पीआईपी-ऑन-ए-चिप: प्रोटीन-फॉस्फोइनॉसाइटिड इंटरैक्शन के लेबल-मुक्त अध्ययन

Bioengineering

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Summary

यहां हम पीएच मॉडुलन के आधार पर एक लेबल मुक्त पद्धति का उपयोग करते हुए प्रोटीन-फास्फाइनाइसाइटिड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के संदर्भ में एक समर्थित लिपिड बिलेयर पेश करते हैं।

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Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

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Abstract

कई सेलुलर प्रोटीन आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए झिल्ली सतहों के साथ बातचीत करते हैं। इन परस्पर क्रियाओं को झिल्ली के भीतर एक विशिष्ट लिपिड घटक के लिए निर्देशित किया जा सकता है, जैसे कि फॉस्फोइनॉसेटिड (पीआईपी) के मामले में, विशिष्ट सबसेलुलर स्थानीयकरण और / या सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए। सेलुलर फिजियोलॉजी में उनकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए पीआईपी और सेलुलर पीआईपी बाध्यकारी डोमेन का व्यापक अध्ययन किया गया है। हमने प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में समर्थित लिपिड बिलेयर (एसएलबी) पर पीएच मॉडुलन परख लागू किया है। इन अध्ययनों में, पीएच संवेदनशील ऑर्थो -Sulforhodamine बी संयुग्मित phosphatidylethanolamine प्रोटीन PIP बातचीत का पता लगाने के लिए किया जाता है। पीआईपी युक्त झिल्ली सतह पर एक प्रोटीन के बंधन पर, इंटरफेसियल क्षमता को संशोधित किया जाता है ( यानी स्थानीय पीएच में परिवर्तन), जांच के प्रोटोनेशन स्टेट को बदल दिया गया है। पीएच मॉडुलन परख के सफल उपयोग का एक केस स्टडी फॉस्फोलाइपस सी डेल्टा 1 प्लेकस्ट्रेट का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया हैहोमोलॉजी (पीएलसी-डीडीए पीएच) डोमेन और फॉस्फेटिडाइलिनोजोलोल 4,5-बिस्फोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2 ) एक उदाहरण के रूप में बातचीत। इस बातचीत के लिए स्पष्ट हदबंदी स्थिर ( के डी, एपी ) 0.3 9 ± 0.05 माइक्रोग्राम था, जो कि के डी के समान है , दूसरों के द्वारा प्राप्त एप्लिकेशन मूल्य। जैसा कि पहले देखा गया है, पीएलसी-डीडीए पीएच डोमेन पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट है, फॉस्फेटिडाइलीनोजिटॉल 4-फॉस्फेट के प्रति कमजोर बाध्यकारी दिखाता है, और शुद्ध फास्फेटिडाइलकोलाइन एसएलबी के लिए कोई बाध्यकारी नहीं है। पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख परंपरागत पीआईपी बाध्यकारी assays पर फायदेमंद है, जिसमें कम नमूना मात्रा और लिगेंड / रिसेप्टर लेबलिंग आवश्यकताओं के लिए सीमित नहीं है, लेकिन छोटे और छोटे दोनों के साथ उच्च और निम्न-आत्मीयता झिल्ली का परीक्षण करने की क्षमता बड़े अणुओं, और शोर अनुपात में सुधार संकेत। तदनुसार, पीआईपी-ऑन-ए-चिप दृष्टिकोण के उपयोग से झिल्ली बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला के तंत्रों को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, यह विधि संभवत: आपको यू हो सकती हैसैद्धांतिकताओं की पहचान करने में जो प्रोटीन की झिल्ली के साथ बातचीत करने की क्षमता विनियमित।

Introduction

अनियंत्रित बातचीत और जैव रासायनिक प्रक्रियाएं दो-आयामी द्रव झिल्ली सतहों पर होती हैं। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में झिल्ली-संलग्न ऑर्गेनल्स न केवल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं और उनके संबंधित प्रोटीम में बल्कि उनके लिपिड संरचना में भी अद्वितीय हैं। फॉस्फोलिपिड का एक असाधारण वर्ग फॉस्फोइनॉसेटिड (पीआईपी) है। हालांकि सेलुलर लिपिडोम में केवल 1% शामिल हैं, हालांकि वे 1 , 2 , 3 , 4 के बीच सिग्नल ट्रांसडक्शन, फार्मेजी और झिल्ली तस्करी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सेलुलर पीआईपी किनेज द्वारा इनॉसिटॉल हेड ग्रुप के डायनेमिक फास्फोरायलेशन, मोनो, बीआईएस-या ट्राइस-फास्फोराइलेट 5 वाले सात पीआईपी हेडग्रुप को जन्म देती है। इसके अतिरिक्त, पीआईपी झिल्ली की कोशिकीय पहचान को परिभाषित करते हैं और प्रोटीन / एंजाइम्स के लिए विशेष झिल्ली डॉकिंग साइट्स के रूप में काम करते हैं जिसमें एक या एक से अधिक फोस्फाइनोसउदाहरण के लिए, प्लेक्स्टिन होमोलॉजी (पीएच), फॉक्स होमोलॉजी (पीएक्स), और इप्सिन एन-टर्मिनल होमोलॉजी (ईएनटीएच) 6 , 7 । सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए पीआईपी-बाध्यकारी डोमेन में से एक फॉस्फोलाइपेस सी (पीएलसी) -डी 1 पीएच डोमेन है जो विशेष रूप से फॉस्फेटिडाइलीनोजिटोल 4,5-बिस्फोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2 ) के साथ एक उच्च नैनो-डायलोलर-कम माइक्रोलोवर रेंज एक्सिनिटि 8 , 9 , 10 , 11

इन अंतःक्रियाओं के तंत्र, ऊष्मप्रवैगिकी और विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विधियों में कई गुणात्मक और मात्रात्मक विकसित किए गए हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किए गए पीआईपी बाध्यकारी assays में सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), isothermal calorimetry (आईटीसी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, liposome प्लवनशीलता / अवसादन परख, और लिपिड ब्लास्ट (फैट ब्लास्ट / पीआईपी स्ट्रिप्स)12 , 13 हालांकि इनका बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है, वे सभी के कई नुकसान हैं उदाहरण के लिए, एसपीआर, आईटीसी, और एनएमआर को बड़ी मात्रा में नमूना, महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन और / या प्रशिक्षित कर्मचारी 12 , 13 की आवश्यकता होती है । एंटीबॉडी-आधारित लिपिड-ब्लोट्स जैसे कुछ परख फॉर्मेट पीआईपी के पानी के घुलनशील रूपों का उपयोग करते हैं और 12 , 14 , 15 , 16 को गैर-प्रायोगिक तरीके से पेश करते हैं। इसके अलावा, लिपिड-ब्लोट्स को मज़बूती से मात्रात्मक नहीं किया जा सकता है और वे अक्सर झूठे सकारात्मक / नकारात्मक टिप्पणियों 12 , 17 , 18 के परिणामस्वरूप हैं। इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए और मौजूदा टूल सेट पर सुधार करने के लिए, एक नया लेबल-मुक्त तरीका स्थापित लिपिड बिलेयर (एसएलबी) के आधार पर स्थापित किया गया था। आईसीआरओफ़्लुइडिक प्लेटफॉर्म, जो प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन ( चित्रा 1 ) 1 9 के अध्ययन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था।

