PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Talrijke cellulaire eiwitten interageren met membraanoppervlakken om essentiële cellulaire processen te beïnvloeden. Deze interacties kunnen gericht zijn op een specifieke lipidcomponent binnen een membraan, zoals bij fosfoinositiden (PIP's), om specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie te waarborgen. PIP's en cellulaire PIP-bindende domeinen zijn uitgebreid bestudeerd om hun rol in cellulaire fysiologie beter te begrijpen. We hebben een pH-modulatie-analyse toegepast op ondersteunde lipid bilayers (SLB's) als middel om eiwit-PIP-interacties te bestuderen. In deze studies wordt pH-gevoelige ortho- sulforhodamine B geconjugeerde fosfatidylethanolamine gebruikt om eiwit-PIP-interacties te detecteren. Bij binding van een eiwit aan een PIP-bevattend membraanoppervlak wordt het grensvlakpotentiaal gemoduleerd ( dwz verandering in lokale pH), waarbij de protonatietoestand van de probe wordt verplaatst. Een casestudy van het succesvolle gebruik van de pH-modulatie-analyse wordt gepresenteerd door gebruik te maken van fosfolipase C delta1 Pleckstrin Homologie (PLC-δ1 PH) domein en fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) interactie voorbeeld. De schijnbare dissociatieconstante ( Kd , app ) voor deze interactie was 0,39 ± 0,05 μM, vergelijkbaar met Kd , appwaarden verkregen door anderen. Zoals eerder opgemerkt, de PLC-δ1 PH domein PI (4,5) P2 bepaald, toont zwakkere binding aan fosfatidylinositol-4-fosfaat en geen binding aan zuiver fosfatidylcholine SLBs. De PIP-op-een-chip-analyse is voordelig boven de traditionele PIP-bindingsassays, waaronder maar niet beperkt tot een laag monstervolume en geen eisen voor ligand / receptor-etikettering, het vermogen om membraaninteracties met hoge en lage affiniteit te testen met zowel kleine als Grote moleculen, en verbeterde signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zal het gebruik van de PIP-on-a-chip-aanpak het verhelderen van mechanismen van een breed scala van membraaninteracties vergemakkelijken. Bovendien kan deze methode u mogelijk zijnSed in identificerende therapieën die het vermogen van eiwit om met membranen te interageren moduleren.

Introduction

Myriade interacties en biochemische processen vinden plaats op tweedimensionale vloeistof membraanoppervlakken. Membraan-omsloten organellen in eukaryote cellen zijn uniek, niet alleen in biochemische processen en hun bijbehorende proteome maar ook in hun lipidsamenstelling. Een uitzonderlijke klasse fosfolipiden is fosfoinositiden (PIP's). Hoewel ze slechts 1% van het cellulair lipidoom omvatten, spelen ze een cruciale rol in signaaltransductie, autofagie en membraanhandel, onder andere 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische fosforylering van de inositol-hoofdgroep door cellulaire PIP-kinasen leidt tot zeven PIP-hoofdgroepen die mono-, bis- of trisfosforyleerd zijn 5 . Bovendien definiëren PIP's de subcellulaire identiteit van membranen en dienen als gespecialiseerde membraan docking sites voor proteïnen / enzymen die één of meer fosfoïnen bevattenBindende domeinen, bijvoorbeeld Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) en epsin N-terminale Homology (ENTH) 6 , 7 . Een van de best bestudeerde PIP-bindende domeinen is fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domein dat specifiek interageert met fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) bij een hoge nanomolaire laag micromolaire gebied affiniteit 8 , 9 , 10 , 11 .

Er zijn verschillende kwalitatieve en kwantitatieve in vitro methoden ontwikkeld en gebruikt om het mechanisme, de thermodynamica en de specificiteit van deze interacties te bestuderen. Onder de meest gebruikelijke PIP-bindende assays zijn oppervlakte plasmon resonantie (SPR), isothermale calorimetrie (ITC), NMR-spectroscopie, liposome flotatie / sedimentatie assay en lipide-blots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Alhoewel deze uitgebreid worden gebruikt, hebben ze allemaal veel nadelen. Bijvoorbeeld, SPR, ITC en NMR vereisen grote hoeveelheden monster, dure instrumentatie en / of getraind personeel 12 , 13 . Enkele assayformaten zoals antilichamen gebaseerde lipide-blots gebruiken wateroplosbare vormen van PIP's en presenteren ze op een nonfysiologische wijze 12 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kunnen lipide-blots niet betrouwbaar worden gekwantificeerd en hebben ze vaak geleid tot valse positieve / negatieve waarnemingen 12 , 17 , 18 . Om deze uitdagingen te overwinnen en te verbeteren op de huidige gereedschapsset werd een nieuwe labelvrije methode op basis van een ondersteunde lipid bilayer (SLB) opgesteld in het kader van am Microfluidisch platform, dat succesvol werd toegepast op de studie van eiwit-PIP-interacties ( Figuur 1 ) 19 .

De strategie die wordt gebruikt voor het detecteren van eiwit-PIP-interacties is gebaseerd op pH-modulatie detectie. Dit omvat een pH-gevoelige kleurstof die ortho- sulforhodamine B ( o SRB) direct geconjugeerd is met fosfatidylethanolamine lipide hoofdgroep 20 . O SRB-POPE probe (Figuur 2A) is sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa ongeveer 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs (Figuur 5B). PLC-δ1 PH domein is uitgebreid gebruikt voor het valideren eiwit-PIP-bindende methoden vanwege de hoge specificiteit voor PI (4,5) P2 (figuur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, redeneerden we dat de PLC-δ1 PH-domein kan worden gebruikt om te testen de binding aan PI (4,5) P2 via het PIP-on-a-chip assay. Het PH-gebied construct in deze studie gebruikte een netto positieve lading (pi 8,4), en daardoor aantrekt OH -. ionen (figuur 5C) bij binding aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, het PH domein brengt de OH - ionen aan de Membraanoppervlak, dat op zijn beurt het grensvlakpotentiaal moduleert en de protonatietoestand van o SRB-POPE ( Figuur 5C ) 26 verplaatst. Als een functie van de PH-domeinconcentratie wordt de fluorescentie uitgeblust ( Figuur 6A ). Ten slotte zijn de genormaliseerde gegevens passen bij een bindingsisotherm om de affiniteit van het PH-domein-PI (4,5) P2 interactie (Figuur 6B, 6C). bepalen </ P>

