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Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Biochemistry
 

Summary

Strutture di assiemi di proteina supramolecolari a risoluzione atomica sono di grande rilevanza a causa della loro un ruolo cruciale in una varietà di fenomeni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire studi strutturali ad alta risoluzione su assiemi di proteina insolubile e non cristallini macromolecolari di magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR MAS).

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Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

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Abstract

Gli assembly supramolecolari proteina giocano un ruolo fondamentale nei processi biologici che vanno dall'interazione ospite-patogeno, infezione virale alla propagazione di malattie neurodegenerative. Tali assemblee consistono in più subunità proteiche organizzata in un modo non-covalenti per formare grandi oggetti macromolecolari che possono eseguire una varietà di funzioni cellulari o causare conseguenze dannose. Intuizioni atomici dei meccanismi di assemblaggio e il funzionamento di tali assembly macromolecolari spesso rimangono scarse dal loro insolubilità intrinseca e non-cristallinità spesso drasticamente riduce la qualità dei dati ottenuti dalla maggior parte delle tecniche utilizzato in biologia strutturale, come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione. Presentiamo qui la spettroscopia NMR allo stato solido di angolo di magia filatura (SSNMR) come un potente metodo per indagare strutture macromolecolari assembly a risoluzione atomica. SSNMR può rivelare dettagli atomici del complesso assemblato senza limitazioni di dimensioni e solubilità. Il protocollo presentato qui descrive i passi essenziali dalla produzione di 13C / assembly proteina macromolecolari isotopo-labeled15N per l'acquisizione di spettri SSNMR standard e loro analisi e interpretazione. Ad esempio, mostriamo la pipeline di un'analisi strutturale di SSNMR di un assemblaggio di proteine filamentose.

Introduction

I progressi nella magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR) offrono un efficace strumento per la caratterizzazione strutturale delle assemblee di proteina macromolecolari a una risoluzione atomica. Questi assembly di proteina sono onnipresenti sistemi che svolgono un ruolo essenziale in molti processi biologici. Le strutture molecolari, interazioni e dinamiche sono accessibili dagli studi SSNMR, come è stato dimostrato per virale (capsidi1) e meccanismi di infezione batterica (secrezione sistemi2,3, pili4), membrana proteina complessi5,6,7,8 e funzionale amiloidi 9,10,11. Questo tipo di assemblaggio molecolare può anche provocare patologie come ad esempio nelle malattie neurodegenerative dove proteine assemblare negli stati misfolded, amiloide e causano un comportamento aberrante delle cellule o delle cellule morte 12,13. Assembly di proteine sono spesso costruiti dall'oligomerizzazione simmetrica di copie multiple di subunità proteiche in oggetti grandi supramolecolari di varie forme tra cui fibrille, filamenti, pori, tubi o nanoparticelle. L'architettura quaternario è definita da interazioni deboli tra subunità proteiche per organizzare l'Assemblea spazio e temporale e per consentire sofisticate funzioni biologiche. Indagini strutturali scala atomica su questi assembly sono una sfida per le tecniche ad alta risoluzione dal loro insolubilità intrinseca e molto spesso loro cristallinità-non limita l'uso di convenzionale cristallografia a raggi x o soluzione NMR si avvicina. Angolo di magia filatura SSNMR (MAS) è una tecnica emergente per ottenere dati di risoluzione atomica su assembly macromolecolari insolubile e ha dimostrato la sua efficacia per risolvere modelli 3D atomiche per un numero crescente di sistemi biomolecolari complessi tra cui filamenti batterici, assemblee dell'amiloide e particelle virali 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Progressi tecnici su alti campi magnetici, sviluppi metodologici e preparazione del campione ha stabilito SSNMR MAS in un robusto metodo per studiare le proteine insolubili in vari ambienti, in particolare nel loro biologicamente rilevanti macromolecolari assemblati statali o nelle membrane cellulari, rendendo la tecnica altamente complementari per cryo-microscopia elettronica. In molti casi, un altissimo grado di simmetria caratterizza tali assemblee di proteina. MAS SSNMR sfrutta questa caratteristica, come tutte le unità secondarie della proteina in un assembly di inerti avrebbe la stessa struttura locale e quindi praticamente la stessa firma SSNMR, riducendo drasticamente la complessità dell'analisi.

Un efficiente protocollo per studi strutturali delle assemblee di proteina macromolecolari di MAS moderata (< 25 kHz) SSNMR è presentato in questo video e può essere suddivisa in diverse fasi (Figura 1). Mostreremo le fasi critiche del flusso di lavoro di uno studio strutturale SSNMR esemplificato su un assembly di proteine filamentose (Vedi evidenziato i passaggi nella Figura 1), con l'eccezione di purificazione della proteina di subunità, differenti per ogni proteina Assemblea ma di fondamentale importanza per gli studi strutturali e senza entrare nei dettagli tecnici/metodologico di calcolo di spettroscopia e struttura SSNMR per quale tutorial specializzati sono disponibili online. Mentre il presente protocollo si concentrerà principalmente su esperimenti NMR allo stato solido eseguiti in condizioni di MAS, l'uso di allineati ambienti biologici 23,24,25,26 , 27, ad esempio bicelles allineato, consentire per l'indagine di conformazione della proteina e interazione dinamica proteina-proteina membrana-come media senza tecnologia MAS. Vi mostreremo l'espressione della proteina e fasi di montaggio, nonché la registrazione di spettri SSNMR cruciali e loro analisi e interpretazione. Il nostro obiettivo è quello di fornire le comprensioni nella pipeline di analisi strutturale che permette al lettore di eseguire uno studio strutturale di risoluzione atomica di un assembly macromolecolare mediante tecniche di SSNMR.

Il protocollo comprende 3 sezioni:

1. la produzione del campione NMR a stato solido

Come un prerequisito per un'analisi NMR allo stato solido, le componenti proteiche della necessità di essere espressa assemblaggio macromolecolare, isotopo-etichettati, purificata e assemblati in vitro nello stato nativo-come complesso (per vedere un esempio nella figura 2) . Per garantire alta sensibilità di NMR, arricchimento dell'isotopo 13C e 15N etichettatura è necessario attraverso l'uso di media minima espressione batterica completati con 13C e 15N fonti, come uniformemente 13 C-etichetta glucosio/glicerolo e 15NH4Cl rispettivamente. Nella fase successiva del protocollo, selettivamente 13C-etichetta campioni prodotto con selettivamente 13fonti C-etichettato come (1,3 -13C)- e (2 -13C)-glicerolo (o (1 -13C)- e (2 -13C)- glucosio) vengono utilizzati per facilitare l'analisi NMR. Misto con etichettato campione corrispondente una miscela equimolare di 50% 13C-etichetta o 50% e 50% 15N - (1,3 -13C)- e il 50% (2 -13C)-glucosio sono stati introdotti per descrivere l'individuazione di intermolecolari interazioni farmacologiche. Un elevato grado di purezza della proteina, nonché a rigorose condizioni durante la fase di assemblaggio sono fattori chiave per assicurare un ordine strutturale omogeneo del campione finale.

2. preliminare caratterizzazione strutturale basata su NMR allo stato solido di unidimensionale (1D)

Vi presentiamo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale di SSNMR. Unidimensionale (1D) cross-polarizzazione (CP) e inetto / RINEPT28 gli esperimenti, rilevati su nuclei di 13C sono utilizzati per rilevare segmenti rigidi e flessibili della proteina nell'Assemblea, rispettivamente e di stimare il grado di strutturale omogeneità e polimorfismo locale (per vedere un esempio nella figura 3).

Rong > 3. Determinazione della struttura analisi conformazionale e 3D

Paragrafi 1 e 2 riguardano l'analisi conformazionale, che si basa sull'assegnazione di risonanza del SSNMR rigida tutti i residui dell'Assemblea della proteina, come gli spostamenti chimici sono sonde molto sensibile all'ambiente locale e possono essere usati per predire il phi/psi diedro angoli e quindi determinare la struttura secondaria. La figura 4 illustra un esempio di un'assegnazione di risonanza sequenziale nell'anima rigida di un assemblaggio di proteine. La determinazione della struttura 3D è basata sulla raccolta di dati strutturali, ad esempio vincoli di distanza codifica chiudere vicinanze (< Å 7-9), che contiene sia intra - e intermolecolari informazioni. Interpretazione e a lungo raggio ritenuta distante collezione descrivono sottosezioni 3 e 4. Contatti a lungo raggio sono definiti come intramolecolare 13C -13C vicinanze derivanti da residui da i a j, con | i-j | ≥ 4, definendo quindi la piega terziaria della proteina dell'unità secondaria monomerica, o come intermolecolari 13C -13C vicinanze, definendo le interfacce intermolecolari tra subunità proteiche nell'assembly. Intra - e intermolecolari interfacce sono illustrate nella Figura 5. Vincoli SSNMR rilevato attraverso 13C -13C e 15N -13C accoppiamento esperimenti solitamente codificano per distanze internuclear < 1 nm. Sottosezione 4 spiega l'individuazione dei vincoli di distanza intermolecolare. Negli assembly di proteina simmetrico, l'uso di campioni etichettati in modo omogeneo (cioè 100% uniformemente o selettivamente con l'etichetta) per identificare interazioni intermolecolari subunità-unità secondaria è limitato, come entrambi intra - e inter - molecolari contatti portano a segnali rilevabili. L'individuazione univoca di vicinanze intermolecolari è ottenuta utilizzando campioni etichettati misti, contenenti una miscela equimolare di due campioni etichettati in modo diverso, combinato prima dell'aggregazione. Sottosezione 5 introduce brevemente la modellazione della struttura.

Figure 1
Figura 1 : Flusso di lavoro di uno studio strutturale di risoluzione atomica di NMR allo stato solido. 13 C, 15N isotopo etichettato produzione di proteine, purificazione di subunità, assemblaggio di subunità, controllo della formazione di assemblaggio, esperimenti SSNMR, SSNMR esperimento analisi e l'estrazione dei vincoli di distanza e modellazione della struttura sono indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. frangivento campione NMR allo stato solido

  1. produzione di uniformemente 13 C / 15 N-labeled subunità
    1. uso appena trasformato, pET24-peptide-6I plasmide contenente E. coli BL21 (DE3) cellule, raccoglierle dalla piastra di agar preparata.
    2. Inoculare una pre-cultura 15 mL di pre-riscaldato LB medium con una colonia. Incubare a 37 ° C con agitazione di 200 giri/min durante la notte.
    3. Trasferire la pre-cultura in 1 L della coltura principale del pre-riscaldato M9 mezzo (Vedi composizione nella tabella 1), contenente i sorgenti di carbonio e azoto richiesti isotopo-labeled.
      Nota: Questa può essere uniformemente 13 glucosio marcato C, in modo selettivo (1 - 13 C)- o (2 - 13 C)-etichettato glucosio 29 , 30 , 31 o ( 1,3 - 13 C)- o (2 - 13 C)-etichettato glicerolo 32 , 33.
    4. Questo Incubare a 37 ° C e misurare il OD 600 appena la cultura diventa torbida. Quando il OD 600 ha raggiunto un valore di 0,8, inducono l'espressione di proteine con 0,75 mM IPTG per 4 h.
      Nota: Le condizioni di induzione ottimale possono variare da una proteina ad un altro.
    5. Recuperare le cellule mediante centrifugazione per 30 min a 6000 x g e 4 ° C.
  2. Purificazione di schizzo (non mostrato nel protocollo dei video)
    1. lisare cellule utilizzando tecniche standard come trattamento di sonicazione o lisozima e purificare la subunità proteica utilizzando tecniche stabilite o adattati per le studiato montaggio proteina.
      Nota: La proteina può essere espressa in corpi di inclusione, controllare per la localizzazione della proteina di lisi delle cellule e successiva centrifugazione. Se la proteina è trovata nel sedimento con i detriti cellulari, è stato accumulato in corpi di inclusione.
    2. Test di espressione e la purezza del campione della proteina per esempio di un standard 12-15% Tris-Tricine SDS-PAGE, vedere Figura 2A. Se la purezza è sufficiente, la proteina può essere montata, in caso contrario eseguire una fase di purificazione supplementare.
  3. In vitro assemblaggio dei filamenti della proteina
    1. controllare la concentrazione di proteine in soluzione purificata. Se la proteina contiene residui assorbente, misurare l'assorbimento in uno spettrofotometro UV a 280 nm. Inserire il buffer puro lo spettrofotometro come taratura e quindi misurare l'assorbanza di proteina.
    2. Calcolare la concentrazione di proteina utilizzando il coefficiente di assorbimento della subunità della proteina con la legge di Lambert-Beer adattata: un λ = ε λ x l densità x c; qui A è l'ottica a un determinata lunghezza d'onda λ; ε è il coefficiente di assorbimento specifico; l è la lunghezza della traiettoria ottica in cm; c è la concentrazione in mol/L.
    3. Concentrare la proteina ad una concentrazione di 1 mM in un'unità filtro centrifugo. Introdurre il campione nell'unità filtro centrifugo e centrifugare a 4000 x g per 30 min, mescolare la soluzione nell'unità filtro delicatamente con una pipetta per evitare la deposizione di proteine nel filtro. Ripetere la procedura fino a quando non viene raggiunta la concentrazione desiderata.
      Nota: La concentrazione di montaggio ottimale dipende dal sistema e deve essere ottimizzato (solitamente tra 0,1 - 1 mM). Se un equimolare mescolato con etichetta campione di due lotti di diverse proteina marcata è preparato (ad es. (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-etichettati), miscelazione deve avvenire prima o subito dopo il passaggio di concentrazione per garantire omogeneizzazione della soluzione mista.
    4. Trasferire il campione in una provetta e viene quindi incubato sotto agitazione per una settimana a temperatura ambiente.
    5. Solitamente la polimerizzazione delle subunità in filamenti è accompagnato dalla soluzione diventa torbida. Verificare la morfologia microscopica della fibrilla e omogeneità per esempio da microscopia elettronica (ingrandimento 6300 X - 45000 X), vedere Figura 2B.
    6. Centrifugare il campione per 1 h a 20000 x g e 4 ° C. Rimuovi la maggior parte del surnatante, lasciare solo abbastanza liquido per coprire la superficie per evitare l'essiccazione del campione. Verifica il surnatante per subunità non assemblato sullo spettrofotometro UV.
    7. Lavare il campione con l'aggiunta di H 2 O e attenta risospendere il contenuto con una pipetta. Non centrifugare. Girare il campione per 30 min a 22000 x g e 4 ° C. Ripetere il passaggio di lavaggio 3 volte. Verifica durante tutte le fasi di lavaggio, se la pallina conserva l'aspetto dopo la centrifugazione e verifica il surnatante per subunità non assemblato sullo spettrofotometro UV.
    8. Aggiungere 0.02% (p/v) di sodio azide (NaN 3) per evitare la contaminazione batterica e conservare il campione fino alla misura a 4 ° C.
  4. Rotore NMR allo stato solido riempimento
    1. centrifugare due volte per 30 min a 22000 x g e 4 ° C. Remove importo massimo del surnatante; la consistenza del campione risultante dipende l'assembly di proteina ed è solitamente un simil-gel deposito.
    2. Utilizzare una pipetta capillare per inserire il campione nel rotore SSNMR.
      Nota: Qui, presentiamo la procedura su un rotore di diametro 4 mm. Centrifuga
      1. centrifuga del rotore su una tabella per introdurre delicatamente il campione nel rotore. Ripetere la procedura fino a riempire il rotore. Mantenere lo spazio minimo per chiudere il rotore con il cappuccio del rotore. Se la quantità di campione non è sufficiente, introdurre un inserto disponibile in commercio per riempire lo spazio rimanente per garantire l'omogeneità di distribuzione del campione nel rotore.
        Nota: In funzione della consistenza del campione assemblato, potrebbe essere più adeguato da utilizzare una spatola sottile, soprattutto per campioni molto densi. Rotori con un diametro di 2,5-4 mm sono usate alle frequenze di moderata MAS.
    3. Aggiungere tracce di acido 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) per la calibrazione di shift e temperatura chimica interna.
    4. Chiudere il tappo con un dispositivo di chiusura.
    5. Controllare sotto una lente d'ingrandimento, se il tappo è ben inserito e completamente chiuso.

Figure 2
Figura 2: rappresentante risultati per purificazione della proteina dell'unità secondaria e montaggio. A) 15% Tris-tricine SDS-PAGE delle subunità della proteina (compreso il suo 6-tag) in diverse fasi di purificazione. Lane 1 - marker di peso molecolare della proteina; corsia 2 - e. coli BL21 (DE3) cellule controllo uninduced; Vicolo 3 - e. coli BL21 (DE3) cellule indotte con 0,75 mM IPTG; corsia 4 - solubilizzato corpi di inclusione vicolo 5 - surnatante frazioni della cella lysata; corsia 6 - frazione purificata dopo nichel immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo (IMAC) FPLC e dissalazione. B) macchiato negativamente fibrille della proteina da formazione immagine TEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. preliminare caratterizzazione strutturale basata su NMR allo stato solido di unidimensionale (1D)

  1. set-up iniziale e 1 D cross-polarizzazione (CP)
    1. inserire il rotore nel magnete NMR
    2. iniziare a Spin il rotore ad una frequenza di 5 kHz e attendere una stabilizzazione del ± 10 Hz, quindi accelerare fino a 7 kHz. Sintonizzare e abbinare 1 H, 13 C e 15 N canali. Regolare la temperatura di 2-10 ° C (275-283 K); esempio di riscaldamento a 7 kHz MAS è basso e regolazione della temperatura non è solitamente necessario a questa frequenza MAS.
    3. Registrare un singolo-pulsato 1D 1 H spettro usando 16 scansioni.
      Nota: Livelli di potenza devono essere precedentemente stati ottimizzati su un composto di riferimento (ad esempio un 13 C / < sup > 15 N istidina o glicina), per fornire valori di partenza per ottimizzare i livelli di potenza negli esperimenti sull'esempio della destinazione; Questa procedura è un compito di routine e quindi fuori dell'ambito in questo protocollo.
    4. Mantenere la temperatura durante tutti gli esperimenti tra 2-10 ° C, in campioni idratati che la temperatura si riflette nello spostamento relativo della risonanza alla rinfusa acqua 1 H per quanto riguarda il segnale DSS 34. Misurare la temperatura dopo il rapporto δ (H 2 O) = 96,9/7,83-T con una precisione di 1-2 ° C 35.
    5. Frequenza MAS
    6. set up la desiderata e attesa fino alla stabilizzazione di ± 10 Hz.
      Nota: Qui è dimostrato per una frequenza di 11 kHz.
    7. Tune e partita 1 H e 13 C canali nuovamente e regolare la temperatura con l'aiuto di un esperimento di 1 H 1 D.
    8. Impostare un 1D 1 H - 13 C CP 36.
      Nota: CP esperimenti mostrano i segnali derivanti dai residui in una conformazione rigida. Calibrazione di impulso e disaccoppiamento parametri può essere ottimizzati direttamente sul campione quando la sensibilità è abbastanza alta per osservare i segnali dopo meno di 32 ~ scansioni. I valori di ottimizzazione iniziale sono rilevati dall'ottimizzazione standard su un composto di riferimento. Tempo di contatto di CP e livelli di potenza sono scelti basati su intensità massima del segnale. Nei campioni della proteina, il tempo di contatto ottimo di CP è di solito tra 200 µs e 2 ms i disaccoppiamento parametri devono essere ri-rettificati dalla taratura su un composto di riferimento.
      1. Osservare attentamente la localizzazione di filatura bande laterali alla determinata frequenza MAS.
    9. Registrare un spettro di riferimento 1D 13 C CP che funge da impronta spettrale 1D. Parametri tipici sono 128 scansioni, ms 1 tempo di contatto CP, 100 kHz disaccoppiamento forza, un ritardo di riciclo di 3 s e 25 ms di acquisizione.
    10. Calibrare il 1 H e 13 C spostamenti chimici seguendo le raccomandazioni di IUPAC 37. Determinare la frequenza di risonanza del segnale H DSS 1 (spostamento chimico di 0 ppm); 13 C gli spostamenti chimici fanno riferimento agli spostamenti di 1 H (solitamente ~ 0.25144, derivato dal rapporto di 13 C per la frequenza di risonanza 1 H 37).
    11. Processo 1D 1 H - 13 C CP sperimentare senza apodizzazione funzione (Vedi Figura 3A e B per la rilevazione su un assemblaggio di proteine in modo omogeneo ben ordinato). Scegliere un picco isolato per stimare il linewidth nel campione, indicativo di omogeneità e di ordine strutturale. Tipico 13 C linewidths per assemblee di proteina biologica ben ordinata sotto MAS ad alti campi magnetici compresa tra 20-150 Hz (misurata come la larghezza piena a metà altezza (FWHH)).
    12. Stimare il rapporto segnale-rumore (S/N) nello spettro CP.
      Nota: Il rapporto S/N dipende da molti fattori, tra cui principalmente la quantità di campione nel rotore, il grado di rigidità della struttura della proteina e la presenza di una singola conformazione molecolare. Come regola generale, un campione dovrebbe essere adatto per spettroscopia multidimensionale di SSNMR se un segnale è osservato in un ottimizzato 1D 1 H - 13 C CP spettro registrato con 64 scansioni.
    13. Zoom nella regione spettrale delle risonanze del carbonilico proteina spina dorsale (principalmente) localizzato tra 165-180 ppm. Stimare il contenuto di struttura secondaria dell'assembly dalla posizione delle risonanze del carbonilico proteina spina dorsale con risonanze da residui in α-elica o β-strand di conformazione spostato downfield o upfield, rispettivamente (vedere Figura 3B per una subunità α-elica per lo più) 38.
  2. 1D INEPT sperimentare
    1. istituito un 1 D 1 H - 13 C inetto esperimento per sondare le parti altamente mobili (sub-µs) dell'assembly proteina.
      Nota: GARP disaccoppiamento di qualche kHz durante acquisizione 39 viene comunemente utilizzato, per consentire per brevi ritardi interscan (in genere 1 s) senza danneggiare la sonda.
    2. Registrare uno spettro di riferimento inetto che serve come impronte digitali per i segmenti di proteina mobile; parametri tipici sono 128 scansioni e un tempo di acquisizione di 25 ms.
    3. Il 1 H - 13 C inetto processo esperimento. La quantità e le posizioni dei segnali sono indicative della quantità di residui cellulari e composizione in amminoacidi rispettivamente.
      Nota: Registrare anche un 2D 1 H - 13 C inetto esperimento se i segnali sono presenti nello spettro inetto 1D (per un esempio, vedere Figura 3) per permettere un'identificazione più specifica dell'aminoacido. Nei casi di assegnazione ambigua, si consiglia di controllare le posizioni di segnale componente buffer dalla soluzione NMR.
    4. Utilizzare il database sono 40 e pubblicato dati 38 per assegnare le risonanze al loro amminoacido corrispondente nel vicino a conformazione bobina casuale; lo spettro contiene solo i componenti mobile buffer se non i residui sono in un regime altamente mobile.

Figure 3
Figura 3: risultati rappresentativi di Acquisizione di spettri SSNMR per un assemblaggio di proteine ben strutturato. A) 13 C-rilevato FID di un esperimento di cross-polarizzazione di 1 H - 13 C. Esperimento di cross-polarizzazione 13 C 1 H - B). C) 1 H - 13 C inetto esperimento di un'Assemblea di proteina rigida; solo componenti del buffer sono visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. determinazione della struttura analisi conformazionale e 3D

  1. assegnazione sequenziale risonanza
    1. istituito un 2D 13 C - 13 C diffusione di spin del protone-driven (DPSS) 41 esperimento per rilevare correlazioni di 13 C 13 C - intra-residuo, tra cui catene laterali. Assumere i valori per il passo di croce-polarizzazione iniziale 1 H - 13 C da 1 D 1 H - 13 esperimento C CP.
      1. Impostare il tempo di miscelazione di 50 ms per uniformemente 13 C-etichetta campioni e di 100 ms per selettivamente 13 campioni marcato C. Impostare il tempo di acquisizione indiretta tra 5-25 ms e l'acquisizione diretta tra 15-25 ms dipendono dalla risoluzione spettrale intrinseca, che può essere stimata mediante il segnale visibile nella lunghezza Free Induction Decay (FID) (esemplificato in Figura 3A).
      2. Diversi parametri di elaborazione per trovare valori ottimali rispetto al segnale-rumore e risoluzione nello spettro di test, in genere un'adeguata elaborazione può essere raggiunto utilizzando una funzione di finestra di qsine con uno spostamento di bell sinusoidale (SSB) di 2.5-4.
    2. Set up, record e processo un 2D 13 C - 13 C DPSS con un esperimento di tempo miscelazione intermedia per rilevare correlazioni sequenziale 13 C - 13 C collegamento principalmente i - i±1, ma anche i±2 e i±3 residui, a seconda della proteina spina dorsale rigidità ed elementi di struttura secondaria. Il tempo di miscelazione deve essere impostato tra 100-200 ms per campioni etichettati in modo uniforme. Tutti gli altri valori possono essere rilevati dal breve miscelazione tempo 2D 13 C - 13 C DPSS.
    3. Impostare, record e processo un 2D 15 N - 13 C N i CA io e N i CO io esperimento utilizzando un CP 1 H - 15 N e un trasferimento di 13 C 15 N - CP specifico 42. ottimizzare il trasferimento di polarizzazione di 13 C 15 N - in modo 1D direttamente sul campione di interesse, basata sull'intensità massima della regione CA o carbonilico, rispettivamente. Typii valori di CAL per il tempo di contatto specifico di CP sono tra 2-6 ms.
    4. impostare, record e processo una serie di 2D 15 N-(13) C - 13 C esperimenti per lo scopo di assegnazione.
      Nota: Il valore di parametro di primo di 15 N - 13 C polarizzazione trasferimento può essere rilevato dai N i CA ho / N ho CO ho esperimenti. Le correlazioni intra-residui sono stabilite da N ho (CA mi) CB ho e N ho (CA mi) CO io, utilizzando rispettivamente sogno 43 e DPSS 13 C - 13 C trasferimenti di polarizzazione. La connettività sequenza (i-1) residuo (i) a residuo è ottenuta da N ho (CO i-1) CA i-1 e N ho (CO i-1) CX i-1 esperimenti, sia utilizzando un DPSS 13 C - 13 C trasferimento di polarizzazione.
    5. Scegli un NMR programma di analisi quali CcpNmr analisi 44 o SPARKY 45
    6. Caricare gli spettri 2D nel software (esemplificato con analisi CcpNmr) e caricare la sequenza primaria della proteina.
    7. Iniziare con l'identificazione dei tipi dell'amminoacido visibili nel breve-miscelazione 13 C - 13 spettro C DPSS. Collegare gli atomi di carbonio dei sistemi di rotazione per consentire il " residuo-tipo " assegnazione specifica; Vedi Figura 4A per l'assegnazione di un residuo di treonina. Identificare i residui come molti come possibile; Questo dipenderà la dimensione dell'unità secondaria della proteina, la risoluzione spettrale e dispersione.
    8. Overlay breve-miscelazione con lo spettro di intermedio-miscelazione 13 C - 13 C DPSS.
      Nota: I picchi supplementari visibili nel DPSS intermedio-miscelazione derivano principalmente da sequenziale (residuo i - residuo i±1) contatti. Un esempio per un'assegnazione sequenza di due-residuo è illustrato in Figura 4B.
      1. Contrassegnare i picchi di risonanza di un sistema di rotazione e trovare correlazioni nel DPSS intermedio-miscelazione con frequenze di risonanza di altri sistemi di spin. In piccole proteine o peptidi, può essere possibile ottenere l'assegnazione di risonanza sequenziale intero basato su esperimenti di DPSS 2D 13 C - 13 C.
        Nota: In residui motivi di β-strand struttura secondaria contatti 13 C i - residuo i±2 13 C - potrebbero mostrare segnali più intensi rispetto sequenziale contatti a causa della loro vicinanza nello spazio; nel residuo di motivi di α-elicoidale struttura secondaria contatti 13 C i - residuo i±3 13 C - possono anche portare a segnali intensi.
    9. Se intermedio-miscelazione DPSS esperimenti su selettivamente marcato C 13 campioni sono disponibili, rivestirai sullo spettro breve di miscelazione (se disponibile sul selettivamente 13 C-etichetta campione) e assegnare il supplementare picchi, prendendo in considerazione l'etichettatura selettiva 13 C modello (1,3 - 13 C e 2 - 13 C glicerolo 32 , 33 o 1 - 2 13 C glucosio e 13 C 29 , 30 , 31.
      Nota: ad esempio, in un 2 - 13 C glicerolo etichettato campione diversi tipi di aminoacidi sono etichettati sulla posizione Cα senza i carboni adiacenti (Cβ e C ') con l'etichetta, favorendo pertanto la Cα-Cα trasferimento tra residui adiacenti. In campioni etichettati in modo selettivo, le correlazioni a lungo raggio 13 C - 13 C potrebbero costruire già intermedio-miscelazione 13 C - 13 C DPSS esperimenti. Se un picco non può essere spiegato da una correlazione sequenza, potrebbe presentare da un contatto a lungo raggio. Per subunità omogeneo strutture altamente ordinate nell'assembly macromolecolari, solo un insieme di risonanze dovrebbe essere visibile negli spettri. Se raddoppiato (o ulteriormente moltiplicato) risonanze sono visibili gli atomi 13 C o proteina spina dorsale si estende, conformazioni di due (o più) per l'atomo o il tratto di sequenza primaria nell'Assemblea, rispettivamente, esistono anche.
    10. Utilizzare lo spettro NCA 2D contenente le correlazioni intra-residuo 15 N - 13 Cα per identificare le frequenze di risonanza di 15 N per ogni residuo. Se la risoluzione nella dimensione 13 C non è sufficiente, utilizzare le informazioni supplementari circa la risonanza Cβ nella NCACB 2D per identificare la frequenza di risonanza di intra-residuo 15 N.
    11. Utilizzare il 2D NCACB e spettri NCACO contenenti intra-residuo 15 N - 13 C - 13 C correlazioni per (i) identificare la frequenza di 15 N intra-residuo e (ii) di risolvere le ambiguità del 13 C - 13 C DPSS con l'aiuto della dimensione ulteriori 15 N. L'inversione del segnale a causa del trasferimento di sogno conduce all'osservazione delle correlazioni di Cα-Cβ tipiche per il quale il segnale Cα è positivo e il segnale Cβ negativo. Ulteriori catena laterale 13 C, se visibile dello spettro, sono positivi ancora.

Figure 4
Figura 4: 2-dimensionale 13 C - 13 C SSNMR DPSS esperimenti su una ben ordinata, uniformemente 13 C, 15 proteina N-labeled assembly. A) breve tempo DPSS di miscelazione (miscelazione 50 ms). B) cessione del tratto 2-residui Ile32 - Thr33 utilizzando la sovrapposizione del breve tempo miscelazione DPSS con un tempo di miscelazione tempo DPSS (200 ms di miscelazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. determinazione della struttura secondaria
    1. utilizzare 13 Cα, valori di spostamento chimico Cβ 13 per calcolare la chimica secondaria spostano 46 ΔδCα-ΔδCβ , indicativo della struttura secondaria. Calcolare 13 Cα(assigned) - 13 Cα (bobina casuale) e 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (bobina casuale).
      Nota: I valori di spostamento chimico per residui in conformazione bobina casuale possono essere ottenuti da 38. I valori
      1. trama ΔδCα-ΔδCβ, positivo o negativo per > β-strand o conformazione α-elicoidale indicano 3 residui di fila rispettivamente; residui di glicina e prolina potrebbero visualizzare valori di spostamento chimico inusuali, come Essi spesso agiscono come " interruttori di struttura secondaria ".
    2. Predire gli angoli diedri di proteina dagli spostamenti chimici assegnati utilizzando TALOS + 47 , 48 o PREDITOR 49 , 50. I predetti angoli diedri Phi/Psi riflettono la struttura secondaria di Renè la proteinaNIT e sono usati come strutturali restrizioni durante tutto il processo di modellazione.
  2. Insieme di vincoli strutturali
    1. Set up e registrare un 2D 13 C - 13 esperimento DPSS C con un tempo lungo di miscelazione per rilevare a lungo raggio 13 C - 13 C correlazioni. Tipico di miscelazione i tempi variano da 400 ms per 1 s. utilizzare selettivamente marcato C 13 campioni, come la diluizione di spin migliora notevolmente il trasferimento di polarizzazione tra atomi di carbonio distanti.
    2. Overlay il lungo-miscelazione 2D 13 C - 13 C DPSS registrati su selettivamente con etichettato campione intermedio-miscelazione 13 C - 13 C DPSS, possibilmente registrate sullo stesso campione in modo selettivo con etichettato. Picchi supplementari derivano da correlazioni tra più distanti 13 C atomi. Durante l'assegnazione di risonanza, prendere in considerazione lo schema di etichettatura selettivo.
    3. Valutare con attenzione la risoluzione dello spettro per definire una finestra di tolleranza assegnazione, cioè dipendono le risonanze di risoluzione spettrale in un certo intervallo di ppm che ciò può contribuire al segnale. La deviazione standard della precisione assegnazione viene calcolata automaticamente in programmi di assegnazione di NMR come CcpNmr analisi o SPARKY.
    4. Se un segnale può essere spiegato da un sequenziale (residuo i - residuo i±1) o un contatto di portata media 13 C - 13 C (residuo i - residuo ho ± 2, 3 o 4), mantenere questo incarico dal inoltrata polarizzazione trasferimento può spiegare la correlazione anche se la distanza di 13 C 13 C - è sopra l'intervallo previsto di contatto visibile.
    5. Classificano le assegnazioni di lungo raggio 13 C - 13 C contatti in segnali inequivocabili e ambiguo di frequenza. Nel caso di assegnazioni di frequenza non ambigua, assegnazione di solo una risonanza è possibile rispetto alla finestra di tolleranza assegnazione.
      Nota: Le assegnazioni ambigue contengono tutte le assegnazioni di risonanza possibile all'interno della finestra di tolleranza. L'ambiguità può essere sollevata contemporaneamente durante il calcolo della struttura di turni iterativi di disambigua basate su strutture preliminare calcolati utilizzando solo le restrizioni non ambigue, interpretato nella routine di calcolo come ARIA 51 o UNIO 52. Inoltre, strutturali dati da diverse fonti biofisici (ad es. mutati o troncato la struttura dell'unità secondaria di soluzione NMR o cristallografia a raggi x, misurazioni di massa per lunghezza, cryo-EM mappa) possono essere utilizzati anche per ridurre il livello di ambiguità, per esempi di vedere 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. rilevamento dei vincoli di distanza intermolecolare in un assembly di proteina simmetrica
    1. istituito un 2D 15 N - 13 esperimento 59 C dolore-CP un misto (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-etichetta campione. I segnali rilevati nello spettro di dolore-CP dovrebbero derivare dalla inter-molecolari 15 N - 13 C vicinanze. Utilizzare le risonanze assegnate in precedenza per eseguire l'assegnazione dei contatti intermolecolari.
    2. Impostare un 2D 13 C - 13 C DPSS con un tempo di lunga miscelazione (> 600 ms) su una (50/50) misto (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glicerolo o (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-campione di glucosio.
      Nota: I segnali rilevati in questo spettro di 13 C 13 C - derivano da intra- molecolare e inter-molecolari 13 C - 13 C vicinanze. Tuttavia, l'alta complementarità dei due regimi di etichettatura consente coppie di particolare risonanza senza ambiguità derivano dai contatti inter-molecolari, ad es. un CA di serina nella (2 - 13 C)-glucosio etichettato subunità che correlano un CB di serina nella (1 - 13 C)-glucosio etichettato subunità.
      1. Sovrapposizione lo spettro del campione misto a 2D 13 C - 13 C spettri registrato su etichettato in modo omogeneo i campioni ((1,3-13C) - e (2 - 13 C)-glicerolo o (1 - 13 C)- e (2 - 13 C)-glucosio Contrassegnato con campioni). Ulteriori segnali nello spettro registrato sul campione misto dovrebbero sorgere da interazioni intermolecolari.
  4. Struttura di modellazione da dati SSNMR
    1. preparare le liste SSNMR ritenuta necessarie per il calcolo della struttura: sequenza della proteina (1); (2) restrizioni di distanza non ambigua intra-molecolari; (3) restrizioni di distanza ambigua intra-molecolari; (4) angolo di diedro basato su TALOS restrizioni; (5) restrizioni di distanza non ambigua inter-molecolari; (6) restrizioni di distanza ambigua inter-molecolari; (7) ulteriori dati da altre tecniche biofisiche (ad esempio parametri di massa per lunghezza, simmetria).
    2. Diverse recensioni forniscono le comprensioni modellazione struttura basata sui dati SSNMR e in combinazione con dati strutturali complementari 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 nota che i vincoli di distanza ambigua possono essere identificati durante il calcolo della struttura rispetto al preliminare modelli strutturali basati su vincoli di distanza inequivocabile. Per garantire l'accuratezza di struttura, osservare attentamente se la struttura converge ad una singola piega.

Figure 5
Figura 5 : Intra - e intermolecolari contatti negli assembly di proteina simmetrica. Rappresentazione schematica della intra - e intermolecolari 13 C - 13 C contatti a lungo raggio in un assembly macromolecolare elicoidale. Le subunità sono colorate in bianco e rosso per illustrare l'etichettatura mista delle subunità, cioè prima del montaggio è stata eseguita una miscela 1:1 di due diversi schemi di etichettatura (ad es. 1 - 13 C glucosio e 1 - 13 C glucosio). A) intramolecolare 13 C - 13 C contatti a lungo raggio (freccia tratteggiata blu); B) intermolecolari 13 C - 13 C contatti a lungo raggio (rosso deluse le frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Il flusso di lavoro tipico di SSNMR prevede diversi passaggi illustrati nella Figura 1. Solitamente la subunità proteiche sono prodotto da in vitro l'espressione eterologa in Escherichia coli, purificata e montate sotto agitazione, ma a volte anche in condizioni statiche. Espressione e purificazione della subunità della proteina sono seguiti da cromatografia di gel di SDS (Figura 2A). La formazione delle assemblee macromolecolari quindi può essere confermata dall'analisi di microscopia elettronica (EM) (Vedi Figura 2B per un esempio di un assemblaggio filamentosa).

Dopo l'introduzione dell'Assemblea della proteina nel rotore SSNMR, il rotore viene inserito nello spettrometro, il MAS frequenza e temperatura sono regolati e gli spettri sono registrati. Prime intuizioni possono essere ottenuti mediante tecniche SSNMR 1D. La figura 3 Mostra un tipico FID SSNMR rilevato sul canale 13C su un campione della proteina strutturalmente omogeneo, un 1H -13C CP spettro, rivelando le risonanze di13C presenti nel nucleo rigido della subunità della proteina nella assembly e uno spettro 2D 1H -13C inetto, che rappresentano i residui cellulari. Per atomici intuizioni il nucleo rigido della struttura dell'assieme, multidimensionale SSNMR esperimenti devono essere registrate su uniformemente e in modo selettivo etichettato i campioni per assegnare innanzitutto le risonanze SSNMR e quindi rilevare la prossimità a lungo raggio (Vedi figura 4 ).

Tutti gli spettri vengono elaborati e analizzati con software adeguato per assegnare le risonanze SSNMR ed estrarre intra - e intermolecolari distanza vincoli (Figura 5). I vincoli di distanza SSNMR vengono utilizzati da soli o in combinazione con i dati di tecniche complementari, che può essere integrato nel programma di modellazione.

Per strutture rappresentative atomiche di macromolecolare assembly risolto mediante tecniche di SSNMR la figura 6 illustra diversi assembly filamentose da appendici batteriche e fibrille amiloidi.

Figure 6
Figura 6:strutture macromolecolari filamentose, determinate da un approccio di NMR allo stato solido: filamenti batterici e fibrille della proteina amiloide. A) tipo 1 pilus di uropathogenic Escherichia coli, PDB codice 2N7H 4; B) ASC filamento, PDB codice 2N1F 63; C) gli aghi sistema di secrezione di tipo III, PDB codici 2MME, 2LPZ e 2MEX 2,3,64; D) fibrille di amiloide-beta AB42, PDB codice 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 e Osaka mutante PDB codice 2MVX 57, Iowa mutante PDB codice 2MPZ 58; E) dell'alfa-synuclein fibrille, PDB codice 2N0A 68; F) dominio di prioni HET-s, PDB codice 2RNM, 2KJ3 69,70. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

NMR allo stato solido (SSNMR) è un metodo di scelta per caratterizzare gli assembly macromolecolare della proteina a livello atomico. Uno dei temi centrali nella determinazione della struttura di base di SSNMR è la qualità spettrale del sistema oggetto dell'inchiesta, che permette di stabilire modelli strutturali 3D di precisione vari, in genere che vanno dai modelli a bassa risoluzione (contenente il secondario struttura elementi e poche informazioni 3D) per strutture 3D pseudo-atomiche. La quantità e la qualità di informazioni strutturali estratte dal multi-dimensionale SSNMR esperimenti è la chiave per calcolare una struttura NMR ad alta risoluzione dell'Assemblea.

Il protocollo descritto si basa sul rilevamento di 13C -13C e 15N -13C strutturali vincoli che richiedono la registrazione di diversi spettri 2D (e a volte 3D) con alto segnale-rumore. Alle frequenze di MAS moderate (< 25 kHz), il campione è stato introdotto in rotori con dimensioni di 3.2-4 mm di diametro permettendo per le quantità di proteine fino a ~ 50 mg, dipende l'idratazione del campione. La quantità di campione all'interno del rotore è direttamente proporzionale il rapporto segnale-rumore negli spettri di SSNMR, un fattore decisivo per l'individuazione dei vincoli di distanza a lungo raggio e loro assegnazione univoca.

La risoluzione spettrale è un parametro cruciale durante l'assegnazione di risonanza sequenziale e l'insieme di vincoli. Per ottenere risultati ottimali, i parametri di preparazione del campione devono essere ottimizzate, in particolare nella purificazione della subunità e le condizioni di montaggio (pH, buffer, agitazione, temperatura, ecc.). Per l'ottimizzazione del campione, si consiglia di preparare campioni senza etichetta per diverse circostanze distinte per i quali è stato osservato Assemblea e di registrare un 1D 1H -13C CP spettro (descritto al punto 2.1) su ogni campione preparato. Gli spettri servono per confrontare la risoluzione spettrale e dispersione tra le diverse preparazioni, basata che possono essere determinate le condizioni ottimali.

La qualità dei dati SSNMR dipende fortemente la scelta dei parametri di acquisizione NMR, soprattutto per le operazioni di trasferimento di polarizzazione. L'uso di alta intensità di campo magnetico (≥ 600 megahertz di frequenza di 1H) è essenziale per alta sensibilità e risoluzione spettrale, obbligatorio quando affrontare obiettivi complessi come gli assembly macromolecolare della proteina.

Un fattore limitante in molti casi è la disponibilità di spettrometro. Di conseguenza, una scelta giudiziosa dei campioni per essere preparati deve precedere la sessione di spettrometro. In ogni caso, un uniformemente 13C, 15N-etichettato campione è un prerequisito per eseguire l'assegnazione di risonanza sequenziale e intra-residuo. Per proteine assegnate mediante tecniche NMR allo stato solido vedere71. Determinazione della struttura delle assemblee macromolecolari a frequenze MAS moderate in modo selettivo richiede 13marcato C campioni; per la rilevazione di lungo raggio 13C -13C e 13C -15N contatti campioni basati su 1,3 -13C - e 2 -13C-gylcerol e/o 1 -13C - e 2 -13C-glucosio etichettatura sono comunemente utilizzati, come descritto in precedenza. La scelta tra i due schemi di etichettatura è basata sul rapporto segnale-rumore spettrale e risoluzione. Per distinguere tra intra - e intermolecolari contatti a lungo raggio, i campioni etichettati e diluiti misti hanno rivelato efficiente.

In breve, i passaggi critici per uno studio strutturale di SSNMR atomico sono: (i) la preparazione di subunità e la necessità di montaggio di essere ottimizzato per ottenere quantità di campione eccellente e qualità, (ii) spettrometro campo forza e acquisizione parametri devono essere scelti con cura; (iii) selettive strategie d'etichettatura sono necessari per una determinazione della struttura 3D e la quantità di dati richiesti dipende dalla qualità dei dati e la disponibilità di dati complementari.

Nonostante la sua applicabilità ad una vasta gamma di sistemi supramolecolari da proteine di membrana a homomultimeric nano-oggetti, SSNMR è spesso limitata dalla necessità per mg-quantità di materiale isotopicamente etichettato. I recenti sviluppi tecnologici nel ultra-veloce MAS (≥ 100 kHz) SSNMR aperta fino all'avenue a 1H-rilevato NMR e spingere il limite della quantità minima di campione a sub-mg 72,73,74. Tuttavia, per gli studi strutturali dettagliati 13C-etichetta campioni sono indispensabili, che limita l'applicazione di SSNMR a campioni assemblati in vitro o sistemi espressi negli organismi che sopravvivono in terreno minimo, dove nella cella SSNMR è un metodo di emergente (per recensioni Vedi 75,76,77,78).

Un fattore importante nell'applicazione di SSNMR per ottenere strutture 3D ad alta risoluzione è la risoluzione spettrale: intrinseca eterogeneità conformazionale in un assembly può limitare l'analisi spettrale spettri e risoluzione. Residuo specifico 13C etichettatura può in alcuni casi fornire un'alternativa per ottenere informazioni di distanza specifica sui residui strategici al fine di ottenere modelli strutturali (per una recente esempi Vedi 79,80).

SSNMR per determinazione della struttura 3D richiede ancora la raccolta di diversi set di dati con tempi di raccolta di dati spesso lunghi su strumenti sofisticati, a seconda l'approccio e il sistema parecchi giorni alle settimane su un 600-1000 MHz (frequenza1H) spettrometro. Di conseguenza, l'accesso al tempo spettrometro può essere un fattore limitante in un approfondito studio SSNMR.

Nel caso di assemblee di proteina di homomultimeric, che conduce ai dati SSNMR di qualità sufficiente per identificare un elevato numero di vincoli strutturali come in 3,57,64,70, SSNMR non dà ancora nessun accesso alle dimensioni microscopiche. Pertanto, in una determinazione della struttura SSNMR de novo di un assembly homomultimeric, EM o dati (MPL) massa-a-lunghezza ideale completano dati SSNMR per derivare i parametri di simmetria. SSNMR dati da soli forniscono l'atomica intra - e intermolecolari interfacce

SSNMR è altamente complementare con tecniche strutturali quali misure EM o MPL ma i dati possono essere combinati anche perfettamente con strutture atomiche ottenute mediante cristallografia a raggi x o soluzione NMR su subunità mutata o troncata. Un numero crescente di studi può essere trovato in letteratura dove la congiunzione di diversi dati strutturali ha permesso per la determinazione di modelli atomici 3D di macromolecolare assembly (vedere la Figura 6 per esempi rappresentativi).

Nel campo della biologia strutturale, SSNMR emerge come una tecnica promettente per lo studioassembly insolubili e non cristallina presso l'atomico livello, cioè fornendo dati strutturali su scala atomica. A questo proposito, SSNMR è la sospensione per soluzione NMR e cristallografia a raggi x per gli assembly molecolari, tra cui proteine di membrana nelle assemblee ambiente e proteina native come buste virale, batteriche filamenti o amiloidi, nonché di RNA e Complessi RNA-proteina (Vedi ad esempio81). Sue applicazioni altamente versatile in vitro e nel contesto cellulare, come il rilevamento delle modifiche strutturali secondarie, terziarie e quaternarie, identificando le superfici di interazione con molecole di partner su scala atomica (ad esempio 82) e mappatura dinamica molecolare nell'ambito di complessi montati, indicano il potenziale importante di SSNMR in futuri studi strutturali sugli assiemi complessi biomolecolari.

Componente M9 medio
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
MEM vitamina mix 100 X 10 mL/L
13 C-glucosio 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tabella 1: Composizione del mezzo di espressione minima per proteina ricombinante produzione in Escherichia coli cellule BL21.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è finanziato dalla ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. e ANR-14-CE09-0020-01 a A.L.), "Gli investimenti per il futuro" programma IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 al B.H.) fare riferimento ANR-10-IDEX-03-02 al B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), il programma del 7 ° PQ (7 ° PQ-persone-2013-CIG a A.L.) e del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma dell'Unione europea Horizon 2020, ricerca e innovazione (ERC Starting Grant di A.L., accordo No 639020) e progetto " WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

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References

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