प्रोटीन-पीआईपी बातचीत का पता लगाने के लिए नियोजित रणनीति पीएच मॉडुलन सेंसिंग पर आधारित होती है। यह एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई कि ऑर्थो -Sulforhodamine बी (ओ एसआरबी) है सीधे phosphatidylethanolamine लिपिड सिर समूह से 20 संयुग्मित शामिल है। SRB-POPE जांच ( चित्रा 2 ए ) कम पीएच पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट है और पीईए के साथ उच्च पीएच पर 7.7 के आसपास 7.5 एमओएल% पीआई (4,5) पी -2- एसोसिएशन एसएलबी ( चित्रा 5 बी ) में बुझती है। पीआई (4,5) पी 2 ( चित्रा 5 ए ) 21 , 22 , की दिशा में इसकी उच्च विशिष्टता के कारण प्रोटीन-पीआईपी बाध्यकारी पद्धतियों को मान्य करने के लिए पीएलसी-डीडीए पीएच डोमेन का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है "> 23 , 24 , 25 .इसलिए, हमने तर्क दिया कि पीएलसी-डीडीए PH डोमेन का प्रयोग पीआईपी (4,5) पी 2 के लिए पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख के माध्यम से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। पीएच डोमेन का निर्माण इस अध्ययन में उपयोग किए गए शुद्ध सकारात्मक चार्ज (पीआई 8.4) है, और इस तरह ओएच - आयनों ( चित्रा 5C ) को आकर्षित करता है। पीआई (4,5) पी 2- एसोसिएशन एसएलबी के लिए बंधन पर, पीएच डोमेन ओएच - आयनों को लाता है झिल्ली सतह, जो बारी-बारी से इंटरफेसिक क्षमता को व्यवस्थित करती है और SRB-POPE ( चित्रा 5C ) की प्रोटोनेशन स्थिति को बदलती है 26. पीएच डोमेन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में, प्रतिदीप्ति बुझती है ( चित्रा 6 ए )। अंत में, सामान्यीकृत डेटा पीएच डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 इंटरेक्शन ( चित्रा 6 बी , 6 सी ) की आत्मीयता निर्धारित करने के लिए एक बाध्यकारी आईएसओआरएम फिट है।/ P>

इस अध्ययन में, एक माइक्रोफ़्लिडिक प्लेटफॉर्म के भीतर पीआईपी युक्त एसएलबी के लिए प्रोटीन बाध्यकारी करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिया गया है। यह प्रोटोकॉल रीडर को माइक्रोब्ल्लुइडिक डिवाइस और एससीबी गठन और प्रोटीन बाइंडिंग के लिए फेंक की तैयारी को जोड़ने से ले जाता है। इसके अलावा, पीएलसी- δ1 PH डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 इंटरैक्शन के लिए एफ़िनिटी जानकारी निकालने के लिए डेटा विश्लेषण के लिए दिशा-निर्देश दिए गए हैं।

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Protocol

1. ग्लास कवर्स को साफ करना

  1. 7x क्लीनिक सोल्यूशन (देखें सामग्री सारणी ) एक सपाट तल के साथ 100 मिमी गहरी बोरोजिलेट ग्लास डिश में विआयनीकृत पानी के साथ 7 गुना और 20 मिनट के लिए एक स्तर की गरम प्लेट पर गर्मी या तापमान तक बादल बादल साफ हो जाता है। ।
    नोट: समाधान गर्म हो जाएगा, शारीरिक चोटों से बचने के लिए सावधानी बरतें। 7x सफाई समाधान हेक्सासोडियम [ऑक्सिडो- [ऑक्सिडो (फॉस्फोनाटोक्सी फॉस्फोरील) ऑक्सिफॉस्फोरेल] फॉस्फेट, 2- (2-बायोक्सीथाइक्सी) इथेनॉल, सोडियम 1,4-बीआईएस (2-एथिलहेक्सॉक्सी) -1,4-डाइऑक्सोबूटन का एक स्वामित्व मिश्रण है -2 सल्फोनेट और गैर-खतरनाक परिवर्धन
  2. चिमटी का उपयोग, वैकल्पिक दिशाओं में एक एल्यूमीनियम धुंधला रैक पर कवर्लिप्स (40 मिमी लंबाई x 22 मिमी चौड़ाई x 0.16-0.19 मिमी की ऊंचाई) की व्यवस्था करें। एक दूसरे को छूने से रोकने के लिए प्रत्येक कंसलिप के बीच खाली जगह रखें
  3. पूरी तरह से सफाई के समाधान में कवरलीप के साथ धुंधला हो जाना रैक को डुबो दें। कवर्लिप्स में रखें1 घंटे के लिए समाधान
    नोट: जैसे पानी वाष्पीकरण होता है, समाधान की एकाग्रता को अपरिवर्तित रखने के लिए ताजा विआयनीकृत पानी जोड़ते रहें।
  4. धुंधला रैक को सफाई समाधान से बाहर निकालना और डिटर्जेंट को हटाने के लिए विलोमयुक्त पानी की प्रचुर मात्रा के साथ कवरलाप को धो लें।
  5. नाइट्रोजन गैस (लगभग 5 मिनट प्रति धुंधला रैक) के साथ कवरलाइट्स सूखें, और फिर एक छिद्र में 6 घंटे के लिए 550 डिग्री सेल्सियस के लिए एनालालिंग के लिए कवचल्स को रखें।
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है जो कांच की सतह पर किसी न किसी विशेषताओं को सुगंधित करता है।
  6. एक प्लास्टिक कंटेनर में कवरलाप रखें और उन्हें धूल से दूर रखें।

2. माइक्रोप्रेट्र्ड PDMS ब्लॉक बनाना

  1. पॉलीडिमैथाइलसिलोक्सन (पीडीएमएस) प्रीफ़्लिमर और एक बड़े प्लास्टिक में 10: 1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अनुपात पर इलाज एजेंट को मिलाएं और 500 टन या उससे कम में वैक्यूम ताकत के साथ 1 घंटे के लिए वैक्यूम में डिग्री।
    नोट: PDMS एक पारदर्शी और निष्क्रिय सिलिकॉन बहुलक है। इच्छित PDMS ब्लॉक टी प्राप्त करने के लिएहिकिंग (0.5 सेंटीमीटर), प्रीफ़्लिमर के 55 ग्राम को मिलाकर इलाज एजेंट के 5.5 ग्राम मिलाएं।
  2. एक बड़े (10 सेमी बेस व्यास) प्लास्टिक में एक ही SU-8 माइक्रोप्रोटरन के कई प्रतिकृतियां युक्त सिलिकॉन मास्टर रखें और नाव ताने और degassed PDMS में डालें। फिर, इसे एक सूखा ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात भर दें।
    नोट: नग्न आंखों से देखने के लिए माइक्रोप्रटर्न्स काफी बड़े हैं। प्रत्येक पैटर्न में 8 माइक्रोचैनल (100 माइक्रोन चौड़ाई x 40 माइक्रोन ऊंचाई x 1 सेमी लंबाई) के बीच 40 माइक्रोन अंतर ( चित्रा 1 ए , 1 बी ) के साथ होता है। सिलिकॉन वेफर ढालना जिसमें नॉनोफैब्रिकेशन सुविधा 27 में कड़ी मेहनत वाली एसयू -8 फोटो्रेसिस्ट का निर्माण किया गया था। मास्टर तैयारी के लिए अन्य तरीकों में हाइड्रोफ्लोरोरिक एसिड (एचएफ) एच्चिंग, हाई-तापमान वाटर एच्चिंग, एक्सरोग्राफी, और 3 डी प्रिंटिंग 28 , 29 , 30 , 31 शामिल हैं । commercसिलिकॉन मास्टर तैयारी के लिए ial स्रोत भी इस्तेमाल किया जा सकता है। माइक्रॉफ़्लिडिक डिवाइस के लिए पैटर्न एक प्रारूपण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ डिजाइन किया गया था। पैटर्न डिजाइन युक्त मूल फ़ाइल को पूरक फ़ाइल "पैटर्न डिजाइन। डब्ल्यूजी" के रूप में प्रदान किया गया है, जो सीधे निर्माता को प्रदान किया जा सकता है।
  3. धीरे से, हाथों से सिलिकॉन मास्टर से पीडीएमएस को छील कर दें। सर्जिकल स्केलपेल और एक शासक का उपयोग करके आयताकारों में प्रत्येक माइक्रोप्रेट्रन की सीमाओं को चिह्नित करें फिर, ब्लॉकों में PDMS को काटें।
  4. चित्रा 3 बी में बताए अनुसार बायोप्सी पंच (1.0 मिमी छेद व्यास) वाले प्रत्येक माइक्रोचैनेल के दोनों छोरों पर पंच 16 छेद (8 इनलेट और 8 आउटलेट प्रति ब्लॉक)
  5. नुकसान और धूल से micropatterns की रक्षा के लिए प्रत्येक PDMS ब्लॉक पर टेप लागू करें। उन्हें एक प्लास्टिक कंटेनर में स्टोर करें

