Måling av tetthetene av vandige briller ved kryogene temperaturer

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En protokoll for å bestemme glassfettdensiteter av mikro- til pico-liter-størrelsesdråper av vandige blandinger ved kryogene temperaturer er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi demonstrerer en metode for å bestemme krystalliske temperaturdensiteter i glassfasen av vandige blandinger og andre prøver som krever rask avkjøling for å fremstille den ønskede kryogeniske temperaturfase. Mikroliter til pikoliterstørrelsesdråper avkjøles ved fremspring i en flytende nitrogen-argon (N2-Ar) -blanding. Den kryogene temperaturfasen av dråpen blir evaluert ved hjelp av en visuell analyse som korrelerer med røntgendiffraksjonsmålinger. Tettheten av den flytende N 2 -Ar-blandingen justeres ved å legge N 2 eller Ar inntil dråpen blir nøytralt flytende. Tettheten av denne blandingen og dermed av dråpen bestemmes ved bruk av en testmasse og Archimedes-prinsipp. Ved passende behandling i dråpepreparat, håndtering av gass over væskenkryogenblandingen for å minimere isingen og regelmessig blanding av kryogenblandingen for å hindre tetthetstratifisering og faseseparasjon, tettheter nøyaktig på <0,5% dråper så små som 50 pL kanLett bli bestemt. Målinger på vandige kryobeskyttelsesblandinger gir innsikt i kryobeskyttende virkning og gir kvantitative data for å lette termisk sammentrekning i biologisk kryopreservering.

Introduction

De fysiske egenskapene til vann og vandige blandinger i deres forskjellige faser er av fundamental interesse, og er viktige for in vivo og in vitro forståelse av biologiske systemer. I moderne kryobiologi og biologisk kryopreservering er de glassformede eller amorfe faser av vandige kryobeskyttelsesblandinger av særlig interesse 1 , 2 . Nukleasjon og vekst av iskrystaller kan forstyrre celler og vev og fremme protein denaturering og aggregering, slik at kryopreserveringsprotokoller som fortynner løsningsmidlet, har blitt stadig mer populære. Ved biomolekylær krystallografi forstyrrer krystalliseringen av løsningsmiddel i kanalene mellom biomolekyler krystallgitter og nedbryter diffraksjonsegenskapene. Vitrifikering oppnås ved en kombinasjon av hurtig avkjøling, dehydrering og tilsetning av kryobeskyttende løsemidler som glyserol, etylenglykol, polyetylenglykoler (PEGs),Alkoholer og salter.

Vitrifikasjon begrenser iskrystallisering og vekst, men eliminerer ikke alle kjølerelaterte prøveskader. For eksempel øker krystallmosaiciteten (et mål for fordelingen av krystallplanretninger) rutinemessig med en faktor 10 til 100 når proteinkrystaller blir avkjølt til en forglasset tilstand 3 og etter-tine overlevelseshastigheter for forglassede spermceller og oocytter varierer mye .

En skade mekanisme er differensial sammentrekning av løsningsmiddel og omgivende materiale under kjøling 3 , 4 , 5 . Likevektsløsningsmidlet og løsningsmiddelkonsentrasjonene i en krystall, celle eller vev er temperaturavhengige, og løsningsmidlet pluss løsningsmidlet og omgivende materiale kan trekke sammen med forskjellige mengder. Hurtig avkjøling kan forhindre oppløsning av løsemiddel og løsemiddel før vitrifikasjon og differensialkontrakt På kan føre til store, inhomogene, ikke-likevektsbelastninger som forårsaker prøveskade.