In deze studie wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om eiwitbinding uit te voeren naar PIP-bevattende SLB's in een microfluïdisch platform. Dit protocol neemt de lezer van het samenstellen van het microfluïdische apparaat en de vesikelpreparatie op SLB-vorming en eiwitbinding. Bovendien aanwijzingen voor gegevensanalyse affiniteitinformatie voor PLC-δ1 PH domein-PI (4,5) P2 interactie verschaft extraheren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reiniging van de glazen dekjes

  1. Verdun 7x Schoonmaakoplossing (zie Materialetafel ) 7-voudig met gedeïoniseerd water in een 100 mm diep borosilicaatglasschotel met een platte bodem en verhit het tot 95 ° C op een kookplaat voor 20 minuten of tot de bewolkte oplossing duidelijk wordt .
    OPMERKING: De oplossing wordt heet, gebruik voorzichtigheid om lichamelijk letsel te vermijden. De 7x Reinigingsoplossing is een eigengemaakt mengsel van hexasodium [oxido- [oxido (fosfonatooxy) fosforyl] oxyfosforyl] fosfaat, 2- (2-butoxyethoxy) ethanol, natrium 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutaan -2-sulfonaat en niet-gevaarlijke toevoegingen.
  2. Met behulp van tweezers regelt u de dekglazen (40 mm lengte x 22 mm breedte x 0,16-0,19 mm hoogte) op een aluminium vlekrek in afwisselende richtingen. Houd een lege plek tussen elke deklaag om te voorkomen dat ze elkaar aanraken.
  3. Vul het vlekrek volledig met de deklagen in de schoonmaakoplossing. Houd de deklagen inDe oplossing gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Als het water verdampt, houd het toevoegen van vers gedeïoniseerd water om de oplossingconcentratie ongewijzigd te houden.
  4. Verwijder de vlekrekjes uit de schoonmaakoplossing en was de dekglazen met overvloedig hoeveelheden gedeïoniseerd water om het wasmiddel te verwijderen.
  5. Droog de dekglazen met stikstofgas (ongeveer 5 minuten per vlekrek) en plaats de dekglazen in een oven voor 6 uur bij 550 ° C voor het gloeien.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap die ruwe eigenschappen op het glasoppervlak vergemakkelijkt.
  6. Plaats de dekglazen in een plastic houder en houd ze weg van stof.

2. Fabricage van Micropatterned PDMS Blocks

  1. Meng polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer en het verhardingsmiddel bij een verhouding van 10: 1 (w / w) in een grote plastic weegboot en ontlucht het in vacuüm gedurende 1 uur met vacuümsterkte bij 500 Torr of minder.
    OPMERKING: PDMS is een transparant en inert siliconenpolymeer. Om het gewenste PDMS blok t te krijgenHikheid (0,5 cm), meng 55 g van het prepolymeer met 5,5 g van het verhardingsmiddel.
  2. Plaats de siliciummeester die meerdere replicaten van dezelfde SU-8 micropattern bevat in een grote (10 cm basis diameter) plastic weegboot en giet de afgegasde PDMS in. Zet het vervolgens in een droge oven bij 60 ° C overnacht.
    OPMERKING: Micropatterns zijn groot genoeg om te zien met het blote oog. Elk patroon bevat 8 microkanalen (100 μm breedte x 40 μm hoogte x 1 cm lengte) met een tussenafstand van 40 μm ( Figuur 1A , 1B ). Silicon wafer vorm bestaande uit hard gebakken SU-8 fotoresist was vervaardigd in een nanofabricatie faciliteit 27 . Andere benaderingen voor masterbereiding zijn het etsen van hydrofluorzuur (HF), hoge temperatuur water etsen, xurografie en 3D-afdrukken 28 , 29 , 30 , 31 . commercIal bronnen voor silicium master voorbereiding kunnen ook worden gebruikt. De patronen voor het microfluïdische apparaat werden ontworpen met een opmaaksoftware (zie tabel van materialen). Het originele bestand met het patroonontwerp wordt geleverd als aanvullend bestand "Pattern Design.dwg", die rechtstreeks aan de fabrikant kan worden verstrekt.
  3. Zet de PDMS voorzichtig af van de siliconenmeester met de handen. Merk de grenzen van elke micropattern in rechthoeken met behulp van een chirurgische scalpel en een liniaal. Snijd dan de PDMS in blokken.
  4. Punch 16 gaten (8 inlaten en 8 uitlaten per blok) aan beide uiteinden van elke microkanaal met een biopsiestempel (1,0 mm gat diameter) zoals aangegeven in figuur 3B .
  5. Breng tape over elk PDMS-blok aan om de micropatterns te beschermen tegen beschadiging en stof. Bewaar ze in een plastic container.

3. Het voorbereiden van kleine Unilamellaire Vesicles (SUV's)

OPMERKING: Negatieve controle tweelaagse samenstellingIs 99,5 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocholine (POPC) en 0,5 mol% ortho- sulforhodamine B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoethanolamine ( o SRB- PAUS). Test-bilayer samenstelling is 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE en 7,5 mol% van hetzij L-a-fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P) of L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PI 4,5) P2). Hieronder is de procedure voor het bereiden 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE en 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SUV. De synthese van o SRB-POPE die in deze studie werd gebruikt werd 20 eerder beschreven.