3. छोटे Unilamellar Vesicles (एसयूवी) की तैयारी

नोट: नकारात्मक नियंत्रण bilayer संरचना99.5 मोल% 1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (POPC) और 0.5 मोल% ortho- Sulforhodamine बी -1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine (ओ SRB- है पोप)। टेस्ट दोहरी परत संरचना है 92.0 मोल% POPC, 0.5 मोल% एसआरबी-पोप, और या तो एल α-phosphatidylinositol-4-फॉस्फेट के 7.5 मोल% (PI4P) या एल α-phosphatidylinositol-4,5-बाइफोस्फेट (पीआई ( 4,5) पी 2 ) नीचे 92.0 मोल% POPC की तैयारी, 0.5 मोल% एसआरबी-पोप, और 7.5 मोल% PI (4,5) पी 2 इन्तेरेलयूकिन एसयूवी के लिए प्रक्रिया है। इस अध्ययन में इस्तेमाल एसआरबी-पोप के संश्लेषण पहले 20 में वर्णित किया गया।

  1. पीओपीसी, पीआई (4,5) पी 2 , और एसआरबी-पीओपीई की मात्रा की गणना करने के लिए मिश्रित करने की जरूरत है, जो निम्नलिखित कुल मात्रा के लिए खाता है: 2.22 मिलीग्राम पीओपीसी, 0.26 मिलीग्राम पीआई (4,5) पी 2 , और 2.1 x 10 -5 मिलीग्राम SRB-POPE।
  2. पीओपीसी, पीआई (4,5) पी 2 , <की गणना की मात्रा पिपेट करेंEm> ओ SRB-POPE एक एकल 20 एमएल ग्लास स्कैन्टलेशन शीशी में।
    नोट: पीओपीसी और एसआरबी-पीओपीई शेयर समाधान क्लोरोफॉर्म समाधान में आते हैं, जबकि पीआई (4,5) पी 2 (और अन्य फोस्फाइनाइसाइड) स्टॉक क्लोरोफॉर्म में आता है: मेथनॉल: पानी (20: 9: 1) विलायक मिश्रण सटीकता के लिए, इसे प्रयोग करने से पहले क्लोरोफॉर्म के साथ पिपेट टिप गीला करें। सुरक्षा के लिए, यह कदम रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर होना चाहिए।
  3. नाइट्रोजन गैस की एक धारा में 10 मिनट के लिए या विलायक वाष्पीकरण होने तक और शीशी के नीचे एक पतली लिपिड फिल्म के रूप में मिश्रण को सूखी।
  4. किसी भी अवशिष्ट कार्बनिक विलायक को हटाने के लिए 10 मीटर की वैक्यूम ताकत पर ≥3 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत मिश्रण को त्याग दें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसयूवी तैयारी के पैमाने के लिए 3 ह desiccation समय पर्याप्त है, जो 50 प्रयोगों के लिए पर्याप्त है। यदि एसयूवी की तैयारी के एक बड़े पैमाने की आवश्यकता है, तो रात भर सूखने का कार्य किया जा सकता है।
  5. पुनः डालें5 एमएल चलने वाली बफर (20 मिमी एचईपीईएस, 100 एमएम NaCl, पीएएच 7.0 में) के साथ ied लिपिड फिल्म और आरटी के 30 मिनट के लिए 35 किलोहर्ट्ज की ऑपरेटिंग आवृत्ति पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में जगह है।
    नोट: चरण 3.1 में निर्दिष्ट लिपिड्स की मात्रा को मिलाकर और चरण 3.5 में चलने वाले बफर के 5 एमएल जोड़कर 0.5 मिलीग्राम / एमएल पर एक पुटिका निलंबन पैदा करता है। इस स्तर पर, पुटिका निलंबन एकमात्र और बहु-मंगल vesicles ( चित्रा 2 बी ) का एक मिश्रण है। समाधान गुलाबी / बैंगनी रंग में और अपेक्षाकृत टरबाइड दिखाई देगा।
  6. तरल नाइट्रोजन के साथ पुटिका निलंबन और 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के नहाने को बिना किसी एक प्रकार के vesicles पाने के लिए रुक-पिघलना। फ्रीज-थू 10 बार दोहराएं।
    नोट: (वैकल्पिक) निलंबन में गैर-अनिलेलमेर vesicles की अनुपस्थिति को सुनिश्चित करने के लिए, सेंट्रीफ्यूजेशन चरण 32 , 33 लागू किया जा सकता है।
  7. एक लिपिड extruder का उपयोग करते हुए 0.10 माइक्रोन ट्रैक-etched polycarbonate झिल्ली के माध्यम से पुटिका निलंबन बाहर निकालना (देखेंसामग्री की तालिका) एसयूवी के लिए समृद्ध करने के लिए एक्सट्रूज़न 10 बार दोहराएं
    नोट: एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग एक्सट्रुडेड फेशियल इकट्ठा करने के लिए किया जा सकता है। समाधान इस स्तर पर मलिनता के शून्य होना चाहिए। एसयूवी व्यास की गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) ( चित्रा 2 सी ) के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है। एसएलबी 34 के गठन के लिए एसयूवी सर्वोत्तम अनुकूल हैं
  8. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शंक्वाकार ट्यूब को कवर करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस को इकट्ठा करना

  1. पानी धोने की बोतल का उपयोग करके छेद के माध्यम से डीओनाइज्ड पानी को स्क्वाटिंग करके रुकावट के लिए पीडीएमएस ब्लॉक के इनलेट और आउटलेट का परीक्षण करें। फिर, नाइट्रोजन गैस के साथ पीडीएमएस ब्लॉक सूखा।
    नोट: यह चरण किसी भी धूल कणों को भी निकाल देगा जो कि चैनलों के बीच और / या बीच फंस सकता था। यदि आवश्यक हो, किसी भी धूल कणों को हटाने के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ डिस्टुस्ट प्री-क्लीन किए गए कवर लिप्स।
  2. PDMS ब्लॉक और पूर्व-साफ रखेंऑक्सीजन प्लाज्मा सिस्टम (देखें सामग्री की तालिका देखें) के अंदर कवरलिप (ऑब्जेक्शन प्लांट) के नमूने कक्ष में 45 वोल्ट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ 75 वोल्ट्स पर बिजली की स्थापना, ऑक्सीजन फ्लो स्पीड 10 सेंटीमीटर 3 / मिन और 200 एमटीर पर वैक्यूम ताकत ।
  3. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के तुरंत बाद कंडलिप के संपर्क में PDMS ब्लॉक की नमूनों की सतह को रखें। संपर्क साइटों पर किसी भी हवाई बुलबुले को हटाने के लिए धीरे से दबाएं
  4. डिवाइस को एक स्तर की हॉट प्लेट पर 100 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए बाँडिंग बढ़ाने के लिए रखें।
  5. डिवाइस के शीर्ष (पीडीएमएस) और नीचे (कांच) से किसी भी धूल कण को ​​निकालने के लिए 100% इथेनॉल के साथ एक गीली लिंट मुक्त पोंछे ( जैसे किमिवाइप) का प्रयोग करें। फिर, एक गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड के ऊपर डिवाइस टेप करें
    नोट: अधिक मात्रा में इथेनॉल का उपयोग न करें और इनलेट और आउटलेट चैनलों में होने वाले इथेनॉल से बचें। इस चरण को निष्पादित करते हुए यह सुनिश्चित करने के लिए कि उपकरण अभी भी गर्म है, एथेनॉल तुरंत वाष्पीकरण करता है। ग्लास माइक्रोएरओस्स्कोपी स्लाइड्स धूल और अन्य दूषित पदार्थों को हटाने के लिए 100% इथेनॉल समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।

5. समर्थित लिपिड बिलेयर (एसएलबी)

  1. चरण 3.8 से 0.65 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में 100 μL पीआई (4,5) पी -2- एसयूवी वाले स्थानांतरण। समाधान के पीएच को ~ 3.2 के 6.4 μL 0.2 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़कर समायोजित करें।
    नोट: एक पीएच मीटर के साथ समाधान के पीएच की पुष्टि करें जिसमें सूक्ष्म पीएच जांच (सामग्रियों की तालिका देखें) है।
  2. प्रत्येक चैनल में पीएच-एडजस्टेड एसयूवी समाधान के 10 μL पिपेट इनलेट के माध्यम से और पिपेट के माध्यम से दबाव लागू करते हैं जब तक समाधान आउटलेट तक नहीं पहुंचता है। टिप को विंदुक से अलग करें और इसे डिवाइस से संलग्न रखें।
  3. प्रत्येक चैनल के लिए उपरोक्त चरण को दोहराएं और फिर आरटी पर 10 मिनट के लिए उपकरण सेते।
    नोट: माइक्रोचैनेल में vesicles के इंजेक्शन डिवाइस विधानसभा के तुरंत बाद किया जाना चाहिए।
  4. प्रवेश और आउटलेट टयूबिंग के कट सेटसी 60 सेमी (इनलेट टयूबिंग) और 8 सेमी (आउटलेट टयूबिंग) लंबे, क्रमशः।
    नोट: तिरछे टयूबिंग काटने और एक तेज किनारे का निर्माण करना, इनलेट और आउटलेट में टयूबिंग को सम्मिलित करना आसान बनाता है। आउटलेट टयूबिंग का चाप आकार होना चाहिए। माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर इनलेट टयूबिंग की लंबाई भिन्न हो सकती है। टयूबिंग का आंतरिक व्यास 0.05 सेमी है
  5. चिमटी का उपयोग करना, आउटलेट टयूबिंग को डिवाइस पर सेट करें, और फिर डिवाइस को माइक्रोस्कोप चरण पर टेप करें।
  6. इनलेट टयूबिंग का एक छोर एक शंक्वाकार ट्यूब में निहित 25 मिलीलीटर की चल बफर में सेट करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि टयूबिंग सुरक्षित है, टेप करें।
  7. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के माध्यम से माइक्रोचैनल के माध्यम से समाधान को धक्का देने के लिए उपकरण की तुलना में एक उच्च भूमि (~ 20 सेमी) पर शंक्वाकार ट्यूब रखें; एक लैब जैक का इस्तेमाल इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए किया जा सकता है।
  8. प्रत्येक प्रवेश ट्यूब के लिए, टयूबिंग के निशुल्क अंत से चलने वाले बफर के 1 एमएल को आकर्षित करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। इनलेट से विंदुक टिप निकालें और डालेंडिवाइस में प्रवेश टयूबिंग का नि: शुल्क अंत
    नोट: इस चरण के दौरान चैनल में पेश किए जाने वाले हवाई बबल की संभावना को कम करने के लिए प्रवेश बफर पर एक बूंद का परिचय दें। इनलेट टयूबिंग डिवाइस से जुड़ी जाने के बाद, अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए एक लिंट-फ्री पोंछे का उपयोग करें।
  9. उपकरण में सभी इनलेट टयूबिंग टुकड़ों को जोड़ने के लिए ऊपर दिए गए कदम को दोहराएं।
    नोट: चैनलों के माध्यम से चलने वाला बफर बहुरता से हटाने के लिए और प्रायोगिक परिस्थितियों में बिलेयर को संतुलित करने में मदद करता है।
  10. माइक्रोस्कोप कंट्रोल सॉफ़्टवेयर खोलें (सामग्रियों की तालिका देखें) बाएं पैनल पर, "माइक्रोस्कोप" टैब पर क्लिक करें और "10 एक्स" उद्देश्य चुनें
  11. टूलबार पर "लाइव" और फिर "एलेक्सा 568" छवि आइकन पर क्लिक करें ठीक और पाठ्यक्रम समायोजन knobs का उपयोग, माइक्रोचैनल पर ध्यान केंद्रित
  12. एसएलबी और चैनल की गुणवत्ता ( चित्रा 8 ) की जांच करने के लिए डिवाइस के माध्यम से स्कैन करें। फिर,उपकरण पट्टी पर "FL शटर बंद" चित्र आइकन पर क्लिक करें
  13. "अधिग्रहण" टैब पर क्लिक करें, और "मूल समायोजन" के अंतर्गत "एक्सपोजर टाइम" चुनें। एक्सपोज़र का समय "200 एमएस" पर सेट करें
  14. बाएं पैनल पर, "बहुआयामी अधिग्रहण" पर क्लिक करें और फिल्टर मेनू के तहत लाल चैनल ("एलेक्सा 568" के रूप में चिह्नित) चुनें। फिर, "समय चूक" मेनू पर क्लिक करें, समय अंतराल को 5 मिनट, अवधि 30 मिनट पर सेट करें और "प्रारंभ करें" पर क्लिक करें।
    नोट: अवधि (30 मिनट) और प्रवाह दर (~ 1.0 μL / मिनट) के आधार पर चलने वाले बफर के 30 μL का इस्तेमाल चैनल के भीतर एसएलबी को संतुलित करने के लिए किया जाता है, अर्थात चलने वाला बफर के 240 μL का उपयोग सभी 8 चैनलों के लिए किया जाता है।
  15. "माप" टैब के अंतर्गत "सर्किल" टूल चुनें और किसी भी चैनल में एक मंडल बनाएं। सर्कल चयनित होने पर राइट क्लिक करें और "गुण" चुनें "प्रोफाइल" टैब के तहत, "सभी टी" को देखने के लिए देखेंप्रतिदीप्ति तीव्रता समय के एक समारोह के रूप में।
    1. सुनिश्चित करें कि यह वक्र एक पठार तक पहुंचता है, जो अगले चरण में जाने से पहले संतुलन को इंगित करता है।
  16. डिवाइस को प्रवाह को रोकने के लिए एक समान जमीन के बफर समाधान को कम करें।
  17. समय चूक फाइल को बचाओ

6. पीआई के साथ PLC-δ1 पीएच डोमेन इंटरैक्शन का परीक्षण (4,5) पी -2 -एसोसिएशन एसएलबी

  1. पीएच डोमेन के चलने वाले बफर का उपयोग धीमा के रूप में करें।
    नोट: चूंकि डिवाइस के भीतर आठ चैनल हैं, इसलिए कम से कम दो को खाली नियंत्रण के लिए उपयोग करें। प्रत्येक तरफ दूर की सीमा को चुनें और प्रोटीन dilutions के शेष चैनलों का उपयोग करें। निम्नलिखित पीएच डोमेन केंद्रित की जांच की गई: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, और 2.50 माइक्रोन। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लगभग 200 μL 30 मिनट के भीतर संतुलन तक पहुंचने के लिए पर्याप्त था।
  2. एक समय में, प्रत्येक आउटलेट टयूबिंग को अलग करें और प्रत्येक प्रोटीन कमजोर पड़ने पर 200 μL को लागू करेंएक विंदुक का उपयोग कर आउटलेट चैनल किसी भी दबाव को लागू न करें, गुरुत्वाकर्षण काम करते हैं। टिप को विंदुक से अलग करें और इसे माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस से संलग्न करें।
  3. प्रत्येक चैनल के लिए उपरोक्त कदम दोहराएं और सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के दौरान चैनलों में हवा के बुलबुले पेश नहीं किए गए हैं।
  4. सूक्ष्म चैनलों के माध्यम से प्रोटीन बहने शुरू करने के लिए माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस के नीचे जमीन पर प्रवेश टयूबिंग कम करें। अपशिष्ट कंटेनर के लिए टयूबिंग का नि: शुल्क अंत टेप करें 30 मिनट के लिए प्रोटीन dilutions फ्लो
    नोट: यह प्रवाह को उलट देगा और प्रोटीन को चैनलों में पेश किया जाएगा। संतुलन और प्रोटीन dilutions की मात्रा के लिए आवश्यक समय बातचीत के आत्मीयता पर निर्भर होगा।
  5. सॉफ़्टवेयर के बाएं पैनल पर, "समय चूक" टैब के अंतर्गत, फिर से इमेजिंग शुरू करने के लिए "प्रारंभ" पर क्लिक करें
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए कदम 5.15 को दोहराएं कि संतुलन समाप्त हो गया है। प्रयोग पूरा होने पर, समय चूक को बचाओफ़ाइल।

7. झिल्ली प्रवाहकत्त्व का आकलन

नोट: Photobleaching (एफआरएपी) प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्ति एसयूवी के प्रत्येक नए बैच के साथ और साफ गिलास के कवर के साथ किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि SLBs द्रवमान हैं।

  1. माइक्रोप्रेटेड पीडीएमएस ब्लॉकों (2.1-2.5) को तैयार करने के लिए कांच के कवरों (1.1-1.6) की सफाई के लिए प्रक्रिया का पालन करें, एसयूवी (3.1-3.8) की तैयारी, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (4.1-4.5) को इकट्ठा करने और एसएलबी (5.1-5.17) बनाने से पहले का वर्णन किया।
  2. बिलेयर पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें, एक्सपोज़र का समय 200 एमएस तक सेट करें, और 1 से बिनिंग करें।
  3. फोटो-ब्लीच एक 532 एनएम, 2 मेगावाट लेजर बीम (13 सुक्ष्ममापी त्रिज्या) का उपयोग कर परिपत्र स्थान। फोटोबलीचिंग के तुरंत बाद, पहले 45 सेकंड के लिए हर 3 सेकंड की एक श्रृंखला को कैप्चर करना शुरू करें, उसके बाद शेष समय के लिए 30 सेकंड का अंतराल (15 मिनट की कुल अवधि)। एक बार डाटा अधिग्रहण पूर्ण हो गया है, समय चूक फ़ाइल को बचाएं।
  4. प्रक्षालित एक का चयन करेंसमय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को निकालने के लिए सर्कल ड्राइंग टूल का उपयोग करके री। इसके अतिरिक्त, आस-पास के दो और क्षेत्रों का चयन करें, जो एक अप्रभावी क्षेत्र से संबंधित होता है और किसी भी एसएलबी बिना किसी क्षेत्र के समान होता है।
  5. निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति वसूली की गणना करें ( y ):
    समीकरण
    नोट: यहां एफ टी समय के एक समारोह के रूप में प्रक्षालित क्षेत्र की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, एफ मैं विरंजन से पहले प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है (इस मामले में "सामान्य" के रूप में "1" का उपयोग करें); एफ 0 पृष्ठभूमि तीव्रता है
  6. प्लैट प्रतिदीप्ति वसूली (वाई-अक्ष) एक फ़ैशन वक्र उत्पन्न करने के लिए समय (एक्स-अक्ष) के एक समारोह के रूप में। फिर, निम्नानुसार एक भी घातीय कार्य करने के लिए डेटा फिट,
    समीकरण
    नोट: यहाँ एक मोबाइल अंश का प्रतिनिधित्व करता है और टी 1/2 ) की गणना करने के लिए किया जाता है:
    समीकरण
  7. प्रसार निरंतर ( डी ) की गणना करने के लिए टी 1/2 का उपयोग करें:
    समीकरण
    नोट: यहाँ आर लेजर बीम त्रिज्या (13 सुक्ष्ममापी) का प्रतिनिधित्व करता है। तरल बिलेटर के लिए प्रसार निरंतर होना ≥1.0 माइक्रोन 2 / एस होना चाहिए

8. डेटा प्रोसेसिंग

नोट: डेटा विश्लेषण की रूटीन माइक्रोस्कोप, इमेज प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर और वक्र-फिटिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने पर निर्भर होगी।

  1. पीएच डोमेन के शीर्षक के पहले (चरण 5.17 से) और उसके बाद (चरण 6.6 से) की समय चूक फ़ाइलों को खोलें। हर बार चूक फ़ाइल की आखिरी फ़्रेम पर जाएं और फ्लोरोसिस प्राप्त करने के लिए सभी माइक्रो चैनलों में एक रेखा स्कैन करेंपिक्सल में दूरी के एक समारोह ( चित्रा 6 ए ) के रूप में तीव्रता से तीव्र डेटा। स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में डेटा ट्रांसफर करें
  2. प्रत्येक माइक्रोचैनेल (पीएच डोमेन से पहले और बाद में) के लिए, चैनल के भीतर कुछ डेटा का नमूना और बेसलाइन ( चित्रा 7 ए ) का प्रतिनिधित्व करने वाले चैनल के दोनों तरफ नमूना करें।
    नोट: रिक्त चैनल प्रतिदीप्ति तीव्रता अपरिवर्तित रहनी चाहिए। अन्य सभी चैनल खाली चैनल के लिए सामान्यीकृत होते हैं, इसलिए दो रिक्त चैनलों के लिए महत्वपूर्ण है और सुनिश्चित करें कि उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता एक-दूसरे के साथ संगत रहें।
  3. रिक्त चैनल में डेटा को सामान्य करने के लिए नीचे दिए गए सूत्र को लागू करें; एक नमूना गणना चित्रा 7 बी में प्रदान की जाती है
    समीकरण
    नोट: यहां प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन चैनल की पृष्ठभूमि घटाकर प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, Δ; एफ रिक्त रिक्त चैनल की पृष्ठभूमि घटाई गई प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, प्री और पोस्ट प्रोटीन अनुमापने के चरणों के पहले और बाद का संदर्भ देता है, और α सुधार कारक दर्शाता है जो कि प्रोटीन चैनल की प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात और रिक्त चैनल ([ एफ प्रोटीन / एफ रिक्त ) पूर्व ) प्रोटीन अनुमापन चरण में। चूंकि प्रतिदीप्ति तीव्रता पीएच डोमेन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में घट जाती है, सामान्यीकृत डेटा मूल्य में ऋणात्मक होगा।
  4. वक्र-फ़िटिंग सॉफ़्टवेयर ( सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करना, पीएच डोमेन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति को साजिश करता है और लैंगमुइर इज़ोटेर्म के लिए फिट होता है ( चित्रा 6C ):
    समीकरण
    नोट: यहां फ्लू में अधिकतम परिवर्तन के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को ΔF दर्शाता हैजब प्रोटीन की संतृप्ति एकाग्रता मौजूद होती है ( Δ एफ अधिकतम ), जबकि कश्मीर डी, एप स्पष्ट विखंडन स्थिरता को दर्शाता है, जो थोक प्रोटीन एकाग्रता ( [पीएलसी-डीडीएचएच PH ) के बराबर है, जिस पर 50% कवरेज ( झिल्ली बाध्य जटिल) हासिल की है। यह एक संतुलन-आधारित बाध्यकारी माप है, ताकि सामान्यीकृत डेटा एक साधारण लैंगमूयर आईसोथर्म के लिए फिट हो, जो एक स्पष्ट प्रायोगिक पैरामीटर K d, एप को निकालने के लिए होता है। फिटिंग सॉफ़्टवेयर के आधार पर के डी, पीएलसी-डीडीएच PH-PI (4,5) पी 2 इंटरैक्शन के लिए एप 0.3 9 ± 0.05 माइक्रोन ( चित्रा 6 बी ) है।

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Representative Results

हमने पीएच-ए-एक-चिप माइक्रुप्रसिस ( चित्रा 1 ) के भीतर पीएलसी-डीडीएच डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पीएच मॉडुलन परख का इस्तेमाल किया। एक विस्तृत प्रोटोकॉल के माध्यम से हमने दिखाया कि कैसे माइक्रोएफ़्लिडिक डिवाइस घटकों को तैयार और इकट्ठा करने के लिए, छोटे अनलिमेलेल vesicles (एसयूवी) ( चित्रा 2 ) बनाएं, एक डिवाइस के अंदर एसएलबी बनाएं ( चित्रा 3 ), और पीआईपी से युक्त एसएलबी के लिए प्रोटीन की जांच एक विशिष्ट एसएलबी बाध्यकारी प्रयोग का एक प्रवाह संरेखण चित्रा 4 में दर्शाया गया है। पीएच मॉडुलन परख का सिद्धांत उदाहरण के रूप में पीएच डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 बाइंडिंग के उपयोग से चित्रा 5 में दिखाया गया है। इस अध्ययन से प्राप्त परिणामों से सुझाव मिलता है कि पीएच डोमेन पीआई (4,5) पी -2- एसोसिएशन एसएलबी से जुड़ा हुआ है। अधिक विशेष रूप से, हमने पाया है कि बाध्यकारी पर, स्थानीय पीएच अधिक बुनियादी हो गया। इस स्थानीय पीएच परिवर्तन SLBs भीतर एसआरबी-पोप फ्लोरोसेंट जांच वर्तमान है, जो फिर उसके अनुसार ठंडा किया गया था (चित्रा 6A, 6C) द्वारा महसूस किया गया था। शमन पर निर्भर एकाग्रता और संतृप्त था, इसलिए लैंगमुइर आईसोडेम के डेटा को फिटिंग को एक कश्मीर डी, 0.3 9 ± 0.05 माइक्रोग्राम ( चित्रा 6 बी , 6 डी ) का ऐप मिला। पीएच डोमेन ने पीआई (4,5) पी 2 की तरफ चुनिंदा दिखाया क्योंकि पीओपीसी (ज़्विटीयोनिक लिपिड) के प्रति कोई बाध्यकारी नहीं देखा गया था, और पीआई 4 पी युक्त एसएलबी ( के डी, ऐप = 1.02 ± 0.20 माइक्रोन) ( चित्रा 6 बी ) के प्रति कमजोर बाध्यकारी है। प्रतिदीप्ति डेटा पर कार्रवाई की जाती है यह दिखाने के लिए एक नमूना गणना शामिल है ( चित्रा 7 )। चित्रा 8 में , एसओएलबी और माइक्रोचैनल्स की गुणवत्ता का निर्धारण करने के लिए माइक्रोचैनल छवियों की श्रृंखला प्रस्तुत की जाती है।

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पीआईपी-ऑन-ए-चिप माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस। ( ) माइक्रोफ़्लुइड डिवाइस में 8 इनटलेट्स और 8 आउटलेट वाले 8 माइक्रोचैनल हैं। इस चित्र में चैनल को देखने के लिए रंगीन समाधान सामने आए। डिवाइस 2.0 सेमी चौड़ाई (एक्स), ऊंचाई (सेमी) 0.5 सेमी और लंबाई में 3.0 सेमी (जेड) है। ( बी ) माइक्रोचैनल का फर्श कांच है, जबकि दीवारों और छत पॉलीडिमैथिलसिलोक्सैन (पीडीएमएस) से बने होते हैं। प्रत्येक माइक्रोचैनल 100 माइक्रोग्राम की चौड़ाई, ऊंचाई में 40 माइक्रोन और लंबाई में 1 सेंटीमीटर है। दो आसन्न माइक्रो चैनलों के बीच की दूरी 40 माइक्रोन है। समर्थित लिपिड बिलेयर (एसएलबी) गिलास सतह के शीर्ष पर बनते हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2. लघु अनियमितेर पुटिका (एसयूवी) तैयारी और गुणवत्ता नियंत्रण अध्ययन ( ) झिल्ली बनाने में इस्तेमाल लिपिड घटकों: ओर्थो -सुलफोहोडामाइन बी-पोप ( एसआरबी-पोप), एल-α-फॉस्फेटिडाइथोलॉजिटोल -4-फॉस्फेट (पीआई 4 पी), एल-α-फॉस्फातिडाइलिनोटोल -4,5-बिस्फोस्फेट पीआई (4,5) पी 2 ), और 1-पाल्मोत्यल -2 ऑलॉयल- एस -ग्लिसरो-3-फोस्फोोकोलिन (पीओपीसी)। ( बी ) लिपिड vesicles के प्रकार: एसयूवी, बड़े unilamellar vesicle (एलयूवी), विशाल unilamellar vesicle (जीयूवी), और multilamellar vesicle (एमएलवी)। एसएलबी 34 की तैयारी के लिए एसयूवी सर्वोत्तम अनुकूल हैं ( सी ) vesicles पोस्ट-लिपिड एक्सट्रूज़न (0.1 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से) के आकार पर गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) आधारित पुष्टिकरण। 53.9 एनएम की हाइड्रोडायनेमिक त्रिज्या (आरएच) पुष्टि करती है कि मी पुटिका के आकार के वितरण का इमान ~ 100 एनएम है। परिणाम पीआई (4,5) पी -2- एसोसिएट एसयूवी से माप का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एक गिलास समर्थन पर एसएलबी गठन। ( ) वांछित लिपिड संरचना के फंक्शंस तैयार किए जाते हैं और फिर माइक्रोचैनल के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। Vesicles ग्लास की सतह के लिए adsorbed और विकृत कर रहे हैं। एक बार जब एक महत्वपूर्ण सतह कवरेज हासिल की जाती है, तो एसएलबी बनाने के लिए स्वैच्छिक टूटना संदर्भ 35 , 36 से अनुकूलित। ( बी ) एक 10X उद्देश्य के तहत एक डिवाइस के भीतर SLBs दिखाया गया है। एलेक्सा 568 फिल्टर सेट (576/603 एनएम पर उत्तेजना / उत्सर्जन) का उपयोग किया जाता है।Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक सामान्य एसएलबी बाध्यकारी प्रयोग के फ्लोचार्ट। माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस घटकों यानी नमूनों वाले PDMS ब्लॉक और साफ कवर लिप्स ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ इलाज किया जाता है जिससे दोनों सतहों को हाइड्रोफिलिक बनाया जाता है और फिर इकट्ठा होता है। एसएलबी बनाने के लिए एसयूवी माइक्रोचैनल के माध्यम से प्रवाहित होते हैं अतिरिक्त vesicles हटाए जाते हैं और एसएलबी एक चल बफर समाधान बहते हुए प्रयोगात्मक स्थितियों में समतल होते हैं। फिर, प्रोटीन dilutions माइक्रोचैनल के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। अंत में, प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा का विश्लेषण, सामान्यीकृत होता है, और प्रोटीन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया जाता है। सामान्यीकृत डेटा एक स्पष्ट हदबंदी निरंतर ( K d, app ) VA निकालने के लिए किसी फ़ंक्शन के लिए फिट हैलुए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: पीएच मॉडुलन-आधारित सेंसिंग के सिद्धांत ( ) पीआई (4,5) पी 2 हेड ग्रुप इनोसिटोल 1,4,5-टीआरसिफोस्फेट (आईएनएस (1,4,5) पी 3 ) (पीडीबी) के साथ पीएलसी-डीडीए PH डोमेन के एक्स-रे क्रिस्टल संरचना आईडी: 1 एमएमआई) 37 (बी) एसआरबी-पोप जांच कम पीएच पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट और 7.5 मोल% PI (4,5) पी 2 SLBs इन्तेरेलयूकिन के रूप में पीएच अनुमापन वक्र में संकेत के भीतर 6.7 की एक pKa के साथ उच्च पीएच पर ठंडा है। ( सी ) इस अध्ययन में इस्तेमाल किए जाने वाले पीएच डोमेन में 8.4 का एक ईयोबिकल बिंदु (पीआई) है, इसलिए प्रायोगिक पीएच (7.0) में प्रोटीन सकारात्मक रूप से चार्ज किया गया है। एक शुद्ध सकारात्मक सी चलानादरअसल, प्रोटीन ओएच - आयनों को आकर्षित करती है। शारीरिक रूप से विकलांग डोमेन पीआई को बांधता है जब (4,5) पी 2 SLBs इन्तेरेलयूकिन, यह ओह लाता है - झिल्ली सतह के आयनों, इंटरफेसियल संभावित ठीक किया जाता है जो बदले में एसआरबी-पोप की protonation राज्य बदलाव, और इसकी प्रतिदीप्ति पीएच डोमेन एकाग्रता-निर्भर तरीके से बुझती है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
6 चित्रा: पीएच मॉडुलन के माध्यम से मॉनिटर पीएलसी-डीडीआई पीएच-झिल्ली बाध्यकारी ( ) पीएच डोमेन को संकेतित सांद्रता पर जोड़ने से पहले और बाद में माइक्रोचैनल्स का नज़रिया। ( बी ) पीओपीसी, पीआई 4 पी और पीआई (4,5) पी -2- एसएलबी के साथ संबंधों की तुलना पीएच डोमेन बाध्यकारी 7.5 मॉल% पीआई (4,5) पी -2- एसएलबी के साथ-साथ कश्मीर डी, 0.3 9 ± 0.05 माइक्रोग्राम का एप मिला । कमजोर बाध्यकारी 7.5 मिलीग्राम पीआई 4 पी युक्त एसएलबी ( के डी, 1.02 ± 0.20 माइक्रोग्राम की ऐप ) की ओर देखा गया था और शुद्ध पोपसी एसएलबी के लिए कोई बाध्यकारी नहीं देखा गया था। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है (एन = 3)। दो-पूंछ टी -टेस्ट का उपयोग पीआई 4 पी और पीआई (4,5) पी 2 बाइंडिंग (* पी = 0.0396) के बीच संबंधों की तुलना करने के लिए किया गया था। ( सी ) पीओपीसी, पीआई 4 पी, और पीआई (4,5) पी 2 बाइंडिंग प्रयोगों के लिए पिक्सेल्स में दूरी के एक फ़ंक्शन के रूप में माइक्रोचैनल्स में रेखा स्कैन से प्रतिदीप्ति तीव्रताएं प्लॉट की गई हैं। ( डी ) सामान्यीकृत और औसतन पीओपीसी, पीआई 4 पी, और पीआई (4,5) पी 2 बाइंडिंग डेटा को पीएलसी-डीडीए PH डोमेन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में रखा गया है और फिर के डी, ऐप को निकालने के लिए लैंगम्यूर आईएसओरम के लिए फिट है। विवरण के लिए चरण 8.4 में समीकरण देखें।"Target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: डाटा प्रोसेसिंग के लिए नमूना गणना। ( ) से पहले (काला) और (लाल) प्रोटीन अनुमापन लाइन खाली (कोई प्रोटीन) और प्रोटीन चैनल, जहां प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा पिक्सल में दूरी के एक समारोह के रूप में प्रस्तुत किया जाता है के लिए स्कैन डेटा स्कैन। छायांकित क्षेत्रों उन क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो गणनाओं के लिए डेटा निकालने के लिए उपयोग किए गए थे। बेसलाइन प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा प्रत्येक चैनल के पहले और बाद में निकाला जाता है। ( बी ) प्रोटीन टाइपटेशन से पहले और बाद में दोनों खाली और प्रोटीन चैनलों के लिए डेटा निकाला जाता है। औसत आधार रेखा के लिए और एक चैनल प्रतिदीप्ति डेटा के लिए लिया जाता है बेसलाइन घटाव के बाद, रिक्त चैनल में प्रतिदीप्ति डेटा सामान्यीकृत होता है। विवरण के लिए चरण 8.3 में समीकरण देखें। Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: एसएलबी और माइक्रोचैनल्स की अखंडता का आकलन करें। ( ) उच्च गुणवत्ता वाली SLBs और माइक्रो चैनलों को चित्रित करते हुए एक चित्र ( बी ) अधूरा संलयन ( सी ) जुड़े माइक्रोचैनल ( डी ) धूल कण माइक्रोचैनेल के भीतर फंस गया। ( ) माइक्रोबैनल में फंसे एयर बुलबुले। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पूरक फ़ाइल 1: Pattern_Design.dwgरिक्त "> कृपया फ़ाइल डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रत्येक पीआईपी संस्करण, कम सांद्रता पर यद्यपि विशिष्ट ऑर्गेनल्स की साइटोसोलिक सतह पर मौजूद है, जहां वे ऑगनेलर झिल्ली 1 की एक अनूठी भौतिक संरचना और कार्यात्मक विशिष्टता की स्थापना में योगदान करते हैं। पीआईपी का सबसे महत्वपूर्ण उपयोग एक विशिष्ट डॉकिंग प्लेटफॉर्म के रूप में है जिसमें प्रोटीनों की विशिष्ट उपशीर्षिकी स्थानीयकरण और / या सक्रियण 6 , 7 की आवश्यकता होती है। सेलुलर फिजियोलॉजी और बीमारी में उनकी भूमिका के कारण, एक भौतिक विज्ञान संबंधी प्रासंगिक संदर्भ में इन विट्रो में प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित परख प्रारूप में एक को तरल पदार्थ लिपिड बिलेयर के संदर्भ में प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन पर विचार करना पड़ता है, जो ध्रुवीय सिर समूह की सामान्य प्रस्तुति के साथ, और प्राकृतिक-लम्बी फैटी एस्क श्रृंखलाओं के साथ फास्फोलिपिड्स के मिश्रण की उपस्थिति में होता है।

इस परख, संयोजन मेंइसकी पहचान प्रणाली के रूप में पीएच मॉडुलन के साथ, और एसएलबी एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में स्थापित मॉडल झिल्ली प्रणाली के रूप में, अन्य झिल्ली बाध्यकारी तकनीकों की तुलना में अद्वितीय फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, माइक्रोफ़्लुइडिक प्लेटफॉर्म प्रयुक्त प्रोटीन और लिपिड्स (40 एनएल समग्र चैनल वॉल्यूम, 1.0 एमएम 2 एसएलबी सतह क्षेत्र) के लिए कम मात्रा की आवश्यकताओं के कारण सामग्री पर बचाता है। इसके अलावा, शारीरिक रूप से प्रासंगिक लिपिड रचनाओं का उपयोग किया जा सकता है, जबकि दो-आयामी झिल्ली तरलता (≥1.0 माइक्रोन 2 / एस) 28 , 38 को बनाए रखते हुए। पहचान प्रणाली, आईटीसी, एसपीआर और क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबलेंस की तुलना में शोर अनुपात में सुधारा संकेत प्रदान करती है, जो कि अपव्यय (क्यूसीएम-डी) मॉनिटरिंग के साथ होती है, जो कि न केवल प्रोटीन-झिल्ली बातचीत का परीक्षण करता है, लेकिन आयन, छोटे अणु, पेप्टाइड-झिल्ली अंतर अच्छी तरह से 1 9 , 20 , 3 9 , 40 साथ ही, पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच बेहद स्थिर है और प्रयोगात्मक शर्तों के तहत 1 9 , 20 , 41 की जांच नहीं करता है। इस मंच का एक अन्य लाभ झिल्ली सतहों को नेत्रहीन रूप से देखने की क्षमता है। कुछ बातचीत लिपिड माइक्रोडोमैन गठन और / या झिल्ली की तरलता को प्रभावित कर सकती हैं, जिसे प्रत्यक्ष रूप से देखा जा सकता है / और फोटोबलीचिंग (एफआरएपी) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के माध्यम से परीक्षण किया जा सकता है, क्रमशः 42 । यहाँ वर्णित परख को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से परे किसी महंगी उपकरण की आवश्यकता नहीं है। अंत में, और सबसे महत्वपूर्ण बात, लिगेंड / रिसेप्टर लेबलिंग की अनुपस्थिति में झिल्ली का विश्लेषण करने से पारम्परिक लोगों पर पीआईपी-ऑन-ए-चिप चिपका पसंदीदा तरीका होता है।

हालांकि पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख एक शक्तिशाली तकनीक है, परिधीय झिल्ली प्रोटीन भिन्न हो सकती हैएआर और कैथिक और एनोनिक अवशेषों की समग्र संरचना में और बाध्यकारी साइट के भीतर / उनके वितरण के भीतर, जो कुछ चुनौतियां पैदा करते हैं कुछ प्रोटीनों में कई मूल अवशेषों से पीआईपी-बाध्यकारी साइटें हैं, जबकि अन्य में केवल कुछ ही हैं। इसलिए, बाध्यकारी साइट पर H + / OH - अनुपात अलग होने जा रहा है, और यह भी बाध्यकारी पर स्थानीय पीएच में बदलाव की परिमाण है। बातचीत के स्टोइकीओमेट्री और पीआईपी बाध्यकारी अन्य लिपिड के साथ बातचीत से स्थिर है या नहीं, इस मामले को जटिल बनाता है। तदनुसार, एक प्रोटीन के पीआई, विशेष रूप से एक बड़ी प्रोटीन के लिए, अपेक्षित प्रतिदीप्ति परिवर्तन का एकमात्र सूचक नहीं हो सकता है। जबकि कुछ प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप बड़े प्रतिदीप्ति परिवर्तन होंगे, बाकी के परिणामस्वरूप छोटे प्रतिदीप्ति परिवर्तन हो सकते हैं। उत्तरार्द्ध मामले में, शोर अनुपात में संकेत को बढ़ाने के लिए कम से कम दो क्रियाएं ली जा सकती हैं: 1) प्रोटीन की संख्या बढ़ाने के लिए बिलेटर पर बड़े पीआईपी स्तर का उपयोग करनासतह के लिए ecruited, यानी भर्ती ओह की संख्या में वृद्धि - आयनों और quenched SRB- पोप अणुओं की संख्या; 2) शोर अनुपात में संकेत को बढ़ाने के लिए SRB-POPE के स्तर में वृद्धि

यद्यपि वर्तमान मंच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए कई फायदे प्रदान करता है, ट्रांसमैमब्र्रेन प्रोटीन के अध्ययन के लिए कुछ चुनौतियां हैं। एसएलबी ग्लास के समर्थन की निकटता (लिपिड संरचना के आधार पर पानी की परत लगभग 1-2 एनएम है) के कारण ट्रांसमीटर एब्रोन प्रोटीन-ग्लास समर्थन इंटरैक्शन प्रोटीन विकृति को बढ़ावा दे सकता है, कार्य के नुकसान को जन्म दे सकता है, और स्थिरीकरण 34 , 43 , 44 , 45 । भले ही इसमें अधिक सम्मिलित हो, इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है, जैसे कि पॉलिमर तकिया प्रदान करने के लिए कांच समर्थन की सतह संशोधन या लिपोपोलिमेम सहितएसएलबी ग्लास समर्थन दूरी 34 , 46 , 47 , 48 को बढ़ाने के लिए bilayer के भीतर आर टेथर्स (उदाहरण के लिए पेजीलाटेड लिपिड्स)।

उच्च गुणवत्ता वाले एसएलबी बनाने से पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख ( चित्रा 8 ए ) का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है। स्वच्छ कंसल्टों और ताजा एसयूवी का उपयोग करने के लिए प्रत्यावर्तनीयता को आश्वस्त करने की सिफारिश की गई है। एनीओनिक लिपिड्स की उपस्थिति के कारण, जैसे पीआई (4,5) पी 2 , एसयूवी नकारात्मक रूप से चार्ज किए जाते हैं, जो एसयूवी टूटने की दक्षता को कम करती है और झिल्ली की तरलता को प्रभावित करती है ( चित्रा 8 बी )। इसलिए, पीयू (4,5) पी 2 हेड ग्रुप फॉस्फेट प्रोटोनेट करने के लिए एसयूवी समाधान के पीएच समायोजन महत्वपूर्ण है और कटाई के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण को कम करने की क्षमता 49 , 50 को बढ़ाती है। एसयूवी जिसमें एनोनिक एल नहीं होता हैआईफ़िड्स, किसी भी पीएच समायोजन की आवश्यकता नहीं है इसके अलावा, ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार और बंधन के बाद, चैनलों में एसयूवी को इंजेक्ट किया जाना चाहिए, जबकि ग्लास कंसलिप सतह अभी भी हाइड्रोफिलिक है, जो कि एसएलबी गठन के लिए आवश्यक है। एसएलबी गुणवत्ता के अलावा, धूल कण एक अन्य मुद्दे का प्रतिनिधित्व करते हैं। डिवाइस निर्माण प्रक्रिया के दौरान, चैनलों के बीच फंसने वाला धूल कण चैनल संलयन पैदा कर सकता है, जबकि एक चैनल के अंदर फंसने वाला धूल कण एसएलबी को नुकसान पहुंचा सकता है और / या समाधान प्रवाह की गति ( चित्रा 8 सी, 8 डी ) कम कर सकता है। काम के क्षेत्र को समय-समय पर धूल हटाने के लिए साफ किया जाना चाहिए। इसी प्रकार, एक चैनल में एक हवाई बुलबुले के जोखिम को किसी भी कदम से बचा जाना चाहिए, जो अन्यथा एसएलबी को अपरिवर्तनीय ( चित्रा 8 ई ) को नुकसान पहुंचाएगा।

पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख की योजना बनाते समय एक अन्य पैरामीटर पर विचार करना प्रोटीन स्टोरेज बफर है। यदि उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया जाता है, तो व्यक्तिगत घटकों (स्थिर एजेंटों, एजेंटों को कम करना, लवण, रोगाणुरोधी एजेंट, चेलेटिंग अभिकर्मकों आदि ) प्रतिदीप्ति और / या एसएलबी अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, भंडारण बफर को इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए titrated चाहिए। यदि कोई प्रभाव देखा जाता है, तो प्रतिदीप्ति में एक बहाव को रोकने के लिए प्रोटीन को टाइटट्रेट करने से पहले SLBs को भंडारण बफर स्थितियों में समतल किया जाना चाहिए। यह देखते हुए कि यह एक पीएच मॉडुलन आधारित परख है, यदि संभव हो तो, शुद्ध प्रोटीन में बफ़र बेमेल के चलते प्रतिदीप्ति में बहाव को कम करने के लिए चल बफर (इस मामले में पीएच 7.0 में 20 मिमी एचईपीएस) के रूप में एक ही बफरिंग घटक होना चाहिए।

अंत में, हमने दिखाया है कि पीएच मॉडुलन परख प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन की जांच के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि पीआईपी पर जोर दिया गया था, हालांकि इस मंच का उपयोग अधिक जटिल झिल्ली प्रणालियों के साथ बातचीत का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जिसमें अन्य फिजियोलॉजिकल से संबंधित लिपिड जैसे फास्फेटिडाइलेसेरीने, फॉस्फेटिडेलेथानोलमाइन, फॉस्फेटिडीक एसिड, और कोलेस्ट्रॉल, 28 , 3 9 , 42 , 51 के बीच में । सेलुलर प्रोटीन से परे, यह परख प्लेटफार्म भी मानव रोगजनकों के अध्ययन के लिए फायदेमंद हो सकता है। उदाहरण के लिए, वायरस और बैक्टीरिया द्वारा एन्कोडेड प्रोटीन को सेलुलर झिल्ली के साथ इंटरैक्ट करने के लिए दिखाया गया है और कुछ विशिष्ट रूप से 52 , 53 , 54 , 55 , 56 पीआईपी के साथ। तदनुसार, पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन के छोटे-अणु अवरोधकों को खोज और विशेषता के लिए एक साधन प्रदान कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डीएस और सीईसी का समर्थन, भाग में, अनुदान AI053531 (एनआईआईआईडी, एनआईएच) द्वारा किया गया था; एसएस और पीएससी को अनुदान N00014-14-1-0792 (ओएनआर) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

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