Rasjonelle tilnærminger for å redusere kjøleinducerte skader kunne således ha nytte av kunnskapen om temperaturavhengige tettheter av flytende og forglassede vandige blandinger. Ved løsemiddelkonsentrasjoner over 50 vektprosent løsemiddel til vekt av oppløsning (vekt / vekt), kan de fleste vandige kryobeskyttelsesblandinger forglasses med beskjedne kjølingshastigheter på 10 K / s eller mindre, slik at produksjon av og tetthetsmålinger ved bruk av store glassplater 6 . Tettheten kan da bestemmes ved bruk av Archimedes 'prinsipp ved å måle den tilsynelatende vekten av prøven når den er suspendert i et flytende kryogen som nitrogen. Etter hvert som løselig konsentrasjon reduseres, øker kjølehastighetene for vitrifikasjon raskt. Kokehastighetene for vandige glycerolblandinger øker fra <10 K / s ved 50% vektoppløsning i g til volumløsning i mL (w / v) til> 1000 K / s ved 25% vekt / volumAss = "xref"> 7. Varmeoverføring blir begrenset av begrensning, slik at større kjølehastigheter krever mindre og mindre prøver 8 .

Målinger av tetthet av rent glassholdig vann og is har blitt oppnådd ved å avsette dråper med mikrometer-diameter (femtoliter volum) i et vakuum på en kryogenisk avkjølt overflate for å bygge opp en makroskopisk (grammasse) prøve. Tettheten av denne prøven ble bestemt ved kryoflotering i en flytende nitrogen-argonblanding, hvori tettheten av kryogen væske ble justert til prøven ble nøytralt flytende 9 . Imidlertid er det ikke-trivielt å generere store prøver fra et stort antall små dråper på en måte som minimerer tomromvolumer - en viktig kilde til feil i tidligere målinger av glassfase tetthet. For vandige blandinger kan differensial fordampning av løsningskomponenter under aerosolisering og avsetning i vakuum føre tilBetydelig usikkerhet i deponerte konsentrasjoner.

Vi har utviklet en metode basert på kryoflotasjon, som tillater nøyaktig tetthetsbestemmelse av vandige blandinger ved bruk av individuelle dråper så små som 50 pL10. Disse dråpene kan raskt avkjøles mens de opprettholder deres opprinnelige konsentrasjoner, og deres kryogeniske temperaturtilstand (forglasset eller krystallinsk) kan bli vurdert ved hjelp av en enkel visuell analyse som korrelerer med røntgendiffraksjonsmålinger. Denne fremgangsmåten er bredt anvendelig for vandige og ikke-vandige blandinger og kan utvides til en rekke biologiske prøver, inkludert celler ( f.eks . Stamme og egg), vevsprøver og proteinkrystaller med lavtemperaturtettheter mellom 0,8 og 1,4 g / ml.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FORSIKTIG: Vennligst se alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Vennligst bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis ved bruk av komprimerte gasser, inkludert passende kalibrerte gasshåndteringsregulatorer og ventiler, og godkjent gassledning. Kontakt med flytende kryogener kan forårsake alvorlig frostbit og nekrose. Bruk egnet personlig verneutstyr (ansiktsskjold, hansker, laboratoriejakke, bukser med full lengde, lukkede sko), som alle må være ugjennomtrengelige for flytende nitrogen. Fortsett å stå og sikre en uhindret utkjørsvei fra apparatet når du bruker flytende kryogener. Vær oppmerksom på støvfare ved bruk av komprimerte gasser og flytende kryogener, og arbeid i et godt ventilert område med tilstrekkelig sminkeluft (en avtrekksvifte eller et rom med høy luftomsetning).

1. Fremstilling av vandige løsninger for tetthetsmålinger

MERK: Fordi vekter lettere måles til høy nøyaktighet enn volUmes, oppløsningskonsentrasjoner blir målt i vekt / vekt-enheter. Alle tettheter og smelte- eller kokende temperaturer antar et atmosfærisk trykk på ~ 100 kPa. De følgende trinn beskriver fremstillingen av en 35% vekt / vekt glyseroloppløsning. Samme prosedyre kan brukes til andre konsentrasjoner og oppløsninger.

  1. For hver løsemiddeltype og konsentrasjon av interesse estimerer du den nødvendige løsningsmassen for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon ( f.eks . Mellom 25% vekt / vekt og 100% vekt / vekt) for et totalt oppløsningsvolum, V til = 10 ml oppløsningsvolum . For eksempel, for en 35% vekt / vekt glyseroloppløsning ( p s = 1,26 g / ml) er løsningsmassen, m s :
    ligningen
    Hvor x er løsemiddelmassefraksjonen (0.35) og pw = 1 g / mL er tettheten av vann.
  2. Plasser et 15 ml sentrifugerør (eller annen volumkalibrert vannimpermeabel beholder) på pannenAv en analytisk mikrobalanse. Dispense den ønskede massen av løsemiddel / kryobeskyttelsesmiddel ( f.eks . 3,77 g glycerol for en 35% vekt / vekt løsning) i røret og registrer den faktiske løsningsmassen.
  3. Legg til høy renhet (> 18 MΩ) avjonisert vann for å få totalmengden opp til 10,0 g
  4. Vortex beholderen i 30 s (for flytende oppløsninger) eller 5 min (for faste oppløsninger), til løsningen er optisk homogen.
  5. Mål og registrer den endelige løsningen av løsningen. Tetning beholderen med en lufttett hette og lagre ved konstant temperatur (293-298 K).

2. Fremstilling av prøvekjølingskammeret

  1. Plasser forsøksapparatet som er beskrevet nedenfor i et kabinett og flyt tørrluft (> 5% relativ fuktighet (rh)) inn i kabinettet.
    MERK: Kapslingen kan være en enkel metallramme med topp og tre sider forseglet med klart plastark og med eksperimenttilgang via en fjerde side dekket med fleksibelt plastark. Ha påAnsiktsskjold og full kroppsdekning for å minimere fuktighet introdusert av eksperimentøren. Fuktkondensasjon og isdannelse kan forstyrre målinger av kryogen temperaturdensitet på flere måter, og det må derfor minimeres.
  2. Legg en disk av neoprengummi på bunnen av en 4,5 L glass Dewar-kolbe for å beskytte Dewar-kolben mot skade.
  3. Sett forsiktig et kobberkammer med høyt termisk ledningsevne (en hul sylinder med forseglet bunn) inn i kolben til den hviler på gummiskiven. Juster stiver som strekker seg utover fra kammeret til Dewar-veggene slik at kammeret er sentrert og har ingen tendens til å rocke.
    MERK: Dewar-kolben holder flytende nitrogen, og det mye mindre volum kobberkammeret vil holde en flytende N 2 -Ar-blanding. Det flytende nitrogenet gir et termisk bad som opprettholder kobberkammeret og dets innhold ved en konstant temperatur på 77 K og reduserer kokende og fordampningstap i kammeret. Kammeret og #39; s små diameter undertrykker overflatebølger som kan forstyrre oppdriftsmålinger, og bidrar til å isolere væsken i kammeret fra frost og is dannet andre steder i apparatet.
  4. Sett utløpet av et gassrør med tørr N 2- gass ​​som strømmer til ~ 2 l / min ned til bunnen av kobberkammeret, og rens kammeret av fuktig luft.
  5. Flyt langsomt flytende nitrogen inn i Dewar-kolben, utenfor kobberkammeret, slik at tiden for nitrogen blir avkjølt.
    MERK: Det endelige fyllnivået, etter at kokingen er opphørt, skal ligge innenfor ca. 4 cm av toppen av kobberkammeret.
  6. Dekkkolens ytre del dannes med et ringformet skumisolerende deksel. Fjern det tørre N 2- gassutløpsrøret fra kobberkammeret og sett inn i en samsvarende åpning i lokket.
    MERK: Kombinasjonen av N 2- gass ​​fra avkjøling i Dewar-kolben og fra rensestrømmen utelukker fuktig luft og forhindrer kondensering og krystallisering av oN kalde overflater.
  7. Hell langsomt flytende nitrogen inn i kobberkammeret. Det endelige fyllingsnivået, etter at kokingen er opphørt, skal ligge innenfor ca. 4 cm av toppen av kobberkammeret.
  8. Plasser et tynt, optisk gjennomsiktig plastark over den sentrale åpningen eller ventilen i lokket, og reduser N 2- gasstrømningshastigheten til ~ 0,2 l / min, og la et lite overtrykk av N 2 -gassen inne i gassrommene over kryogenvæskene.
    MERK: Så lenge kryogen væsker er tilstede i Dewar og kammer, fortsett å justere N 2 -gasstrømmen etter behov for å opprettholde dette overtrykket og hindre fuktighet i å komme inn i Dewar og danne is.