  1. Bereken het volume van POPC, PI (4,5) P2 en o SRB-POPE dat moet gemengd, die goed is voor de volgende totale hoeveelheden: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P2, En 2,1 x 10 -5 mg o SRB-POPE.
  2. Pipet het berekende volume POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE in een enkele 20 ml glazen scintillatie flesje.
    OPMERKING: POPC en o SRB-POPE voorraadoplossingen komen in een chloroformoplossing, terwijl de PI (4,5) P 2 (en andere fosfoinositiden) voorraad in een oplosmiddelmengsel van chloroform: methanol: water (20: 9: 1) komt. Voor nauwkeurigheid, nat de pipetpunt met chloroform voordat u het gebruikt. Voor de veiligheid moet deze stap in een chemische afzuigkap plaatsvinden.
  3. Droog het mengsel gedurende 10 minuten in een stroom stikstofgas in een chemische dampkap of tot het oplosmiddel verdampt en een dunne lipide film onderaan de fles vormt.
  4. Droog het mengsel onder vacuüm gedurende ≥ 3 uur bij een vacuümsterkte van 10 mTorr om eventuele resterende organische oplosmiddelen te verwijderen.
    OPMERKING: De 3 uur uitdrogingstijd is voldoende voor de schaal van SUV-voorbereiding die in dit protocol wordt beschreven, dat voldoende is voor 50 experimenten. Als een grotere schaal van SUV-voorbereiding nodig is, kan de nacht uitdroging worden uitgevoerd.
  5. Rehydrateer de drElke lipidfilm met 5 ml loopbuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, bij pH 7,0) en plaats 30 minuten bij een RT in een ultrasoonbad bij een werkfrequentie van 35 kHz.
    OPMERKING: Het mengen van de hoeveelheden lipiden die zijn gespecificeerd in stap 3.1 en het toevoegen van 5 ml loopbuffer in stap 3.5 levert een vesicelsuspensie op 0,5 mg / ml. Op dit stadium is de vesicelsuspensie een mix van unilamellaire en multilamellaire vesicles ( Figuur 2B ). De oplossing verschijnt roze / paars in kleur en relatief onbeleefd.
  6. Bevroren de vesicelsuspensie met vloeibaar stikstof en waterbad bij 40 ° C om unilamellaire vesicles te krijgen. Herhaal de vries-ontdooi 10 keer.
    OPMERKING: (Optioneel) Om de afwezigheid van niet-unilamellaire blaasjes in de suspensie te verzekeren, kan de centrifugeringsstap 32 , 33 worden toegepast.
  7. Extrudeer de vesicle suspensie door een 0,10 μm track-etched polycarbonaat membraan met behulp van een lipide extruder (zieTabel van materialen) om te verrijken voor SUV's. Herhaal de extrusie 10 keer.
    OPMERKING: een 15 ml conische buis kan worden gebruikt om de geëxtrudeerde blaasjes te verzamelen. De oplossing moet in dit stadium onduidelijk zijn. SUV-diameter kan bevestigd worden via dynamische lichtverspreiding (DLS) ( Figuur 2C ). SUV's zijn het beste geschikt voor het vormen van SLB's 34 .
  8. Bedek de kegelbuis met aluminiumfolie en berg deze bij 4 ° C tot het klaar is voor gebruik.

4. Montage van het microfluïdische apparaat

  1. Test de inlaten en uitlaten van het PDMS-blok voor verstopping door het gedeioniseerde water door de gaten te spuiten met een waterwasfles. Droog vervolgens het PDMS-blok met stikstofgas.
    OPMERKING: In deze stap worden ook stofdeeltjes verwijderd die binnen en / of tussen kanalen zijn opgesloten. Indien nodig, verwijder voorgevormde deklagen met stikstofgas om stofdeeltjes te verwijderen.
  2. Plaats het PDMS-blok en de voorreinigingDeklaag (zie rubriek 1) in het zuurstofplasma-systeem (zie tabel van de materialen) monsterkamer om gedurende 45 s met zuurstofplasma bloot te stellen aan 45 watt met stroominstelling bij 75 watt, zuurstofstroom bij 10 cm 3 / min en vacuümsterkte bij 200 mTorr .
  3. Plaats het patroonoppervlak van het PDMS-blok onmiddellijk na de zuurstofplasma-behandeling in contact met de deklaag. Druk voorzichtig op om luchtbellen op contactplaatsen te verwijderen.
  4. Plaats het apparaat gedurende 3 minuten op een kookplaat bij 100 ° C om de binding te verbeteren.
  5. Gebruik een natte pluisvrije doek ( bijv. Kimwipe) met 100% ethanol om stofdeeltjes van de bovenkant (PDMS) en de bodem (glas) van het apparaat te verwijderen. Plak dan het apparaat op een glasmicroscoopschuif.
    OPMERKING: Gebruik geen te grote hoeveelheid ethanol en voorkom dat ethanol in de inlaat- en uitlaatkanalen komt. Het uitvoeren van deze stap, terwijl het toestel nog steeds warm is, wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat de ethanol onmiddellijk verdampt. Glas micrOscopy glijbanen kunnen in 100% ethanoloplossing worden opgeslagen om stof en andere verontreinigingen te verwijderen.

5. Het vormen van ondersteunde lipide bilayers (SLB's)

  1. Breng 100 pi van PI (4,5) P2 bevattende SUV uit stap 3.8 in een 0,65 ml microcentrifugebuis. Pas de pH van de oplossing op op ~ 3,2 door 6.4 μL 0,2 N zoutzuur toe te voegen.
    OPMERKING: Bevestig de pH van de oplossing met een pH-meter uitgerust met een micro-pH-sonde (zie tabel van materialen).
  2. Pipetteer 10 μL van de pH-aangepaste SUV-oplossing in elk kanaal door de inlaat en druk de druk door de pipet tot de oplossing de uitlaat bereikt. Maak de tip van de pipet los en laat het op het apparaat vastzetten.
  3. Herhaal de bovenstaande stap voor elk kanaal en incubeer het apparaat gedurende 10 minuten bij RT.
    OPMERKING: Injectie van blaasjes in microkanalen moet onmiddellijk na de montage van het apparaat worden uitgevoerd.
  4. Snij sets van inlaat- en uitlaatbuizen, enzCh 60 cm (inlaatbuizen) en 8 cm (uitlaatbuizen) lang, respectievelijk.
    OPMERKING: Het snijden van de buis diagonaal en het creëren van een scherpe rand maakt het makkelijker om de buis in de ingangen en uitlaten te plaatsen. De uitlaatbuis moet een boogvorm hebben. De lengte van de inlaatbuizen kan variëren op basis van de microscoopopstelling. De inwendige diameter van de buis is 0,05 cm.
  5. Met behulp van een pincet sluit u de uitlaatpijp op het apparaat aan en tap het apparaat vervolgens op een microscoopfase.
  6. Submerge het ene uiteinde van de inlaatbuizen in 25 ml loopbuffer die in een conische buis zit, en plak het vast om ervoor te zorgen dat de buis is bevestigd.
  7. Plaats de conische buis op een hogere grond (~ 20 cm) dan het apparaat om de oplossing door de microkanalen door de zwaartekrachtstroom te duwen; Hiervoor kan een lab jack worden gebruikt.
  8. Voor elke inlaatbuis gebruik een spuit om 1 ml loopbuffer van het vrije uiteinde van de buis te trekken. Verwijder de pipetpunt uit de inlaat en plaats deVrij einde van de inlaatbuizen in het apparaat.
    OPMERKING: Introduceer een druppel loopbuffer op de inlaat om de kans te verminderen dat een luchtbubbel tijdens deze stap in het kanaal wordt geïntroduceerd. Nadat de inlaatbuis aan het apparaat is bevestigd, gebruik dan een lintvrije wipe om de overtollige buffer te verwijderen.
  9. Herhaal de bovenstaande stap om alle inlaatbuisstukken op het apparaat te verbinden.
    OPMERKING: Het stromen van de buffer door de kanalen helpt om overtollige blaasjes te verwijderen en de bilayer te compenseren naar de experimentele omstandigheden.
  10. Open de microscoopbesturingssoftware (zie tabel van materialen). Klik in het linker paneel op het tabblad 'Microscoop' en kies de '10X' doelstelling.
  11. Klik op 'Live' en dan 'Alexa 568' afbeelding iconen op de werkbalk. Met de fijne en cursus aanpassingsknoppen, focus op de microkanalen.
  12. Scan door het apparaat om de kwaliteit van de SLB's en de kanalen te controleren ( Figuur 8 ). Dan,Klik op het pictogram "FL Shutter Closed" op de werkbalk.
  13. Klik op het tabblad 'Acquisitie' en selecteer 'Belichtingstijd' onder 'Basisinstellingen'. Stel de belichtingstijd in op "200 ms".
  14. Klik in het linker paneel op "Multidimensionele overname" en selecteer onder het filtermenu het rode kanaal (gemarkeerd als "Alexa 568"). Klik dan op het menu 'time lapse', stel het tijdsinterval in op 5 minuten, duur tot 30 minuten en klik op 'Start'.
    OPMERKING: Op basis van de duur (30 min) en de stromingssnelheid (~ 1,0 μL / min) wordt 30 μL loopbuffer gebruikt om de SLB in een kanaal te compenseren, dwz 240 μL loopbuffer wordt gebruikt voor alle 8 kanalen.
  15. Selecteer het gereedschap 'Circle' onder het tabblad 'Maatregel' en teken een cirkel in elk kanaal. Klik met de rechtermuisknop terwijl de cirkel is geselecteerd en kies 'Eigenschappen'. Onder het tabblad 'Profiel', selecteer 'alle T' om de pagina te bekijkenFluorescentie-intensiteit als een functie van de tijd.
    1. Zorg ervoor dat deze curve een plateau bereikt, dat evenwicht aangeeft voordat u verder gaat naar de volgende stap.
  16. Verlaag de bufferoplossing op een gelijke grond als het apparaat om de stroom te stoppen.
  17. Sla het tijdverloopbestand op.

6. Testen PLC-δ1 PH domein interactie met PI (4,5) P2 bevattende SLBs

  1. Bereid verdunningen van het PH-domein op met behulp van de loopbuffer als verdunningsmiddel.
    OPMERKING: Aangezien er acht kanalen zijn in het apparaat, gebruik tenminste twee van hen voor lege controles. Kies de uiteinden aan elke kant en gebruik de overige kanalen voor eiwitverdunningen. De volgende PH-domeinconcentraties werden getest: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 en 2,50 μM. Ongeveer 200 μl van elke verdunning was voldoende om binnen 30 minuten evenwicht te bereiken.
  2. Eén tegelijk, ontkoppel elke uitlaatpijp en breng 200 μL van elke eiwitverdunning aanHet uitlaatkanaal met een pipet. Zet geen druk uit, laat de zwaartekracht het werk doen. Maak de tip van de pipet los en laat het aan het microfluïdische apparaat bevestigen.
  3. Herhaal de bovenstaande stap voor elk kanaal en zorg ervoor dat luchtbellen tijdens dit proces niet in de kanalen worden geïntroduceerd.
  4. Verlaag de inlaatbuis naar een bodem onder het microfluïdische apparaat om het eiwit door de microkanalen te stromen. Tape het vrije uiteinde van de buis aan een afvalbak. Flow de eiwitverdunningen gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: dit zal de stroom omdraaien en het eiwit in de kanalen laten introduceren. De tijd voor evenwicht en het benodigde volume van de eiwitverdunningen zal afhangen van de affiniteit van de interactie.
  5. Klik in het linker paneel van de software onder het tabblad 'Tijdsverloop' op 'Start' om opnieuw afbeeldingen te starten.
  6. Herhaal stap 5.15 om ervoor te zorgen dat evenwicht bereikt wordt. Wanneer het experiment is voltooid, sla de tijdsverloop ophet dossier.

7. Membraanvloeistof beoordelen

OPMERKING: Fluorescentie herstel Na Photobleaching (FRAP) moeten experimenten worden uitgevoerd met elke nieuwe partij SUV's en schoongemaakte glazen deklagen om ervoor te zorgen dat de SLB's vloeibaar zijn.

  1. Volg de procedure voor het reinigen van glazen deklagen (1.1-1.6), het vervaardigen van micropatterned PDMS-blokken (2.1-2.5), het voorbereiden van SUV's (3.1-3.8), het assembleren van het microfluïdische apparaat (4.1-4.5) en het vormen van SLB's (5.1-5.17) zoals eerder beschreven.
  2. Focus de microscoop op de bilayer, zet de belichtingstijd naar 200 ms en de binning tot 1.
  3. Foto-bleek een cirkelvormige vlek met een 532 nm, 2 mW laserstraal (13 μM radius). Onmiddellijk na fotolakken, begin elke 3 s voor de eerste 45 s elke 3 s afbeeldingen vast te leggen, gevolgd door een 30 s interval gedurende de rest van de tijd (15 min totale duur). Zodra de gegevensverzameling voltooid is, sla het tijdverloopbestand op.
  4. Selecteer de gebleekte aRea met behulp van het cirkel tekeninstrument om fluorescentie intensiteit waarden te verwijderen als een functie van de tijd. Daarnaast selecteert u nog twee gebieden in de buurt, één die overeenkomt met een ongebleekte regio en een die overeenkomt met een regio zonder SLB's.
  5. Bereken het fluorescentie herstel ( y ) met behulp van de volgende vergelijking:
    Vergelijking
    OPMERKING: Hier geeft F t de intensiteit van het gebleekte gebied als een functie van de tijd, F 1 staat voor de fluorescentie-intensiteit voor het bleken (gebruik 1 als een genormaliseerde waarde in dit geval); F 0 is de achtergrondintensiteit.
  6. Plot fluorescentie herstel (y-as) als een functie van de tijd (x-as) om een ​​FRAP-curve te genereren. Vervolgens past u de gegevens op een enkele exponentiële functie als volgt,
    Vergelijking
    OPMERKING: hier staat A voor de mobiele fractie en t 1/2 ):
    Vergelijking
  7. Gebruik de t 1/2 om de diffusieconstante ( D ) te berekenen:
    Vergelijking
    OPMERKING: hier staat R voor de straal van de laserstraal (13 μm). De diffusieconstante voor een vloeibare bilayer moet ≥1,0 ​​μm 2 / s zijn.

8. Verwerking van gegevens

OPMERKING: De routine van de data analyse zal afhankelijk zijn van de microscoop, beeldverwerkingssoftware en de curve-fit software die wordt gebruikt.

  1. Open de time-lapse-bestanden van eerder (vanaf stap 5.17) en daarna (vanaf stap 6.6) de PH-domein titreren. Ga naar het laatste frame van elk time-lapse bestand en doe een lijn scan over alle microkanalen om de fluoresc te verkrijgenEnce intensiteit data als functie van de afstand in pixels ( Figuur 6A ). Breng de gegevens over naar een spreadsheet software.
  2. Voor elke microkanaal (voor en na PH-domeintoevoeging), steek een aantal gegevens uit in het kanaal en aan beide zijden van het kanaal dat de basislijn vertegenwoordigt ( Figuur 7A ).
    OPMERKING: De fluorescentieintensiteit van het blanco kanaal moet ongewijzigd zijn gebleven. Alle andere kanalen worden genormaliseerd naar het lege kanaal, dus het is van cruciaal belang om twee lege kanalen te hebben en ervoor te zorgen dat hun fluorescentieintensiteiten consistent blijven met elkaar.
  3. Gebruik de onderstaande formule om de data te normaliseren naar het blanco kanaal; Een voorbeeldberekening is verschaft in figuur 7B .
    Vergelijking
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt ΔF- eiwit de achtergrond-getrokken fluorescentie-intensiteit van het eiwitkanaal, Δ; F- blanco vertegenwoordigt de achtergrond-getrokken fluorescentie-intensiteit van het blanco kanaal, voor en na verwijzen naar voor en na eiwittitratietrappen, en a vertegenwoordigt de correctiefactor, welke de verhouding is van de fluorescentie-intensiteiten van het eiwitkanaal en het blanco kanaal ([ F eiwit / F blanco ] pre ) bij een preproteïntitratiestap. Aangezien de fluorescentie-intensiteit afneemt als een functie van de PH-domeinconcentratie, zullen genormaliseerde gegevens negatief in waarde zijn.
  4. Bepaal de genormaliseerde fluorescentie als een functie van de PH-domeinconcentratie en pas bij een Langmuir-isotherm ( Figuur 6C ) met behulp van een curve-fit software (zie Material Table ).
    Vergelijking
    OPMERKING: Hier vertegenwoordigt ΔF de verandering in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de maximale verandering in fluoRescensintensiteit wanneer een verzadigingsconcentratie van eiwitten aanwezig is ( ΔF max ), terwijl de K d, app de schijnbare dissociatieconstante vertegenwoordigt, die gelijk is aan de bulkproteïne concentratie ( [PLC-δ1 PH] ) waarbij 50% dekking ( Membraan gebonden complex) wordt bereikt. Dit is een evenwichtsgebonden bindende meting, zodat de genormaliseerde gegevens geschikt zijn voor een eenvoudige Langmuir isotherm om een ​​schijnbare experimentele parameter K d, app te extraheren. Op basis van de fitting software de Kd, app voor PLC-δ1 PH-PI (4,5) P2 interactie 0,39 ± 0,05 pM (Figuur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikten de pH modulatie test om de PLC-δ1 PH domein PI-studie (4,5) P2 interactie in een PIP-on-a-chip micro-inrichting (figuur 1). Door middel van een gedetailleerd protocol hebben we aangetoond hoe u microfluidische apparaatcomponenten kunt voorbereiden en monteren, kleine unilamellaire vesicles (SUV's) maken ( Figuur 2 ), SLB's vormen binnen een apparaat ( Figuur 3 ) en getest eiwitbinding aan PIP-bevattende SLB's. Een stroomdiagram van een typisch SLB bindend experiment is afgebeeld in figuur 4 . Het principe van de pH modulatie test wordt getoond in figuur 5 met het PH-domein-PI (4,5) P2 binding als voorbeeld. De resultaten van deze studie suggereert dat het PH domein bindt aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs. Meer specifiek we waargenomen dat bij binding de lokale pH meer basisch werd. Deze Lokale pH-verandering werd gedetecteerd door de o SRB-POPE fluorescerende sonde aanwezig in SLB's, die vervolgens werd uitgeblust ( Figuur 6A , 6C ). Het quenchen was concentratieafhankelijk en verzadigbaar, waardoor de data aan een Langmuir isotherm werd aangebracht, leverde een Kd , app van 0,39 ± 0,05 μM ( Figuur 6B , 6D ). Het PH domein toonden selectiviteit naar PI (4,5) P2 omdat geen binding waargenomen aan POPC (zwitterionisch lipide) en zwakkere binding aan PI4P bevattende SLBs (Kd, app = 1,02 ± 0,20 pM) (Figuur 6B). Een voorbeeldberekening is opgenomen om aan te geven hoe fluorescentiedata worden verwerkt ( Figuur 7 ). In figuur 8 worden reeksen microkanaalbeelden gepresenteerd om visuele aanwijzingen te verschaffen bij het bepalen van de kwaliteit van SLB's en de microkanalen.

_content "voor: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 1
Figuur 1: Microfluïdische PIP-on-a-chip-inrichting voor het bestuderen van eiwit-PIP-interacties. ( A ) Het microfluïdische apparaat heeft 8 microkanalen met 8 inlaten en 8 uitgangen. Gekleurde oplossingen werden doorgestoken om de kanalen zichtbaar te maken in deze afbeelding. Het apparaat is 2,0 cm breed (x), 0,5 cm in hoogte (y) en 3,0 cm in lengte (z). ( B ) De vloer van de microkanalen is glas, terwijl de muren en plafonds bestaan ​​uit polydimethylsiloxaan (PDMS). Elke microkanaal is 100 μm in breedte, 40 μm in lengte en 1 cm in lengte. De afstand tussen twee aangrenzende microkanalen is 40 μm. Ondersteunde lipide bilayers (SLB's) worden bovenop het glasoppervlak gevormd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Kleine unilamellaire vesikel (SUV) voorbereiding en kwaliteitscontrole studies. ( A ) Lipide componenten gebruikt bij het maken van vesicles: ortho- sulforhodamine B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P), L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat PI (4,5) P2), en 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC). ( B ) Soorten lipide vesicles: SUV, grote unilamellaire vesikel (LUV), reus unilamellaire vesikel (GUV) en multilamellaire vesikel (MLV). SUV's zijn het beste geschikt voor de voorbereiding van SLB's 34 . ( C ) Dynamische lichtverstrooiing (DLS) gebaseerde bevestiging op de grootte van de vesicles post-lipide extrusie (via 0,1 μm filter). Hydrodynamische straal (Rh) van 53,9 nm bevestigt dat de m Ean van de grootte van de vesikelgrootte is ~ 100 nm. Resultaten vertegenwoordigen de meting van PI (4,5) P2 bevattende SUV. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: SLB-vorming op een glassteun. ( A ) Vesikels van gewenste lipidsamenstelling worden bereid en vervolgens door microkanalen stroomt. Vesicles worden geadsorbeerd op het glasoppervlak en vervormd. Zodra een kritische oppervlakte dekking is bereikt, blazen blaasjes spontaan om SLB's te vormen. Aangepast uit referenties 35 , 36 . ( B ) SLB's binnen een apparaat onder een 10X-doelstelling worden getoond. Alexa 568 filterset (excitatie / emissie bij 576/603 nm) wordt gebruikt.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Stroomschema van een typisch SLB bindend experiment. Microfluïdische apparaatcomponenten, dwz gepatenteerd PDMS-blok en gereinigde deklagen, worden behandeld met zuurstofplasma om beide oppervlakken hydrofiel te maken en vervolgens te monteren. SUV's worden gevlochten via microkanalen om SLB's te vormen. Overschotse blaasjes worden verwijderd en SLB's worden geëquilibreerd naar experimentele omstandigheden door stromende bufferoplossing te stromen. Vervolgens worden eiwitverdunningen door microkanalen gevlochten. Tenslotte worden de fluorescentie-intensiteitsgegevens geanalyseerd, genormaliseerd en afgebeeld als een functie van eiwitconcentratie. De genormaliseerde data is geschikt voor een functie om een ​​schijnbare dissociatieconstante ( K d, app ) va te extraherenlue. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Principes van de pH-modulatie gebaseerde sensatie. ( A ) röntgen kristal structuur van het PLC-δ1 PH domein in complex met PI (4,5) P 2 hoofdgroepinositol 1,4,5-trisfosfaat (Ins (1,4,5) P 3 ) ID: 1MAI) 37 . (B) De O SRB-POPE probe sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa van 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs waar aangegeven in de pH titratie curve. ( C ) Het PH-domein dat in deze studie werd gebruikt, heeft een isoelectrisch punt (pI) van 8,4, dus bij experimentele pH (7,0) is het eiwit positief geladen. Met een netto positief cHarge, het eiwit trekt OH - ionen. Wanneer het PH domein bindt aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, brengt de OH - ionen aan het membraanoppervlak, is het grensvlak gemoduleerde potentiaal die op zijn beurt verschuift de protonering stand o SRB-POPE en de fluorescentie Wordt geblokkeerd in de PH-domein concentratie-afhankelijke wijze. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6: PLC-δ1 PH-membraanbinding bewaakt via pH-modulatie. ( A ) De weergave van de microkanalen voor en na het toevoegen van het PH-domein bij aangegeven concentraties. (B) Vergelijking van de affiniteiten ten opzichte POPC, PI4P en PI (4,5) P2 bevattende SLBs. PH-domeinbinding tot 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs leverde een Kd, app van 0,39 ± 0,05 uM. Zwakker binding werd waargenomen tegen 7,5 mol% PI4P-bevattende SLB's ( Kd , app van 1,02 ± 0,20 μM) en er werd geen binding waargenomen voor pure POPC SLB's. Foutstaven geven SEM aan (n = 3). Two-tailed t-test werd gebruikt om de verwantschap tussen PI4P en PI (4,5) P2 binding vergelijking (* p = 0,0396). ( C ) Fluorescentieintensiteiten van de lijn scan over microkanalen worden afgebeeld als een functie van de afstand in pixels voor POPC, PI4P en PI (4,5) P 2 bindingsexperimenten. (D) De genormaliseerde en gemiddeld POPC, PI4P en PI (4,5) P2 binding data wordt uitgezet als functie van PLC-δ1 PH domein concentratie en breng vervolgens een Langmuir isotherm extraheren Kd, app. Zie de vergelijking in stap 8.4 voor details."Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 7
Figuur 7: Voorbeeldberekening voor gegevensverwerking. ( A ) Vóór (zwart) en na (rode) eiwittitratie lijn scan data voor leeg (geen eiwit) en eiwit kanaal, waar de fluorescentie intensiteit data wordt gepresenteerd als een functie van de afstand in pixels. Shaded gebieden vertegenwoordigen de regio's die gebruikt werden om gegevens uit te trekken voor de berekeningen. Basislijn fluorescentie-intensiteitsgegevens worden direct voor en na elk kanaal geëxtraheerd. ( B ) Gegevens worden geëxtraheerd voor blanco en eiwitkanalen, zowel vóór als na eiwittitratie. Gemiddelden worden genomen voor basislijn en binnen een kanaal fluorescentiedata. Na baseline-aftrekking wordt de fluorescentiedata genormaliseerd naar het blanco kanaal. Zie de vergelijking in stap 8.3 voor details. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8
Figuur 8: Het beoordelen van de integriteit van SLB's en microkanalen. ( A ) Een afbeelding die hoge kwaliteit SLB's en microkanalen illustreert. ( B ) Onvolledige fusie. ( C ) Gesmolten microkanalen. ( D ) Stof deeltje gevangen binnen een microkanaal. ( E ) Luchtbellen die binnen microkanalen worden gevangen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Pattern_Design.dwgLeeg "> Klik hier om het bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Elke PIP variant, zij het bij lage concentraties, is aanwezig op het cytosolische oppervlak van specifieke organellen, waar zij bijdragen aan de totstandbrenging van een unieke fysieke samenstelling en functionele specificiteit van het organellair membraan 1 . Een van de belangrijkste toepassingen van PIP's is als een specifiek docking platform voor de veelheid van eiwitten die specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie 6 , 7 vereisen. Door hun rol in cellulaire fysiologie en ziekte is het in staat om eiwit-PIP-interacties in vitro te bestuderen, in een fysiologisch relevante context belangrijk. Het hierin beschreven assayformaat maakt het mogelijk om eiwit-PIP-interacties in de context van een vloeibare lipide bilayer te overwegen, in aanwezigheid van een mengsel van fosfolipiden, met de normale presentatie van de polaire kopgroep en vet-acylketens van natuurlijke lengte.

Deze analyse, in combinatiOp met pH-modulatie als zijn detectiesysteem en SLB's als modelmembraansysteem in een microfluïdisch platform, biedt unieke voordelen in vergelijking met andere membraanbindende technieken. Allereerst bespaart het microfluidische platform op materialen vanwege de lage volume eisen zowel voor eiwitten als lipiden die gebruikt worden (40 nL totaal kanaalvolume, 1,0 mm 2 SLB oppervlak). Bovendien kunnen fysiologisch relevante lipidsamenstellingen worden gebruikt, terwijl de tweedimensionale membraan vloeibaarheid (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 nog steeds wordt behouden. Het detectiesysteem zorgt voor een verbeterde signaal-ruisverhouding in vergelijking met ITC, SPR en quartz crystal microbalance met dissipatie (QCM-D) monitoring, waarmee men niet alleen eiwitmembraaninteracties kan testen, maar ook ion, klein molecuul, peptidemembraaninteracties als Goed 19 , 20 , 39 , 40 . Ook de pH-gevoelige fluorescerende sonde is zeer stabiel en maakt geen fotoblaad onder de onderzochte experimentele omstandigheden 19 , 20 , 41 . Een ander voordeel van dit platform is het vermogen om de membraanoppervlakken visueel te waarnemen. Bepaalde interacties kunnen de vorming van lipidenmicrodomein induceren en / of membraanvloeistof beïnvloeden, die respectievelijk 42 kan worden getoond en / of getest via fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP). De hier beschreven beschrijving vereist geen dure instrumentatie buiten een fluorescentiemicroscoop. Tenslotte, en vooral, het beoordelen van membraaninteracties bij afwezigheid van ligand- / receptor-etikettering maakt de PIP-on-a-chip-analyse de voorkeursmethode boven de traditionele.

Hoewel de PIP-on-a-chip-analyse een krachtige techniek is, kunnen perifere membraanproteïnen verschillenEr in de totale samenstelling van kationische en anionische residuen en hun verdeling binnen / rond de bindingsplaats, die bepaalde uitdagingen veroorzaakt. Sommige eiwitten hebben PIP-bindingsplaatsen die bestaan ​​uit veel basisresiduen, terwijl anderen slechts een paar hebben. Daarom zal de H + / OH - verhouding op de bindingsplaats verschillen, en zo is de grootte van de verandering in de lokale pH bij binding. De stoichiometrie van de interactie en of de PIP-binding al dan niet wordt gestabiliseerd door interacties met andere lipiden, compliceert het geval nog meer. Dienovereenkomstig kan de pI van een eiwit, in het bijzonder voor een groot eiwit, niet de enige indicator zijn van de verwachte fluorescentieverandering. Hoewel sommige eiwit-PIP-interacties resulteren in grote fluorescentieveranderingen, kan de rest resulteren in kleine fluorescentieveranderingen. In het laatste geval kunnen ten minste twee acties worden genomen om de signaal-ruisverhouding te verbeteren: 1) het gebruik van grotere PIP-niveaus op de bilayer om het aantal eiwitten te verhogen rGeëxtrudeerd aan het oppervlak, dwz het verhogen van het aantal gewonnen OH - ionen en het aantal geblokkeerde o SRB-POPE moleculen; 2) het verhogen van de o SRB-POPE-niveaus om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.

Hoewel het huidige platform veel voordelen biedt voor het bestuderen van perifere membraanproteïnen, heeft het enkele uitdagingen voor de studie van transmembraaneiwitten. Door de SLB-glazen draagafstand (waterlaag is ongeveer 1-2 nm afhankelijk van de lipidsamenstelling) kan de interactie van de transmembrane eiwitglas ondersteunen eiwit-denaturatie, leiden tot functieverlies en immobilisatie 34 , 43 , 44 , 45 . Hoewel er meer betrokken zijn, zijn er een aantal aanpak ontwikkeld om deze uitdagingen te overwinnen, zoals oppervlakmodificatie van de glassteun om polymere kussens te verschaffen of lipopolyme te omvatten(Bijvoorbeeld PEGylated lipiden) in de bilayer om de SLB-glassteunafstand 34 , 46 , 47 , 48 te verhogen.

Het vormen van hoogwaardige SLB's is het meest kritische aspect van de PIP-on-a-chip-analyse ( Figuur 8A ). Het gebruik van schone deklagen en verse SUV's wordt aanbevolen om reproduceerbaarheid te verzekeren. Door de aanwezigheid van anionogene lipiden, zoals PI (4,5) P2, zijn SUV negatief geladen, waarbij de SUV verbreken efficiëntie vermindert en laat de membramen (Figuur 8B). Daarom is de pH-aanpassing van de SUV-oplossing van cruciaal belang om de PI (4,5) P 2 -hoofdgroepfosfaten te protoneren en de elektrostatische afstoting met het glas te verminderen om de rupturefficiëntie 49 , 50 te verhogen. SUV's die geen anionisch bevattenIpids, vereisen geen pH-aanpassing. Daarnaast moeten SUV's onmiddellijk na de zuurstofplasmabehandeling en -binding in kanalen worden geïnjecteerd, terwijl het glasoppervlak nog hydrofiel is, wat nodig is voor SLB-vorming. Naast de SLB-kwaliteit vertegenwoordigen stofdeeltjes een ander probleem. Tijdens het fabricageproces kan een stofdeeltje tussen de kanalen kanaalfusie veroorzaken, terwijl een stofdeeltje dat in een kanaal wordt gevangen, de SLB kan beschadigen en / of de stromingssnelheid van de oplossing kunnen verminderen ( Figuur 8C, 8D ). Het werkgebied moet periodiek worden gereinigd om stof te verwijderen. Op soortgelijke wijze moet de blootstelling van een luchtbubbel in een kanaal worden vermeden bij elke stap, waardoor de SLB onomkeerbaar zal worden beschadigd ( Figuur 8E ).

Een andere parameter die moet overwegen bij het plannen van een PIP-on-a-chip-analyse is de eiwitopslagbuffer. Indien gebruikt bij hoge concentraties, worden individuele componenten (Stabiliserende middelen, reductiemiddelen, zouten, antimicrobiële middelen, chelaterende reagentia, enz. ) Kunnen de fluorescentie en / of SLB-integriteit beïnvloeden. Daarom moet de opslagbuffer getitreerd worden om het effect ervan te testen. Als een effect wordt waargenomen, moeten de SLB's ook worden geëquilibreerd aan de opslagbufferomstandigheden alvorens het eiwit te titreren om een ​​drijf in fluorescentie te voorkomen. Aangezien dit een pH-modulatie gebaseerde assay is, moet het gezuiverde eiwit, indien mogelijk, ook dezelfde bufferingskomponent bevatten als de loopbuffer (in dit geval 20 mM HEPES bij pH 7,0) om de drif in fluorescentie te beperken die wordt veroorzaakt door de buffer mismatch.

Ten slotte hebben wij aangetoond dat de pH-modulatie-analyse succesvol kan worden gebruikt om eiwit-PIP-interacties te onderzoeken. Hoewel de nadruk lag op PIP's, kan dit platform worden gebruikt om interacties met meer complexe membraamsystemen te testen die andere fysiologisch relevante lipiden omvatten, zoals fosfatidylseriNe, fosfatidylethanolamine, fosfatidzuur en cholesterol, onder andere 28 , 39 , 42 , 51 . Naast cellulaire eiwitten, kan dit testplatform ook voordelig zijn voor mensen die menselijke pathogenen bestuderen. Bijvoorbeeld, eiwitten die zijn gecodeerd door virussen en bacteriën, hebben aangetoond dat ze interactie hebben met cellulaire membranen en sommige specifiek met PIP's 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Dienovereenkomstig kan PIP-on-a-chip-analyse een middel verschaffen voor het ontdekken en karakteriseren van kleine-molecuul-remmers van eiwit-PIP-interacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

DS en CEC werden gedeeltelijk ondersteund door subsidie ​​AI053531 (NIAID, NIH); SS en PSC werden ondersteund door subsidie ​​N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics