La citología tubárica del tubo de Falopio como herramienta prometedora para la detección temprana del cáncer de ovario

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Summary

Exploramos un método citológico de trompas mediante el muestreo de la trompa de Falopio directamente escisión post-quirúrgica como una herramienta de detección temprana de cáncer de ovario. Aquí, presentamos un protocolo para recoger las células de trompas de Falopio recién recibidos muestras quirúrgicas.

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Chen, H., Klein, R., Arnold, S., Wang, Y., Chambers, S., Zheng, W. Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection. J. Vis. Exp. (125), e55887, doi:10.3791/55887 (2017).

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Abstract

Actualmente, es ampliamente aceptado que la gran mayoría de carcinoma seroso de alto grado ovárico (HGSC) se originan de la trompa de Falopio. Sin embargo, debido a la falta de marcadores o herramientas para la identificación del cáncer de ovario, la detección temprana de HGSC sigue siendo un desafío. El muestreo directo de la trompa de Falopio puede aumentar la sensibilidad para la detección de células neoplásicas cuando el tumor no es claramente visible. Se desarrolló un procedimiento para recoger las células de trompas de Falopio directamente de muestras quirúrgicas recién recibidas, lo que ha demostrado una excelente correlación con los hallazgos histológicos. Este enfoque establece una base para la futura utilidad de la exploración laparoscópica mínimamente invasiva en poblaciones de pacientes de alto riesgo.

Introduction

El carcinoma seroso de alto grado ovárico (HGSC) es el tipo más común y letal de cáncer de ovario, y sigue siendo una amenaza importante para la salud pública. En la última década, los investigadores han sugerido que la gran mayoría de los casos de HGSC surgen de la trompa de falopio en lugar del ovario en sí 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . El carcinoma intraepitelial de trompas serosas (STIC) es ampliamente aceptado como el precursor de HGSC 1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Hasta el momento, la detección temprana del cáncer de ovario sigue siendo difícil. El actual protocolo de selección con antígeno de cáncer combinado 125 (CA-125) y ultrasonido transvaginal ha mostradoPoco efecto sobre la mortalidad de los pacientes 12 , 13 . Endometrial muestreo para la detección de cáncer de ovario ha demostrado una sensibilidad extremadamente baja [ 14] . Dos estudios pioneros 15 , 16 exploraron el uso del muestreo directo laparoscópico de trompas de Falopio benignas y caracterizaron las características citológicas del epitelio tubárico benigno. Creemos que el muestreo directo de la trompa de Falopio también puede ser una forma práctica y sencilla de detectar STIC o HGSC en una etapa temprana cuando el tumor no se visualiza mediante imágenes.

Aunque el objetivo final es la utilidad de la exploración laparoscópica mínimamente invasiva en pacientes con factores de alto riesgo, los objetivos inmediatos del presente estudio son: 1) establecer las características citológicas de referencia del epitelio tubárico benigno; Y 2) probar la sensibilidad y especificidad de la citología tubaria en la detección de cáncer de ovarioLos precursores del cáncer. Por lo tanto, desarrolló el siguiente línea base de citología tubaria método para probar la eficacia de este protocolo en la detección de HGSC y su precursor STIC [ 17] . En este estudio, aprovechamos el gran volumen de muestras quirúrgicas recibidas regularmente, y realizamos muestreo directo de la trompa de Falopio extirpada quirúrgicamente, además de los procedimientos de recaudación sistemática.

Nuestro estudio reciente 17 mostró que el diagnóstico citológico de malignidad o sospecha de malignidad está altamente correlacionado con el diagnóstico histológico de HGSC (100%). Además, la evaluación citológica tubárica identificó la neoplasia intratubal en los dos únicos histológicamente confirmados STIC casos involucrados en este estudio. Creemos que la citología tubárica tiene un gran potencial en la detección temprana y proporcionará información valiosa para el manejo del paciente.

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Protocol

La Universidad de Arizona recibió una aprobación de la Junta de Revisión Institucional por conducir este estudio. Se obtuvieron formularios de consentimiento informados del paciente.

1. Selección del Paciente

NOTA: Se obtuvo una aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Arizona. Se reclutó un total de 38 pacientes. La edad de los pacientes osciló entre los 32 y los 86 años, con una media de 55 años, de los cuales 26 fueron post-menopáusicas y 12 fueron pre-menopáusicas.

  1. Obtenga el consentimiento informado de cada paciente.

2. Procedimiento de recolección de células de trompas de Falopio

NOTA: Los pacientes incluidos en el presente estudio fueron todos programados para histerectomía total y salpingo-ooforectomía bilateral para la reducción del riesgo profiláctico o malignidad. Los detalles de la cirugía eran desconocidos para el patólogo que realizó el estudio de citología.

  1. Inmediatamente después del surgiExaminar la muestra de tejido fresco incluyendo el útero, los ovarios bilaterales y las trompas de falopio bilaterales cuidadosamente para identificar la trompa de falopio bilateral.
  2. Recoja y coloque las células de las trompas de Falopio en el vial de la solución conservadora (ver Tabla de Materiales) dentro de los 30 minutos de sujeción del suministro de sangre; El conservante recomendado es una solución de conservante tamponada a base de metanol.
    NOTA: Utilice un cepillo suave para la colección de células tubáricas (próximos pasos). Con la excepción de casos raros en los que se somete a la trompa de Falopio desprendida del útero, la inserción de una cabeza de cepillo para recoger las células de la fímbria tubárica ocurre típicamente cuando la trompa de Falopio está unida al útero.
    1. Con la ayuda de una pinza pequeña, inserte el cepillo (ver Tabla de Materiales ) en el lumen de la trompa de falopio a través de la extremidad de las fimbrias. Gire lentamente en el sentido de las agujas del reloj y mueva el cepillo hacia adelante a través de la parte infundibular de la caídaOpio, luego la ampolla hasta llegar al istmo.
    2. Gire lentamente e invierta el cepillo en el sentido contrario a las agujas del reloj para sacar el cepillo. Asegúrese de que la velocidad máxima del cepillo dentro de la luz es más lenta que 1 cm / s.
    3. Enjuague el cepillo en la solución conservante (en un vial) girando y girando el cepillo 10 veces en la solución.
    4. Apriete la tapa del vial.
    5. Registre la información del paciente y la lateralidad de la muestra.
    6. Guarde el vial en un refrigerador de 4 ° C (hasta 6 meses).

3. Preparación de diapositivas de citología tubárica

  1. Cargue el vial de muestra en el procesador automatizado para la preparación de diapositivas.
    NOTA: Utilizamos el procesador automatizado para la preparación de diapositivas. Los pasos siguientes se realizan automáticamente después de que el vial de muestra se coloca en el procesador: (i) Las células y los desechos se separan y dispersan a través de la rotación del filtro de prueba dentro de la muestrafrasco. (Ii) Las células tubáricas se recogen de la superficie exterior del filtro mediante un suave vacío. (Iii) El filtro se invierte y se presiona contra la corredera para permitir que las células se adhieran al área circular dentro de la corredera. (Iv) La corredera se fija adicionalmente en un baño fijador de células y está lista para el análisis de tinción y citología. Desafortunadamente, no hay un método manual alternativo, que puede producir resultados con una calidad similar.

4. Protocolo de tinción de Papanicolaou modificado

  1. Mancha las diapositivas realizadas desde el paso 3.1 ejecutando el procedimiento automatizado de tinción no gyn, como se ilustra en la Tabla 1 .
    NOTA: El método de tinción representa una modificación de la técnica de tinción de Papanicolaou que usamos habitualmente para especímenes no ginecológicos. Utilizamos un procesador de tejido automatizado para manchar algunas diapositivas. Elegimos el procedimiento de tinción no Gyn sobre el procedimiento de tinción Gyn en este estudio. La Eosina utilizada es EA-65, en lugar de la EA-50 utilizada paraEspecímenes ginecológicos (espécimen de Papanicolau). Además, OG-6 en el procedimiento de tinción Gyn, que es principalmente para la tinción de células escamosas, no se incluye en el procedimiento de tinción ya que no se espera que las células escamosas se ve en este estudio. EA65 (Eosin Azure) es una solución de tinción de contador compuesta de 3 colorantes: Eosina Y, FCF verde rápido y Bismarck marrón Y. El procedimiento se ilustra en la Tabla 1 .
  2. Realice un procedimiento manual de tinción rápida de Pap como sigue.
    1. Sumerja la lámina hecha en el paso 3.1 en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    2. Sumerja la lámina en H 2 O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    3. Emerge la diapositiva en hematoxilina durante 10 - 60 s.
    4. Sumerja la lámina en H 2 O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    5. Sumerja la diapositiva en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    6. Emerge la diapositiva en EA65 durante 1 - 3 min.
    7. Sumerja la diapositiva intO H $ $ O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    8. Sumerja la diapositiva en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
    9. Sumerja la diapositiva en xileno hasta que la diapositiva se aclare.
      NOTA: Este es un procedimiento de tinción de Papanicolaou modificado. Este método se utiliza como un método de tinción más rápido para casos con tiempo o espacio limitado como aspiración en la aguja fina y muestras STAT. Este procedimiento proporciona tinción de calidad comparable como el procedimiento automatizado de tinción no Gyn. El procedimiento se ilustra en la Tabla 2 .

5. Girar las células sobre las diapositivas

NOTA: Se hacen tres diapositivas de citospin para cada espécimen. Una diapositiva es H & E manchado para la comparación morfológica con la diapositiva citología. Se realizaron dos diapositivas no corregidas para el futuro estudio de tinción con IHC. Los pasos detallados de esta sección no son el foco de este documento; Por lo tanto, no vamos a discutir en extenso dCollares

  1. Preparar una citocentrífuga con una diapositiva marcada, un embudo de muestra y un filtro para cada muestra a examinar.
  2. Se concentran las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g.
  3. Retirar aproximadamente la mitad del sobrenadante y luego volver a suspender las células por pipeteado suave.
  4. Añadir 200 μl de cada suspensión de células a un embudo de muestra.
  5. Girar a 250 xg durante 5 min. Retire con cuidado la (s) lámina (s) de la citocentrífuga y transfiéralas a Etanol al 95% para su fijación.
  6. Seque al aire antes de la tinción y para el almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Dependiendo de la densidad celular en las diapositivas finales, el paso 5.2 y el paso 5.3 se pueden omitir o ajustar. En este estudio, se requieren por lo menos 2 grupos de células presentes por alta potencia vista para una densidad celular adecuada.

6. Seccionando y Examinando Extensivamente el Protocolo de Extremo Fimbriado (SEE-FIM)

  1. Fijar todo el espécimen (incluyendo el útero, las trompas de Falopio y los ovarios)En formalina al 10% antes de la recaudación bruta para minimizar la exfoliación.
  2. Suavemente y cuidadosamente separar las trompas de Falopio del útero en el istmo con una pinza pequeña y una tijeras. Si hay adhesión, disecar cuidadosamente el extremo finiforme de la superficie del ovario con una pinza pequeña y unas tijeras; Estos pasos son cruciales para minimizar la contaminación cruzada tumoral entre el ovario y la trompa de Falopio debido a su proximidad íntima.
  3. Amputa el infundíbulo y el segmento de las fimbrias (distal 1.0 - 2.0 cm de la trompa de Falopio) del resto de la muestra.
  4. Corte el infundíbulo y las fimbrias longitudinalmente a intervalos de 2 mm. Envíe todas las secciones en toto para el examen histológico.
  5. Corte el istmo y la ampolla a intervalos de 2 - 3 mm y someta completamente.

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Representative Results

Nuestro estudio previo demostró que el muestreo directo de la trompa de Falopio extirpada utilizando un cepillo táctil suave podría producir una muestra cuantitativa y cualitativamente adecuada para una evaluación citológica posterior. Además, la combinación de preparación de diapositivas automatizada y tinción de Papanicolaou modificada permiten al patólogo visualizar mejor los detalles citológicos para realizar un diagnóstico preciso. En la Figura 1 se ilustra un ejemplo de una mancha pap manual rápida de un espécimen procedente de una trompa de Falopio benigna. Como se muestra en la Figura 1 , la maniobra del cepillo da lugar a un muestreo adecuado de la muestra. Además, la tinción rápida manual de PAP proporciona una buena resolución de los detalles nucleares y la transparencia citoplásmica, que son esenciales para la evaluación precisa de las células tubáricas.

La comparación entre el manual rápido Pap stAin de una diapositiva de citología y la tinción de H & E de una diapositiva cytospin se muestra en la Figura 2 . Una de las ventajas de la preparación de diapositivas antes mencionada en comparación con el frotis convencional es que tiene un fondo mucho más limpio y una mejor resolución de detalles nucleares y transparencia citoplásmica. Un ejemplo de SEE-FIM del Protocolo de trompas de Falopio se demuestra en la Figura 3 . Como se muestra en la Figura 1 , la presencia de dos poblaciones de células (células ciliadas y células secretoras) es una característica del epitelio tubárico benigno. La histología de las secciones representativas de la fimbria y la ampolla se muestra en la Figura 4 . La maniobra del cepillo muestra alteración leve de la estructura de las vellosidades en aproximadamente un tercio de la muestra.

En nuestro estudio anterior 17 , el diagnóstico citológico tubario se correlacionó con el diámetro histológicoGnosis de HGSC muy bien (100%). El aspecto citológico de la malignidad muestra truncos tridimensionales compuestos por células con nucleolos prominentes y anisonucleosis ( Figura 5a ). En contraste, la citología reactiva atípica presentó como placas anguladas compuestas de células atípicas con nucleolos pequeños y anisonucleosis moderada sin agrupamiento tridimensional ( Figura 5b ). Los grupos de células similares a HGSC se observaron en el contexto de hojas anguladas de células epiteliales normales ( Figura 6 ).

Figura 1
Figura 1: Ejemplo de una mancha rápida manual de Pap del epitelio tubariano benigno. ( A ) Células de fondo. Las células de fondo incluyen pequeños grupos de células que consisten en grandes células secretoras y pequeñas células ciliadas, grandes únicas (presumiblemente secCélulas retinianas) y células pequeñas (presumiblemente células ciliadas), núcleos desnudos grandes y pequeños dispersos. ( B ) Clúster de células pequeñas formado por pequeñas células ciliadas y grandes células secretoras (flecha). ( C ) Tira de epitelio ciliado (flecha). ( D ) Epitelio tubárico con hojas de tipo mesotelial. Se observó el apego de las células ciliadas en la periferia (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Comparación entre la tinción Pap manual rápida de una diapositiva citológica ( A ) y la tinción con H & E de una diapositiva de citospina ( B ). Un grupo benigno de células anguladas está presente en el centro de la mancha de Pap y H & E mancha diapositivas. Ambos métodos proporcionanResolución para la evaluación citológica de la muestra. Sin embargo, la tinción de Pap de la diapositiva citología produjo un fondo más limpio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Ilustración de SEE-FIM del tubo de Falopio. Obsérvese la sección longitudinal del segmento del infundíbulo y de las fimbrias y la sección transversal del istmo y la ampolla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Histología del epitelio tubárico benigno.( A ) segmento de Fimbriae. El epitelio tubárico consta de dos poblaciones celulares distintas: pequeñas células ciliadas (flechas) y grandes células secretoras no ciliadas (círculos). Se observa una ligera perturbación de la villa. ( B ) sección de Ampulla. Observe la fimbria con forma de dedo. ( C ) Alteración leve de la estructura de las vellosidades (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Comparación entre el grupo atípico ( a ) y el grupo maligno tridimensional ( b ) . La citología maligna muestra clusters tridimensionales compuestos por células con nucleolos prominentes y anisonucleosis ( b ). La citología atípica muestra una lámina anguladaS compuesto de células atípicas con nucleolos pequeños y anisonucleosis moderada. Nota: No hay clustering tridimensional presente ( a ). Esta cifra se ha adoptado a partir de la referencia 17 .

Figura 6
Figura 6: Correlación entre la aparición citológica e histológica de la neoplasia intraepitelial. (A) neoplasia intratubárica citológico. Neoplasia intratubal citotológica que muestra la adquisición de contorno tridimensional y anisonucleosis significativa y núcleoli rojo cereza grande (círculo) dentro del contexto de las hojas anguladas de las células epiteliales normales (flecha). ( B ) Sección de patología quirúrgica correspondiente con carcinoma intraepitelial tubárico. Obsérvese las células altamente displásicas (círculo) adyacentes a las células epiteliales de aspecto relativamente normal (flecha). Esta cifra ha sidoAdoptada a partir de la referencia 17 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1: Pasos de tinción no Gyn.

Etanol al 95% 5 minutos
H2O 10 seg
Hematoxilina 15 seg - 3 min
H2O destilada 5 minutos
Etanol al 95% 30 segundos
EA65 2 - 5 min
Etanol al 95% 30 segundos
Etanol al 95% 30 segundos
Etanol al 100% 30 segundos
Etanol al 100% 30 segundos
Xileno 30 segundos
Xileno 5 minutos
Etanol al 95% 10 inmersiones
H2O 10 inmersiones
Hematoxilina 10 seg-1 min
H2O destilada 10 inmersiones
Etanol al 95% 10 inmersiones
EA65 1 - 3 min
Etanol al 95% 10 inmersiones
Etanol al 100% 10 inmersiones
Xileno Sumerja hasta limpiar

Tabla 2: Pasos manuales de tinción rápida de Pap.

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Discussion

Se ha demostrado que la salpingectomía bilateral profiláctica o la salpingo-ooforectomía disminuyen el riesgo de desarrollar HGSC en poblaciones de alto riesgo, como las mujeres con mutaciones genéticas BRCA y una fuerte historia familiar de cáncer. Sin embargo, la esterilidad y la menopausia quirúrgica causada por la cirugía son graves consecuencias y tomar una decisión difícil, especialmente para las mujeres en edad fértil. El estudio anterior ha demostrado una excelente correlación entre la citología tubaria y la histología [ 17] . Creemos que la citología tubárica en células de trompas de Falopio recolectadas laparoscópicamente tiene un gran potencial para convertirse en una herramienta práctica y mínimamente invasiva para la detección temprana del cáncer.

Los pasos más críticos para la recolección exitosa de células de trompas de Falopio son: 1) El tiempo entre el pinzamiento del suministro de sangre y la recolección de células; Y 2) Maniobra suave y correcta del pincel tacto suave.

El tiempo (dentro de 30 minutosEs) entre el pinzamiento y la recolección de células es crucial para la buena preservación de la morfología y detalles nucleares de las células recogidas. La comunicación efectiva entre los patólogos y los cirujanos asegura que el espécimen se entregue en el sitio de recolección dentro de este período. La gran mayoría de los casos incluidos en el estudio se realizaron en la sala de sección congelada. Para recoger con éxito las células tubáricas, la persona que realiza la colección debe intentar lo mejor posible para evitar que el pincel toque la superficie serosa de ovario debido a la implicación de estadificación si el caso es maligno. En algún momento, esto puede ser difícil debido a la proximidad de los dos órganos involucrados y la complejidad de la anatomía del espécimen. La separación de las trompas de Falopio de todo el espécimen antes de la recolección puede ser justificada.

El pincel tacto suave utilizado en este estudio puede recoger un gran número de células que pueden ser fácilmente transferidos a diapositivas o un frasco de solución conservadora,Y tiene una punta del tacto suave-diseñada para reducir al mínimo trauma al canal. Además, toda la maniobra debe ser lenta y suave para evitar molestar gravemente las estructuras vellosas de la mucosa tubárica. En algunos casos, puede ser difícil conseguir que el pincel pase toda la trompa de Falopio debido a la obstrucción. Sin embargo, es importante intentar recolectar las células de las fimbrias y de la porción infundibular, ya que se cree que la mayoría del HGSC se origina en el extremo distal de la trompa de Falopio. Sin embargo, la recolección no debe proceder si la integridad de la muestra puede estar potencialmente comprometida.

Basado en nuestra experiencia, el espécimen puede almacenarse en solución conservante durante varios meses sin comprometer la morfología de las células recogidas. La tinción de Papanicolaou es una técnica de tinción citológica comúnmente utilizada en citopatología. Las principales ventajas de este procedimiento de tinción incluyen: 1) Buena definición de detalle nuclear;Y 2) transparencia citoplásmica. En este estudio, se usaron dos procedimientos de tinción de Papanicolaou modificados para la tinción con diapositivas de citología, incluyendo el procedimiento de tinción no gimnométrico automatizado y el procedimiento de tinción de Papa rápida. Ambos procedimientos proporcionan una excelente y confiable tinción de diapositivas, que muestra buena preservación de los detalles nucleares y citoplásmicos, y un fondo limpio. Aunque las diapositivas de citospin generalmente tienen mayor antecedente en comparación con las diapositivas citológicas, su mancha de H & E demostró una calidad similar de tinción celular. La tinción de H & E de estos portaobjetos puede ser un método alternativo adecuado para el análisis de citología tubaria si no se dispone de un procesador automático.

El protocolo SEE-FIM se utiliza para recaudar todas las trompas de Falopio incluidas en este estudio, incluidos los casos benignos y malignos. El protocolo SEE-FIM se desarrolló inicialmente para muestras de salpingo-ooforectomía bilateral profiláctica con BRCA positivo, que es una opción estándar de reducción del riesgo fO BRCA mutación. Este protocolo permite la exposición máxima de las plicas tubáricas, de las que se cree que se origina el STIC. Esto se toma actualmente como el patrón oro para la detección de HGSC extensión tubárica y STIC. La correlación entre el hallazgo citológico tubárico con el hallazgo histológico de SEE-FIM es crucial para que este estudio valide la eficacia del protocolo actual.

Una preocupación de la recolección de células tubáricas usando un cepillo táctil suave es que la maniobra puede alterar la integridad del epitelio tubárico y dificultar la interpretación histológica más precisa de los especímenes quirúrgicos, especialmente la estadificación del tumor, si se identifica la malignidad. Sin embargo, sobre la base de nuestra experiencia, aproximadamente un tercio de los casos muestran leve alteración de las vellosidades en el análisis histológico, que generalmente no interfiere con la interpretación final de la histología tubárica.

Nuestro estudio anterior ha demostrado que la citología tubárica es sensible y específicaEn la detección de HGSC y STIC. Será de gran interés probar más aún si la combinación de citología tubárica con marcadores de biomarcadores como P53 e IMP3 puede aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección de cáncer seroso de origen tubario. El estudio futuro se centrará en el desarrollo de un procedimiento laparoscópico para el muestreo del epitelio de falopio in vivo .

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Departamento de Patología de la Universidad de Arizona por el apoyo financiero. El proyecto está parcialmente respaldado por el fondo de dotación Mark y Jane Gibson a WZ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit CooperSurgical C0112
ThinPrep preservCyt solution HOLOGIC 234005
ThinPrep 2000 Processor HOLOGIC 70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65 sigma aldrich HT40432
95% Ethanol sigma aldrich 652261
100% Ethanol sigma aldrich 493538
Xylene sigma aldrich 214736
Hematoxylin sigma aldrich H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor SAKURA TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight Pilgrim medical equiment FA710-45
Chemware Forceps United state plastic corp 76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short SAKURA 4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short SAKURA 4786

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