输卵管的管状细胞学作为卵巢癌早期检测的有前景的工具

Medicine

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Summary

我们探索了输卵管细胞学方法,采用输卵管直接手术切除术作为卵巢癌早期检测的工具。在这里,我们提出一个收集新鲜手术标本的输卵管细胞的方案。

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Chen, H., Klein, R., Arnold, S., Wang, Y., Chambers, S., Zheng, W. Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection. J. Vis. Exp. (125), e55887, doi:10.3791/55887 (2017).

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Abstract

目前,广泛接受的是绝大多数卵巢高级浆液性癌(HGSC)来源于输卵管。然而,由于缺乏用于卵巢癌鉴定的标记物或工具,HGSC的早期检测仍然具有挑战性。当肿瘤不可见时,输卵管的直接取样可增强检测肿瘤细胞的敏感性。我们开发了一种从新鲜手术标本直接收集输卵管细胞的方法,与组织学检查结果具有良好的相关性。这种方法为高风险患者群体中微创腹腔镜筛查的未来应用奠定了基础。

Introduction

卵巢高级浆液性癌(HGSC)是最常见和致命的卵巢癌,仍然是对公众健康的主要威胁。在过去十年中,研究人员已经表明,绝大多数的HGSC情况下从该输卵管而不是卵巢本身1,2,3,4,5,6出现。浆液性输卵管上皮内癌(STIC)作为HGSC 1,7,8,9,10,11的前体已被广泛接受。到目前为止,卵巢癌的早期发现仍然很困难。目前的筛选方案与联合癌抗原125(CA-125)和经阴道超声显示对病人的死亡率12,13几乎没有影响。卵巢癌检测的子宫内膜取样显示极低的灵敏度14 。两个先驱研究15,16探索良性输卵管腹腔镜直接采样的使用,并且其特征在于良性输卵管上皮的细胞学特征。我们认为,输卵管的直接取样也可以成为在肿瘤未被成像可视化的早期阶段检测STIC或HGSC的实用且直接的方法。

尽管最终目标是在高风险因素患者中进行微创腹腔镜筛查的实用性,但目前研究的直接目标是:1)建立良性输卵管上皮细胞基线细胞学特征;和2)检测输卵管细胞学检测卵巢癌的敏感性和特异性和癌症前体。因此,我们开发了以下基线输卵管细胞学方法来检测该方案检测HGSC及其前体STIC 17的有效性。在这项研究中,我们利用了大量定期接受的手术标本,除了常规手术程序之外,还对手术切除的输卵管进行了直接取样。

我们最近的研究17显示,恶性肿瘤的恶性或怀疑的细胞学诊断与HGSC的组织学诊断(100%)高度相关。此外,输卵管细胞学评估确定了在本研究中涉及的仅有两个组织学证实的STIC病例的颅内瘤变。我们认为输卵管细胞学在早期检测中具有很大的潜力,将为患者管理提供有价值的信息。

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Protocol

亚利桑那大学获得了机构审查委员会的批准,用于进行这项研究。获得知情的患者同意书。

患者选择

注意:获得了亚利桑那大学的机构审查委员会的批准。共招收38名患者。患者年龄32〜86岁,平均55岁,其中绝经后26例,绝经前12例。

  1. 获得每名患者的知情同意书。

输卵管细胞收集程序

注意:本研究中包括的患者均预计全子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术用于预防性降低风险或恶性肿瘤。进行细胞学研究的病理学家的手术细节是未知的。

  1. 手术后立即切除切口,仔细检查包括子宫,双侧卵巢和双侧输卵管在内的新鲜组织标本,以鉴别双侧输卵管。
  2. 在夹紧血液供应30分钟内收集输卵管细胞进入防腐液(参见表材料)小瓶;推荐的防腐剂是一种基于甲醇的缓冲防腐剂溶液。
    注意:使用温和的触摸刷进行输卵管细胞收集(即将到来的步骤)。除了输卵管从子宫分离出来的罕见病例外,当输卵管连接到子宫时,通常插入刷头以从输卵管fimbria收集细胞。
    1. 在小镊子的帮助下,将刷子(参见表格材料 )插入通过菌毛末端的输卵管内腔。慢慢地顺时针旋转,并将刷子向前移动穿过坠落的凹陷部分opian管,然后是壶腹直到达到峡部。
    2. 慢慢地逆时针旋转和反转刷子以拉出刷子。确保内腔内刷子的最大速度慢于1厘米/秒。
    3. 通过在溶液中旋转和旋转刷子10次,在防腐溶液(在小瓶中)冲洗刷子。
    4. 拧紧小瓶盖。
    5. 记录患者的信息和样本的变性。
    6. 将小瓶存放在4°C冰箱(最多6个月)内。

3.管状细胞学幻灯片准备

  1. 将样品瓶装入自动化处理器进行幻灯片准备。
    注意:我们使用自动处理器进行幻灯片准备。将样品瓶放入处理器后,自动执行以下步骤:(i)细胞和碎屑通过样品中测试过滤器的旋转分离和分散小瓶。 (ii)通过温和的真空从过滤器的外表面收集管状细胞。 (iii)将过滤器倒置并压靠在载玻片上,使细胞粘附在载玻片内的圆形区域上。 (iv)将载玻片进一步固定在细胞固定浴中并准备进行染色和细胞学分析。不幸的是,没有其他手动方法,可以产生类似质量的结果。

4.修改的Papanicolaou染色方案

  1. 如图1所示,通过运行自动化非gyn染色程序来染色由步骤3.1制成的载玻片。
    注意:染色方法代表我们常规用于非妇科标本的Papanicolaou染色技术的修改。我们使用自动组织处理器染色一些幻灯片。我们在本研究中选择了Gyn染色程序的非Gyn染色方法。使用的曙红是EA-65,而不是EA-50妇科标本(Pap涂片标本)。此外,主要用于鳞状细胞染色的Gyn染色程序中的OG-6不包括在染色程序中,因为在本研究中预期不会看到鳞状细胞。 EA65(Eosin Azure)是由3种染料组成的抗污染溶液:曙红Y,快绿FCF和俾斯麦棕Y。程序如表1所示
  2. 执行手动快速巴氏染色程序如下。
    1. 将步骤3.1中制成的载玻片浸入95%乙醇中,10次,每次浸渍约1秒。
    2. 将载玻片浸入H 2 O中10次,每次浸渍约1秒。
    3. 在苏木精中出现10-60秒的幻灯片。
    4. 将载玻片浸入H 2 O中10次,每次浸渍约1秒。
    5. 将载玻片浸入95%乙醇中,10次,每次浸渍约1秒。
    6. 在EA65出现幻灯片1 - 3分钟。
    7. 蘸滑块into H 2 O,10次,每次浸渍约1秒。
    8. 将载玻片浸入95%乙醇中,10次,每次浸渍约1秒。
    9. 将载玻片浸在二甲苯中直到载玻片变得清亮。
      注意:这是一个修改的Papanicolaou染色程序。对于有限时间或空间的情况,如现场细针抽吸和STAT标本,该方法用作更快速的染色方法。该程序提供与自动化非Gyn染色程序相当的质量染色。程序如表2所示

旋转细胞到幻灯片上

注意:为每个样品制作三个细胞分裂素幻灯片。一个幻灯片是H&E染色与细胞学幻灯片的形态比较。为未来的IHC染色研究制备了两个未染色的载玻片。本节的详细步骤不是本文的重点;因此,我们不会在扩展d中讨论它们etails。

  1. 准备一个细胞离心机与标记的幻灯片,标本漏斗和过滤器每个样品待检查。
  2. 通过以200×g离心5分钟浓缩细胞。
  3. 取出约一半的上清液,然后轻轻移液重新悬浮细胞。
  4. 将每个细胞悬液200μL加入到标本漏斗中。
  5. 旋转250 xg 5分钟。小心地从细胞离心机中取出载玻片并将其转移到95%乙醇中固定。
  6. 空气干燥后染色和长期储存。
    注意:根据最终幻灯片上的细胞密度,可以跳过或调整步骤5.2和步骤5.3。在这项研究中,我们需要每个高功率视图中存在至少2个细胞簇以获得足够的细胞密度。

6.分段和广泛审查有条理的结束(SEE-FIM)协议

  1. 修复整个标本(包括子宫,双侧输卵管和卵巢)在10%的福尔马林之前,通过减少剥落。
  2. 使用小镊子和剪刀,轻轻小心地将输卵管从峡部的子宫分离。如果存在粘连,请使用小镊子和剪刀从卵巢表面小心地切开融化的末端;这些步骤对于尽量减少卵巢和输卵管之间的肿瘤交叉污染至关重要。
  3. 从其余的标本截断漏斗和菌毛段(输卵管远端1.0 - 2.0 cm)。
  4. 以2mm间隔纵向剖开漏斗和菌毛。提交toto的所有部分进行组织学检查。
  5. 以2 - 3 mm的间隔切开峡部和壶腹,完全提交。

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Representative Results

我们以前的研究表明,使用温和的触摸刷直接从切除的输卵管取样可以产生定量和定性的足够的标本用于进一步细胞学评估。此外,自动幻灯片制备和修改的Papanicolaou染色的组合使得病理学家能够更好地可视化细胞学细节以做出准确的诊断。 图1中示出了来自良性输卵管的样品的手动快速pap染色的实例。 如图1所示,刷子操纵导致样品的充分取样。此外,手动快速巴氏染色提供良好的核细节分辨率和细胞质透明度,这对于准确评估输卵管细胞是至关重要的。

手动快速Pap st细胞学幻灯片的染色和染色体幻灯片的H&E染色如图2所示。与常规涂片相比,上述幻灯片制备的优点之一是具有更清洁的背景和更好的核细节分辨率和细胞质透明度。 图3显示了输卵管协议的SEE-FIM的一个例子。 如图1所示,两个细胞群(纤毛细胞和分泌细胞)的存在是良性输卵管上皮的特征。弗林布和壶腹的代表性部分的组织学示于图4 。大约三分之一的标本刷毛动作显示轻微的绒毛结构紊乱。

在我们以前的研究17中 ,输卵管细胞学诊断与组织学直径相关HGSC的健康状况非常好(100%)。恶性肿瘤的细胞学外观显示由具有突出核仁和异核细胞增多症的细胞组成的三维簇( 图5a )。相比之下,非典型反应性细胞学呈现为由非小细胞核细胞和中度无核细胞增多症的非典型细胞组成的成角片,无三维聚类( 图5b )。在正常上皮细胞的角度片段的上下文中注意到HGSC样细胞群( 图6 )。

图1
图1:手术快速巴氏染色良性管状上皮的实例。A )背景细胞。背景细胞包括由大分泌细胞和小纤毛细胞组成的小细胞簇,单个大(假定秒,retiny细胞)和小(大概是纤毛细胞)细胞,分散的大和小的裸核。 ( B )由小纤毛细胞和大分泌细胞组成的小细胞簇(箭头)。 ( C )纤毛上皮条(箭头)。 ( D )具有间皮样片的管状上皮。注意周边附着的纤毛细胞(箭头)。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2
图2:细胞镜幻灯片( A )的手动快速巴氏染色和细胞镜片载玻片( B )的H&E染色之间的比较。在Pap染色和H&E染色载玻片的中心存在良性角膜细胞簇。两种方法都提供良好的标本细胞学评估的分辨率。然而,细胞学贴片的巴氏染色得到更清洁的背景。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3
图3:输卵管的SEE-FIM插图。请注意漏斗和菌毛段的纵断面和峡部和壶腹的横截面。 请点击此处查看此图的较大版本。

图4
图4:良性管状上皮组织学。A )菌毛片段。输卵管上皮由两个不同的细胞群组成:小纤毛细胞(箭头)和大的非纤毛分泌细胞(圆)。注意到轻微的别墅干扰。 ( B )Ampulla部分。注意手指状的fimbria。 ( C )绒毛结构轻度干扰(箭头)。 请点击此处查看此图的较大版本。

图5
图5:非典型簇( a )和三维恶性簇( b )之间的比较恶性细胞学显示由具有突出的核仁和异核细胞增多症的细胞组成的三维簇( b )。非典型细胞学检查显示有角度的片状s由具有小核仁和中度无核细胞增多症的非典型细胞组成。注意:不存在三维聚类( a )。这个数字已从参考文献17中得到采用。

图6
图6:上皮内瘤形成的细胞学和组织学表现之间的相关性。a )细胞学肿瘤内瘤变。在正常上皮细胞(箭头)的角度片段的背景下,显示获得三维轮廓和显着的无核细胞增多症和大樱桃红核仁(圆形)的细胞学颅内瘤变。 ( b )与输卵管上皮内癌相应的手术病理部位。注意与相对正常的外观上皮细胞相邻的高度发育不良的细胞(圆)(箭头)。这个数字一直是摘自参考文献17请点击此处查看此图的较大版本。

</ TABLE>

表1:非Gyn染色步骤。

95%乙醇 5分钟
H2O 10秒
苏木 15秒 - 3分钟
蒸馏水 5分钟
95%乙醇 30秒
EA65 2 - 5分钟
95%乙醇 30秒
95%乙醇 30秒
100%乙醇 30秒
100%乙醇 30秒
二甲苯 30秒
二甲苯 5分钟
95%乙醇 10滴
H2O 10滴
苏木 10秒-1分钟
蒸馏水 10滴
95%乙醇 10滴
EA65 1 - 3分钟
95%乙醇 10滴
100%乙醇 10滴
二甲苯浸泡直到清澈

表2:手动快速巴氏染色步骤。

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Discussion

已经显示预防性双侧输卵管切除术或输卵管卵巢切除术可降低高危人群发生HGSC的风险,如BRCA基因突变妇女和家族性癌症史。然而,由手术导致的不育和外科绝经是严重后果,造成困难的决定,特别是对于育龄妇女。以前的研究显示输卵管细胞学和组织学之间有很好的相关性17 。我们认为腹腔镜收集的输卵管细胞的输卵管细胞学具有很大的潜力成为早期癌症检测的实用的,微创的工具。

成功收集输卵管细胞的最关键步骤是:1)钳制血液供应和收集细胞之间的时间;和2)温柔和正确的机动的温柔触摸刷。

时间(30分钟内es)夹紧和收集细胞对于良好保存收集细胞的形态和核细节至关重要。病理学家和外科医生之间的有效沟通可确保在此期间将样本送至收集点。研究中绝大多数病例均在冷冻室进行。为了成功收集输卵管细胞,执行收集的人应该尽可能地尽可能地避免如果病例是恶性的,则由于分期的影响,使刷子触及卵巢浆膜表面。有时,由于所涉及的两个器官的接近以及样本解剖结构的复杂性,这可能是困难的。在收集前将输卵管与整个标本分离可能是有必要的。

本研究中使用的柔和触摸刷可以收集大量细胞,然后可以很容易地将其转移到载玻片或防腐溶液瓶中,并具有旨在减少对运河创伤的轻柔触感。此外,整个操作需要缓慢而温和,以避免严重扰乱输卵管粘膜的绒毛结构。在某些情况下,由于阻塞可能难以让刷子通过整个输卵管。然而,尽可能地尽可能地从菌毛和漏斗部分收集细胞是重要的,因为认为大部分HGSC来源于输卵管的远端。但是,如果样品的完整性可能会受到影响,则不应进行收集。

根据我们的经验,样品可以在防腐液中储存几个月,而不会影响收集的细胞的形态。 Papanicolaou染色是细胞病理学中常用的细胞学染色技术。该染色程序的主要优点包括:1)核细节定义良好;和2)细胞质透明度。在本研究中,两种修饰的Papanicolaou染色程序用于细胞学载玻片染色,包括自动化非Gyn染色程序和Quick Pap染色程序。两种方法都能提供优异可靠的载玻片染色,显示良好的核细胞和细胞质细节的保存和清洁背景。尽管与细胞学载玻片相比,细胞分裂素幻灯片通常具有更大的背景,但它们的H&E染色显示出相似的细胞染色质量。如果自动处理器不可用,这些载玻片的H&E染色可以是输卵管细胞学分析的合适的替代方法。

SEE-FIM方案用于本研究中包括的所有输卵管,包括良性和恶性病例。 SEE-FIM方案最初是针对BRCA阳性预防性双侧输卵管卵巢切除术标本开发的,这是标准的降低风险的选项f或BRCA突变携带者。该协议允许STIC被认为来源于其的最大的输卵管暴露。目前这是检测HGSC输卵管扩张和STIC的黄金标准。输卵管细胞学发现与SEE-FIM组织学发现之间的相关性对于本研究验证当前方案的效率至关重要。

使用温和触摸刷的输卵管细胞收集的一个问题是,如果识别出恶性肿瘤,则手术可能会扰乱输卵管上皮的完整性,并阻碍手术标本的后期准确的组织学解释,特别是肿瘤的分期。然而,根据我们的经验,约三分之一的病例在组织学分析中显示轻微的绒毛紊乱,这通常不会干扰输卵管组织学的最终解释。

我们以前的研究表明,输卵管细胞学是敏感和特异性的检测HGSC和STIC。进一步测试输卵管细胞学与生物标志物染色如P53和IMP3的组合是否可能增加检测输卵管起源的浆液性癌症的灵敏度和特异性将是非常有意义的。未来的研究将侧重于开发用于体内输卵管上皮样本的腹腔镜手术。

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Disclosures

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者要感谢亚利桑那大学病理学系的财政支持。该项目得到了WZ的Mark和Jane Gibson捐赠基金的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit CooperSurgical C0112
ThinPrep preservCyt solution HOLOGIC 234005
ThinPrep 2000 Processor HOLOGIC 70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65 sigma aldrich HT40432
95% Ethanol sigma aldrich 652261
100% Ethanol sigma aldrich 493538
Xylene sigma aldrich 214736
Hematoxylin sigma aldrich H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor SAKURA TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight Pilgrim medical equiment FA710-45
Chemware Forceps United state plastic corp 76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short SAKURA 4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short SAKURA 4786

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References

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