3. Bestemmelse av volum og tetthet av testmassen ved T = 298 K og T = 77 K

  1. Bestem den tilsynelatende massen av en ~ 1 g, 0,4 ml PTFE testmasse ( Tabel ) i luft ved T = 298 K ved å plassere den på pannenAv en kalibrert analytisk mikrobalanse.
  2. Bestem volumet V (298 K) av testmassen ved T = 298 K ved hjelp av et gasspyknometer eller ved dimensjonale målinger ved hjelp av kaliper. Ved bruk av dimensjonsmålinger må testmassen ha en enkel, presis form (ingen tapere eller avrundede hjørner) og volumet av gjennomhullet (for suspensjonslinjen) skal bestemmes.
  3. Beregn massen m av testmassen ved å korrigere den målte tilsynelatende masse for luftkraft som utøves av luft i henhold til følgende:
    ligningen
    Hvor ρ luft = 1,23 g / l (~ 0,1% korreksjon).
  4. Plasser mikrobalansen på en stabil plattform omtrent 10 cm over Dewar-kolben og kontroller kalibreringen. Stans testmassen ved hjelp av en monofilamentlinje på 2 mil (50 μm) som er strammet fra kroken på undersiden av mikrobalansen (beregnet for hengende massemålinger) og throuGh et hull i testmassen. Bestem den tilsynelatende massen i luften, og sammenlign med målingen i trinn 3.3, korrigere etter behov for massen av linjen.
  5. Bestem volumet V (77 K) av testmassen ved T = 77 K ved å måle dens tilsynelatende masse i rent flytende nitrogen, m app i LN2 . Senk testmassen i flytende nitrogen i kobberkammeret til den er helt nedsenket. Når koking er opphørt måler du den tilsynelatende massen.
    MERK: Hvis det flytende nitrogenet i kobberkammeret er oppe og luftstrømmene mellom mikrobalansen og væskeflaten er minimale, kan denne massen måles til større enn ± 0,0002 g nøyaktighet.
  6. Anslår oppdriftskraften på den nedsenket delen av linjen, og kontroller at den er liten sammenlignet med målefeil.
  7. Beregn volum og tetthet av testmassen ved 77 K ved bruk av den kjente massen m og den målte tilsynelatende masse i LN2 ved 77 K, m app iN LN2, i henhold til følgende:
    ligningen
    Hvor p LN2 ( (77 K) = 0,807 g / ml.

4. Fremstilling av den første flytende N 2 -Ar-blanding

  1. Flow Ar gass med en strømningshastighet på ~ 2 l / min gjennom et spiralrør til utløpet. Plasser det spirede røret på toppen av de øvre stengene som stabiliserer kobberkammerets posisjon, like over væskenivået og under Dewar-toppflaten. Kald N 2 og Ar gass vil bygge opp over kryogen væsker, og termisk ledning, konveksjon og stråling vil avkjøle slangen og Ar gass inn.
  2. Etter at den spirede røret er avkjølt i 5 minutter, plasser rørets utløp i kobberkammeret, minst 10 cm under overflaten av flytende nitrogen. Deretter dekke Dewar med det ringformede lokket og det gjennomsiktige arket.
  3. Juster Ar-strømningshastigheten til Ar-boblene stigerFra rørutløpet til overflaten av flytende nitrogen. Deretter reduseres strømningshastigheten til boblene dannes ved utløpet, men oppløses eller fortynner like før du bryter den flytende nitrogenoverflaten.
    MERK: Når Ar-konsentrasjonen i kobberkammeret øker, må du regelmessig justere Ar-strømningshastigheten etter behov for å opprettholde boblingsformasjonen. Hvis Ar-strømningshastigheten er for lav, kan Ar fryse inne i røret og blokkere strømmen.
  4. Tilsett flytende nitrogen etter behov for å opprettholde nivået i den omkringliggende Dewar. Fjern is som akkumuleres på kalde overflater.
  5. Bland væsken regelmessig ved å sette et tynt ( f.eks . 35 mikron) sirkulært ark kobberfolie festet til en tynn isolasjonsstang inn i kobberkammeret, og sakte flytte den opp og ned som et stempel. Dette vil redusere konsentrasjonsgradienter og tendensen til Ar å krystallisere ut av løsningen.

5. Måling og justering av tetthet av den innledende N 2 -Ar-blandingenture

  1. Beregn måltettheten for N 2 -Ar-blandingen ved å estimere T = 77 K densiteten av prøven som måles, f.eks . Målinger ved høyere konsentrasjoner av prøveens ikke-vandige komponent.
  2. Fest testmassen ved hjelp av monofilamentlinjen til kroken på undersiden av mikrobalansmåleren, måle dens tilsynelatende masse i luften, og bekreft avtale med målingen i trinn 3.1.
  3. Bland N 2 -Ar-oppløsningen for å eliminere konsentrasjons- og tetthetgradienter som i trinn 4.5.
  4. Forkople testmassen til T = 77 K ved å senke den inn i det flytende nitrogenet utenfor kobberkammeret. Løft testmassen inn i det kalde laget av nitrogengass over det flytende nitrogenet, vent på rester av flytende nitrogen for å fordampe testmassen og senk deretter den kalde, tørre testmassen i N 2 -Ar-blandingen til den er helt nedsenket og Innen 2 cm av væskeoverflaten.
  5. m og T = 77 K volum V (77K) fra trinn 3.7 i henhold til følgende:
    ligningen
  6. Øk oppløsningens tetthet ved å strømme ytterligere Ar inntil ønsket initial tetthet er oppnådd. Eksempeldråper som synker kan lett gå tapt, slik at innledende tetthet skal være minst noen få prosent høyere enn forventet prøvetetthet. Prøven vil da flyte, noe som gjør det lettere å holde styr på det, og N 2 -Ar-blandetettheten må da bare justeres nedad ved å legge til væske N 2 .
  7. Fjern Ar-forkjølingsrullet rør og la det varme og tørke før neste bruk.

6. Køledråper med prøveoppløsning

  1. Umiddelbart før droppdispensering og avkjøling, gjenta trinn 1,5 til miX nitrogen / argon kryogen væske. Pass på å ikke introdusere noen bobler.
  2. Fjern prøverørets lufttette hette. Bruk en ren 1 ml sprøyte, ekstrak opp til 1 ml oppløsning, og sett på lokket. Fest en 27 til 33 G nål på sprøyten, og trykk deretter en liten mengde prøve gjennom nålen for å utelukke luft og rester fra tidligere dispensering.
  3. To metoder kan brukes til å projisere prøvedråper i N 2 -Ar-blandingen.
    1. For prøver med store ikke-vandige komponentkonsentrasjoner (> 45% w / w) som kan forglasses med beskjedne kjølehastigheter, trykk lett på sprøyten for å forskyve en liten diameter på 250 μm til 1 mm, ~ 10 nL til 1 μl dråpe Som henger fra nålespissen ved overflatespenning. Trykk forsiktig på nålen for å løsne og propp dråpen mot væsken N 2 -Ar-blandingen.
    2. For prøver som krever raskere avkjøling for vitrifisering, plasser utløpet til et gassrør koblet til en vakuumgeneratEller (levert av komprimert luft) i gassrommet over den flytende N 2 -Ar-blandingen, og forsiktig sug ut det kalde gasslaget som dannes. Dette øker kjølehastigheten for små prøver 11 .
      1. Ta forsiktig nålespissen til en 25-75 μm tykk, klar polymerstrimmel for å dispensere et lite volum (<10 nL, tilsvarende en dråpediameter <200 μm) av prøven.
        MERK: For å få de minste, nesten sfæriske og lettest fjernede dråpene, suge stripen i en hydrofob beleggingsløsning i 10 minutter og la den tørke før prøveutlevering.
      2. Ta tak i strimlen ved hjelp av en festet plast- eller trestang, og trykk stangen pluss strimlen manuelt inn i væsken N 2 -Ar-blandingen.
      3. Når dråpen har størknet og kokingen er opphørt, ta tak i stripekanten motsatt stangen ved hjelp av pinsett. Flekk stripen, hold den nedsenket i væsken N 2 -Ar, til prøven faller ut og flyter til surfeness.

7. Vurdering av prøvens tilstand

  1. Ved hjelp av et langt arbeidsavstand (5-10 cm) kikkertmikroskop og lys, kul belysning fra en lysdiode eller fiberoptisk belysning, undersøk forsiktig dråpen mens du holder den nedsenket i væsken N 2 -Ar. Forglassede dråper skal vises klare 12 , 13 . Avvis dråper som er tåke eller overskyet (sannsynligvis inneholder mer enn en fase) og / eller som viser optiske mangler, inkludert sprekker (som kan være forbundet med hulrom som endrer gjennomsnittlig tetthet).
    MERK: Maling av kobberkammerets innvendige overflate for å gi en svart bakgrunn kan lette identifiseringen av prøvefeil.

8. Bestemmelse av prøvens tetthet

  1. Den dispenserte dråpen vil i første omgang flyte, synke eller (sjelden) være nøytralt flytende i N 2 -Ar-blandingen.Flytende dråper kan noen ganger opprettholdes av overflatespenning, små bobler eller klæbende ispartikler. Kontroller hele dråpeflaten med mikroskopet. Forskyv dråpen nedover fra væskeflaten ved hjelp av en liten (2-3 mm diameter, 10 cm lang) forkjølt plast eller trestang og observer svaret.
  2. Hvis dråpen synker, øker tettheten til væsken N 2 -Ar ved å bruke fremgangsmåten i trinn 4 til dråpet blir nøytralt flytende eller flyter.
  3. Hvis dråpen flyter, reduser tettheten av væsken N 2 -Ar ved å tilsette flytende nitrogen ved hjelp av en 1,8 ml kryogen. Ved store innledende blandingsdensiteter (1,2-1,3 g / ml) gir tilsetning av N2 i trinn på 1 ml signifikante tetthetsendringer, men dette bør økes mot 5 mL ved lave tettheter (0,8-0,9 g / mL). Bland forsiktig N 2 -Ar (slik at du ikke mister sporet av dråpen) ved å bruke det tynne, perforerte kopperfoliearket opp og ned i kobberkammeret.
  4. Etter hver N 2 tillegg, Bruk en liten forkjølt stang for å forsiktig flytte den flytende dråpen nedover i væsken, og observer hastigheten når den kommer tilbake til overflaten.
  5. Når løsningsdensiteten er justert slik at dråpen ser ut til å være nøytralt oppdrift eller stiger veldig sakte (<50 μm / s, vil sikre ~ 0,1% eller bedre tetthetsnøyaktighet for dråper med volumer ned til 50 pL), måle N 2 - Ar blandetetthet som beskrevet i trinn 5. Deretter tilsettes ytterligere væske N 2 til dråpen først begynner å sakte synke og måle N 2 -Ar blandetettheten igjen. Disse to målinger vil gi grenser på droptettheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Densitetsmålinger ved T = 77 K for forglassede dråper med vandig glyserol og etylenglykol versus kryobeskyttende konsentrasjon er vist i henholdsvis figur 1 A og figur 1 B , og den tilsvarende endringen i spesifikt volum mellom T = 298 K og 77 K, beregnet ved bruk av tidligere Bestemt T = 298 K densiteter, er vist i figur 2 . Ved høye kryotbeskyttende konsentrasjoner avtaler løsningene ved avkjøling til forglasset tilstand, mens rent vann utvides. I nærheten av 20-25% vekt / volumløsninger av begge kryobeskyttende midler forventes det ikke å vises noen ekspansjon eller sammentrekning. Hellingen av volumendringen i forhold til konsentrasjonen har den største størrelsen under 40% vekt / vekt, hvor virkningen av ekstra kryoskyddsmiddel på vannets tetrahedriske lavtemperaturstruktur er mest uttalt.

Figur 1
Figur 1: Viturgassfase T = 77 K Densitet Versus Kryoprotektant Konsentrasjon . T = 77 K tetthet mot konsentrasjon for forglassede vandige dråper inneholdende ( A ) glyserol og ( B ) etylenglykol. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM på tre individuelle dråper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Endring i bestemt volum på kjøling fra væske ved 298 K til glasfase ved 77 K. Prosent volumendring ved kjøling fra 298 K til 77 K for vandig oppløsningGlycerol og etylenglykol. T = 298 K oppløsningsdensiteter er oppnådd fra tidligere målinger 14 , 15 . Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM på tre individuelle dråper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foreliggende apparat og fremgangsmåter, utviklet primært av undergraduates med begrenset tilgang til instrumentbyggende verktøy og maskiner, leverer likevel svært nøyaktige tetthetsmålinger for individuelle væskedråper så små som 50 pL. I konsentrasjonsområdet i nærheten av og over 50% vekt / vekt, hvor små kjølehastigheter er tilstrekkelige for å oppnå forglassede prøver, stemmer densitetene med de som er oppnådd i tidligere målinger på bulkprøver. Ekstrapoleringer av nåværende tetthet til 0% konsentrasjon - rent vann - er også ganske godt enige med den aksepterte tettheten av amorf is med lav densitet ved 77 K 9 .

Generering av N 2 -Ar-blandingene som kreves mellom 30 min og 5 h Ar-strømning, avhengig av den endelige N 2 -Ar-tettheten som trengs for å gjøre en gitt dråpesammensetning nøytralt flytende. Denne tiden kan reduseres ved å bruke en diffusor eller flere gassrør for å øke overflaten for Ar mixinG i kryogen væske. Justering av N 2 -Ar-tettheten til en dråpe er fastslått å være nøytralt oppdrift, kan også være tidkrevende, spesielt for små radius ( r ) dråper som har små terminalhastigheter ( ligningen R 2 ) og så krever mer forsiktige observasjoner. N 2 -Ar-blandingen har en tendens til å utvikle en vertikal tetthet / sammensetning gradient, og det må derfor regelmessig blandes. Følgelig kan bestemmelse av et enkelt glassfase-tetthetspunkt for en gitt løsningsmiddeltype og konsentrasjon, som krever målinger på minst 3-5 dråper, ta flere timer.

Ved hver konsentrasjon måles tetthetene av to eller tre dråper typisk. Tettheten av hver dråpe er beregnet som gjennomsnittet av de målte øvre og nedre grensene på tettheten, gitt av den største målte N 2 -Ar-tettheten som gjorde dråpevasken og den minste tetthet som gjorde det flyte. Siden både en tett øvre bunn og en tett nedre bunn - hvor tetthet vurderes av stigningshastigheten eller nedstigningen - ikke alltid oppnås i mål på en gitt dråpe ( f.eks . Kan dråpen gå tapt under blanding), målinger På dråper med samme konsentrasjon og størrelse ble det noen ganger samlet i et enkelt tetthetsestimat.

For å redusere eksperimenttider ble det forsøkt å forberede og lagre N2-Ar blandinger med høy tetthet i kryogene lagringsbeholdere for bruk en til tre dager senere. I alle tilfeller krystalliserte Ar ut av løsningen og væsketettheten reduserte med lagringstid. Ar-størkning og flytende tetthetsdråper oppstod også under dråpedensitetsmålinger hvis væsken N2-Ar ikke ble regelmessig blandet.

En stor utfordring i disse målingene minimerer frosting og isdannelse. Vanndampkondensasjon, isdannelse og isakkumulering påPrøvekjølingskammer på andre kalde overflater i den kalde gassen over N 2 -Ar-blandingen, og i N 2 -Ar-blandingen kan det selv kontaminere prøver som brukes i tetthetsmålinger, fremme iskjerning i dem og endre deres tilsynelatende tetthet. Is på prøven og flytende på og i den flytende N 2 -Ar-blandingen kan gjøre det vanskelig å vurdere prøvenes lave temperaturtilstand (glass eller polykrystallinsk). For å minimere isdannelsen må du regelmessig kontrollere alle kuldeflater for is. Fjern eventuelt isen mekanisk eller bruk varm, tørr N 2- gass. Hvis isen akkumuleres i kobberkammeret, fjern det med en fin maskeringsskjerm, ellers fjern, tøm, tørk og fyll på kammeret.

Den minimale (kritiske) kjølehastigheten som kreves for å oppnå en forglasset prøve, øker med redusert oppløsningskonsentrasjon, nærmer seg 10 6 K / s for rent vann 7 . Prøvekjølingshastigheten avhenger av form og størrelse på dråpe (økAsing med avtagende diameter), hastigheten med hvilken dråpen projiseres inn i væskekryogenet, tilstedeværelsen av kald gass over væskekryogenet (som vanligvis reduserer kjølehastighetene) og egenskapene til væskekryogenet. Generelt trenger kjølehastigheter større enn 1000 K / s dråper med volum (diametre) mindre enn ~ 1 nL (~ 100 μm).

Den laveste konsentrasjonen av løsningsmiddel eller kryotbeskyttelsesmiddel, for hvilken glassdensiteter kan måles, bestemmes av maksimale dråpekjølingshastigheter, og ved de minste størrelsesdråper som det visuelle analysen for vitrifikasjon kan benyttes pålitelig på. Kjølehastigheten kan økes med en faktor på ~ 5 ved å avkjøle prøver i væskepropan eller en flytende propan-etanblanding. I motsetning til flytende N 2 har disse kryogene væskene en stor separasjon mellom kokende og smeltetemperaturer, og kan dermed absorbere mye mer varme uten varmeoverføringsbegrensende overflatekoking. Avkjølte dråper kan da overføres til N2-ArBlanding for tetthetsmålinger. Overgangen fra klare dråper til uklare eller overskyede dråper er brått, som forekommer over et smalt område av løsemiddelkonsentrasjon (omtrent 2% vekt / vekt) og kjølehastighet, og har vært korrelert med utseendet isringene i røntgendiffraksjonsmønstre 16 , 17 . Imidlertid blir nøyaktig visuell klarhetsvurdering vanskeligere ettersom dråpevolumene reduseres mot 10 pL.

Det tilgjengelige spekteret av prøvetettheter ved bruk av N2 -Ar-blandinger settes av tetthetene av de rene væsker, henholdsvis 0,81 g / ml og 1,40 g / ml. Flytende Ar-Kr-blandinger er utsatt for Kr-krystallisering, men kan brukes til å forlenge dette tetthetsområde, forutsatt at væskene ble blandet konstant.

Fremgangsmåtene beskrevet her er bredt anvendbare for å bestemme tettheter av vandige blandinger, celler, celleaggregater, andre biologiske materialer og andre systemer hvor små prøver ogStore kjølehastigheter kreves for å oppnå ønsket lavtemperaturfase. Disse tetthetene vil være nyttige i forståelse og minimering av prøveskade i kryopreservering, og for å forstå oppførselen av vann i vandige løsninger og i trange og overfylte miljøer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSF under prisen MCB-1330685. DWM anerkjenner delvis støtte fra Cornell Universitys Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 L/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. 21-82 (2015).
  2. Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. 439-454 (2014).
  3. Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58, (3), 459-471 (2002).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311, (4), 851-862 (2001).
  5. Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37, (2), 105-119 (2004).
  6. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66, (4), 366-373 (2010).
  7. Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110, (1), 15703 (2013).
  8. Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59, (4), 697-708 (2003).
  9. Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115, (48), 14167-14175 (2011).
  10. Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72, (6), 742-752 (2016).
  11. Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39, (6), 805-811 (2006).
  12. McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35, (5), 538-545 (2002).
  13. Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38, (3), 412-419 (2005).
  14. Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20, (12), 1377-1379 (1928).
  15. Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40, (11), 1863-1873 (2011).
  16. Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39, (2), 244-251 (2006).
  17. Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104, (1), 227-236 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics