) का उपयोग करके ड्रॉप डाउनवॉस्ट करें, प्रीक्लाल्ड प्लास्टिक या लकड़ी की छड़ और उसकी प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें।
  2. यदि ड्रॉप सिंक, तरल एन 2- एआर की घनत्व को चरण 4 में प्रक्रिया का उपयोग करके बढ़ा दें, जब तक कि ड्रॉप नपुंसक रूप से प्रसन्नचित्त हो या फ्लोट हो।
  3. यदि ड्रॉप फ्लोट होता है, तरल एन 2 -एआर की घनत्व को 1.8 एमएल क्रोनिवियल का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन जोड़कर कम करें। बड़ी प्रारंभिक मिश्रण घनत्व (1.2-1.3 ग्राम / एमएल) में, 1 एमएल की वृद्धि में एन 2 को जोड़ना प्रशंसनीय घनत्व में परिवर्तन होता है, लेकिन इसे कम घनत्व (0.8-0.9 ग्राम / एमएल) पर 5 एमएल की ओर बढ़ना चाहिए। कॉपर चैम्बर में पतली छिद्रित तांबा पन्नी शीट ऊपर और नीचे का उपयोग करके धीरे-धीरे एन 2- एआर मिश्रण करें (ऐसा न कि नमूना ड्रॉप का ट्रैक खोना)
  4. प्रत्येक एन 2 अतिरिक्त के बाद, एक छोटे से प्री-कूल्ड रॉड का उपयोग करने के लिए धीरे-धीरे तरल में अस्थायी बूंद को हटा दें, और इसकी गति का निरीक्षण करें क्योंकि यह सतह पर लौटा है।
  5. जब समाधान घनत्व को समायोजित किया गया है, तो ड्रॉप को नीच रूप से प्रसन्नचित्त होना चाहिए या बहुत धीरे धीरे (<50 माइक्रोग्राम / एस ~ 0.1% या 50 पीएल नीचे मात्रा के साथ बूंदों के लिए बेहतर घनत्व सटीकता सुनिश्चित करेगा) चढ़ता है, एन 2 - चरण 5 में वर्णित एआर मिश्रण की घनत्व। तब तक अतिरिक्त तरल एन 2 जोड़ें जब तक कि पहले बूंदों को धीरे-धीरे सिंक करने शुरू नहीं होता है, और फिर एन 2- आर मिश्रण घनत्व को मापें। ये दो माप ड्रॉप घनत्व पर सीमा प्रदान करेगा।

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Representative Results

जलीय ग्लिसरॉल और एथिलीन ग्लाइकॉल बनाम क्रियोप्रोटेक्टेंट एकाग्रता के vitrified बूंदों के लिए टी = 77 के लिए घनत्व माप क्रमशः 1 और चित्रा 1 बी में दिखाए गए हैं, और टी = 2 9 8 के और 77 कश्मीर के बीच विशिष्ट मात्रा में संबंधित परिवर्तन, पहले का उपयोग करके गणना निर्धारित टी = 298 के घनत्व, चित्रा 2 में दिखाया गया है। उच्च क्रियोप्रोटेक्टेंट सांद्रता पर, विट्रीकृत अवस्था में ठंडा होने पर समाधान अनुबंध होता है, जबकि शुद्ध पानी फैलता है। दोनों cryoprotectants के 20-25% w / w समाधान के पास कोई शुद्ध विस्तार या संकुचन दिखाने के लिए भविष्यवाणी की जाती है। एकाग्रता की तुलना में वॉल्यूम परिवर्तन की ढलान 40% से नीचे की सबसे बड़ी परिमाण है, जहां पानी के टेट्राहेडल कम तापमान संरचना पर अतिरिक्त क्रियोप्रोटेक्टेंट के प्रभाव सबसे स्पष्ट हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: विचित्र चरण टी = 77 कश्मीर घनत्व बनाम क्रियोप्रोटेक्टेंट एकाग्रता टी = 77 कश्मीर घनत्व बनाम वेट्रीफाइड जलीय बूंदों के लिए एकाग्रता बनाम ( ) ग्लिसरॉल और ( बी ) एथलीन ग्लाइकॉल। डेटा को तीन व्यक्ति की बूँदें के औसत ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: 2 9 8 कश्मीर पर तरल से कूलिंग पर विशिष्ट मात्रा में विटाईस चरण के लिए 77 कि.मी. पर प्रति मिनट की मात्रा में परिवर्तन, 2 9 8 से 77 डिग्री सेल्सियस के लिए जलीय घोलग्लिसरॉल और एथिलीन ग्लाइकॉल की मात्रा टी = 298 के समाधान घनत्व पिछले माप 14 , 15 से प्राप्त किए जाते हैं। डेटा को तीन व्यक्ति की बूँदें के औसत ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

वर्तमान उपकरण और विधियां, मुख्य रूप से अंडरग्रेजुएट्स द्वारा उपकरण-निर्माण उपकरण और मशीनरी तक सीमित पहुंच के साथ विकसित की जाती हैं, फिर भी 50 पीएल के रूप में छोटे के रूप में व्यक्तिगत तरल बूंदों के लिए सटीक घनत्व माप देता है। 50% के आसपास और ऊपर की एकाग्रता रेंज में, जहां छोटे शीतलन दर वर्ट्रिफाइड नमूनों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं, घनत्व, थोक नमूनों पर पिछले माप में प्राप्त उन लोगों से सहमत हैं। वर्तमान घनत्व के 0% एकाग्रता के लिए एक्सट्रपलेशन - शुद्ध पानी - भी 77 K 9 पर कम घनत्व अनाकार के बर्फ के स्वीकृत घनत्व के साथ काफी अच्छी तरह से सहमत हैं।

एन 2- ए मिश्रण को तैयार करना 30 मिनट और 5 घंटे के बीच की आवश्यकता होती है, अंतिम एन 2 के आधार पर, घनत्व को किसी दिए गए ड्रॉप संरचना को निष्पादित करने के लिए आवश्यक होना चाहिए। आर मिक्सिन के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए इस समय को विसारक या कई गैस ट्यूबों का उपयोग करके कम किया जा सकता हैक्रायोजेनिक तरल में जी। एन 2- अर्ट घनत्व को समायोजित करने तक एक बूंद को निष्पक्ष रूप से प्रसन्न करने का पता लगाया जा सकता है, खासकर छोटे त्रिज्या ( आर ) बूंदों के लिए, जो कि छोटे टर्मिनल गति होती है ( समीकरण आर 2 ) और इसलिए अधिक सावधान टिप्पणियों की आवश्यकता होती है। एन 2- आर मिश्रण एक ऊर्ध्वाधर घनत्व / संरचना ढाल विकसित करने के लिए जाता है, और इसलिए नियमित रूप से मिश्रित होना चाहिए। नतीजतन, किसी भी घुलनशील प्रकार और एकाग्रता के लिए एक कांच का घनत्व बिंदु का निर्धारण करना, जिसमें कम से कम 3-5 बूंदों पर माप की आवश्यकता होती है, वह कई घंटे ले सकती है।

प्रत्येक एकाग्रता में, दो या तीन बूंदों की घनत्व आमतौर पर मापा जाता है। प्रत्येक ड्रॉप का "घनत्व" घनत्व पर मापा ऊपरी और निचली सीमा के औसत के रूप में अनुमान लगाया गया है, जो सबसे बड़े मापा एन 2 -घनत्व के द्वारा दिया गया है, जिसके कारण ड्रॉप सिंक और छोटी घनत्व ने इसे फ्लोट किया। चूंकि दोनों एक तंग ऊपरी बाउंड और एक तंग निचले बंधे हैं- जहां घबराहट की गिरावट की गति या चढ़ाई की गति से मूल्यांकन किया जाता है - किसी दिए गए ड्रॉप पर माप में हमेशा से प्राप्त नहीं होता है ( उदाहरण के लिए , ड्रॉप मिटाने के दौरान खोया जा सकता है), माप एक ही एकाग्रता और आकार की बूंदों पर कभी-कभी एक घनत्व अनुमान में जोड़ दिया जाता था।

प्रयोग के समय को कम करने के लिए, क्रायोजेनिक स्टोरेज कंटेनरों में उच्च-घनत्व एन 2- ए मिश्रण तैयार करने और संग्रहीत करने के प्रयास किए गए थे, एक से तीन दिन बाद। सभी मामलों में, आर समाधान से बाहर निकल जाता है और तरल घनत्व भंडारण समय के साथ घट जाता है। तरल एन 2- आर नियमित रूप से मिश्रित नहीं था, तो घनत्व माप के दौरान घनत्व और तरल घनत्व घट जाती है।

इन मापों में एक बड़ी चुनौती frosting और बर्फ गठन को कम कर रहा है। जल वाष्प संक्षेपण, बर्फ गठन, और बर्फ संचय परनमूना कूलिंग कक्ष, अन्य ठंडे सतहों पर, एन 2- आर मिश्रण से ऊपर ठंडे गैस में, और एन 2 -एर मिश्रण में ही घनत्व माप में इस्तेमाल किए गए नमूनों को प्रदूषित कर सकता है, उनके भीतर बर्फ न्यूक्लेयेशन को बढ़ावा देता है, और उनके स्पष्ट घनत्व को बदल सकता है। नमूना पर बर्फ और तरल एन 2- ए मिश्रण पर फ्लोटिंग में नमूना के निम्न तापमान राज्य (कांच या पॉलीसिस्ट्रीलाइन) को मुश्किल का आकलन कर सकते हैं। बर्फ गठन को कम करने के लिए, बर्फ के लिए सभी ठंडे सतहों का नियमित रूप से निरीक्षण करें। ध्यान से किसी भी बर्फ को यांत्रिक तरीके से हटा दें या गर्म शुष्क एन 2 गैस का उपयोग करें। अगर तांबे के कमरे में बर्फ जमा हो जाए, तो उसे ठीक मैश स्क्रीन का उपयोग करके हटा दें, या फिर कक्ष को हटा दें, खाली, सूखा और फिर से भरें।

एक विट्रिड नमूना प्राप्त करने के लिए जरूरी न्यूनतम (गंभीर) शीतलन दर, घटते हुए घनकलन एकाग्रता के साथ बढ़ जाती है, शुद्ध पानी 7 के लिए 10 6 के.ए. नमूना शीतलन दर ड्रॉप आकार और आकार पर निर्भर करती है (वृद्धिगिरावट के व्यास के साथ), जिस गति से द्रव क्रायोजेन, तरल क्रायोजेन (जो आमतौर पर शीतलन दर कम हो जाती है), और तरल क्रायोजेन के गुणों के ऊपर ठंडा गैस की उपस्थिति में प्रक्षेपित होता है। सामान्यतया, 1,000 K / s के मुकाबले शीतलन की दरें ~ 1 एनएल (~ 100 माइक्रोन) से कम मात्रा (व्यास) के साथ बूंदों की आवश्यकता होती है।

सबसे कम विलेपन या क्रियोप्रोटेक्टेंट एकाग्रता जिसके लिए कांच की घनत्व को मापा जा सकता है, अधिकतम ड्रॉप शीतलन दर के आधार पर निर्धारित किया जाता है, और सबसे छोटे आकार की बूँदें जिसके लिए आच्छादन के लिए दृश्य परख भरोसेमंद उपयोग किया जा सकता है। शीतलक दरों को तरल प्रोपेन या एक तरल प्रोपेन-एथेन मिश्रण में नमूनों को ठंडा करके ~ 5 के एक कारक से बढ़ाया जा सकता है। तरल एन 2 के विपरीत, इन क्रायोजेनिक तरल पदार्थों में उबलते और पिघलने के तापमान के बीच एक बड़ा अलगाव होता है और ऐसा ही गर्मी-अंतरण-सीमित सतह उबलते बिना अधिक गर्मी को अवशोषित कर सकता है। कूल्ड ड्रॉप्स को फिर से एन 2 -एर में स्थानांतरित किया जा सकता हैघनत्व माप के लिए मिश्रण स्पष्ट बूंदों से धुंधला या बादलों की बूंदों तक संक्रमण अकस्मात होता है, जो घुलनशील एकाग्रता (मोटे तौर पर 2% w / w) और शीतलन दर की एक संकीर्ण सीमा से अधिक होती है, और एक्स-रे विवर्तन पैटर्न 16 में दिखने वाले आंखों के छल्ले से सम्बंधित है , 17 हालांकि, सटीक दृश्य स्पष्टता मूल्यांकन अधिक कठिन हो जाता है क्योंकि ड्रॉप वॉल्यूम 10 पीएल की ओर कम हो जाता है।

एन 2- ए मिश्रणों का उपयोग करते हुए नमूना घनत्व की सुलभ रेंज क्रमशः शुद्ध तरल पदार्थ, 0.81 ग्राम / एमएल और 1.40 ग्राम / एमएल की घनत्व से निर्धारित होती है। तरल एआर- Kr मिश्रण कृत्रिम रूप से क्रिस्टलीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, लेकिन इस घनत्व सीमा को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते तरल पदार्थ लगातार मिश्रित होते हैं।

यहां वर्णित विधियां मोटे तौर पर जलीय मिश्रणों, कोशिकाओं, सेल समुच्चय, अन्य जैविक पदार्थों और अन्य प्रणालियों की घनत्व को निर्धारित करने के लिए लागू होती हैं जहां छोटे नमूनों औरवांछित निम्न-तापमान चरण को प्राप्त करने के लिए बड़े शीतलन दर आवश्यक हैं इन घनत्व को cryopreservation में नमूना क्षति को समझने और कम करने में उपयोगी होगा, और जलीय समाधानों में पानी के व्यवहार को समझने और सीमित और भीड़ वाले वातावरणों में समझने में मददगार होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनएसएफ द्वारा पुरस्कार के तहत समर्थित था MCB-1330685 डीडब्ल्यूएम कॉर्नेल विश्वविद्यालय के आणविक बायोफिज़िक्स ट्रेनिंग ग्रांट (एनआईएच टी 32 जीएम 20082567) से आंशिक समर्थन को स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 L/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate

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