펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

Published 8/01/2017
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Biochemistry

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Summary

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

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Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

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Abstract

히스톤 단백질에 대한 번역 후 변형 (PTMs)은 염색질 구조 및 유전자 발현 조절에서의 역할에 대해 널리 연구되고있다. 히스톤 PTM에 특이적인 항체의 대량 생산 및 분포는 이러한 표지에 대한 연구를 크게 촉진시켰다. 히스톤 PTM 항체는 많은 염색질 생화학 분야의 주요 시약이기 때문에 항체 특이성의 엄격한 분석이 정확한 데이터 해석과 현장에서의 지속적인 진보에 필요합니다. 이 프로토콜은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일 링하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 통합 파이프 라인을 설명합니다. 이 절차의 설계 및 분석 측면은 Microarray 인쇄 형식의 사용자 정의를 간소화하기 위해 최근 개발 한 오픈 소스 및 대화 형 소프트웨어 패키지 인 ArrayNinja를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용되고 널리 사용되고있는 히스톤 PTM 항체이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 Histone Antibody Specificity Database를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 히스톤을 넘어, 여기에 기술 된 일반적인 방법론은 PTM 특이 적 항체의 분석에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

Introduction

게놈 DNA는 히스톤 단백질이있는 진핵 세포 핵 내부에 우아하게 포장되어 염색질을 형성합니다. 염색질의 반복적 인 아 단위는 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4 1) 의 8 량체 핵 주위에 감싸 진 147 염기쌍의 DNA로 구성된 뉴 소솜 (nucleosome)이다. 크로마 틴은 느슨하게 패킹 된 진균 염색체와 단단히 채워진 헤테로 크로마 틴 도메인으로 광범위하게 구성됩니다. 염색질 압축 정도는 단백질 기계가 복제, 전사 및 수리와 같은 기본적인 DNA 템플릿 공정을 수행하기 위해 기본 DNA에 접근 할 수있는 정도를 조절합니다.

염색체의 맥락에서 게놈 접근성의 주요 조절 인자는 히스톤 단백질 2 , 3 의 구조화되지 않은 꼬리와 핵심 부위의 PTM입니다. 히스톤 PTM은 염색질 4 의 구조에 직접적으로 영향을 미치고 간접적으로 기능합니다.염색질 개질, 효소 및 스캐 폴딩 활동을하는 독자 단백질 및 관련 거대 분자 복합체의 모집 5 . 지난 20 년간 히스톤 PTM 기능에 대한 연구는 세포의 운명, 유기체 발달 및 질병의 시작 / 진행을 조절하는 데 중요한 역할을한다는 것을 압도적으로 제안합니다. 질량 분석 기반 단백체 기술의 발전에 힘 입어, 80 명 이상의 서로 다른 히스톤 잔류 물에 20 개 이상의 고유 한 히스톤 PTMS는 6 발견되었다. 주목할 만하게,이 수정은 수시로 조합에서 생기고, "히스톤 부호"가설과 일치하여, 수많은 학문은 독자 단백질이 히스톤 PTMs의 특정한 조합의 승인을 통해 염색질의 불연속 지역에 표적으로 한 ㄴ다는 것을 건의한다 7 , 8 , 9 . 앞으로 나아갈 핵심 과제는 gr에 함수를 할당하는 것입니다.히스톤 PTM의 목록을 작성하고 히스톤 PTM의 특정 조합이 염색질과 관련된 동적 기능을 조율하는 방법을 결정할 수 있습니다.

항체는 히스톤 PTM의 검출을위한 lynchpin 시약입니다. 이와 같이, 염색질 생화학 연구에 사용하기 위해 1,000 개 이상의 히스톤 PTM 특이 적 항체가 상업적으로 개발되었습니다. 고효율 DNA 시퀀싱 기술의 급속한 발전으로이 시약은 ChIP-seq (염색질 면역 침전 및 차세대 시퀀싱)에서 개별 조사자와 대규모 후성 유전체학 "로드맵"이니셔티브 ( 예 : ENCODE 및 BLUEPRINT)에 광범위하게 사용되고 있습니다 ) 파이프 라인은 히스톤 PTM 분포 게놈 전체의 고해상도 공간 맵을 생성합니다 10 , 11 . 그러나 최근의 연구에 따르면 히스톤 PTM 항체의 특이성은 매우 다양 할 수 있으며 이러한 시약은 unfones 오프 - 타겟 에피토프 인식, 이웃 PTM에 의한 강한 긍정 및 부정적인 영향, 특정 잔기 ( 예 : 모노 -, 디 - 또는 트리 - 메틸 리신)의 변형 순서 식별 어려움과 같은 유용한 특성 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . 따라서 히스톤 PTM 특이 적 항체 시약의 엄격한 품질 관리가 이러한 유용한 시약으로 생성 된 데이터를 정확하게 해석하는 데 필요합니다.

Microarray 기술은 높은 처리량, 재현성 및 소형화 된 포맷으로 수천 개의 거대 분자 상호 작용을 동시에 조사 할 수있게합니다. 이러한 이유로, 단백질 -DNA 19 을 분석하기 위해 다양한 마이크로 어레이 플랫폼이 만들어졌으며 ,"> (20), 단백질 - 단백질 21 단백질 펩타이드의 상호 작용 (22). 실제로, 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 작가, 지우개의 높은 처리량 프로파일 링을 가능하게 염색질 생화학 연구에 대한 정보를 검색 플랫폼으로 등장, 그리고 히스톤의 독자 PTMS 15있다 , 23, 24, 또한 히스톤 항체 특이성의 분석을 위해 17, 25. 염색질과 후성 유전학 연구에 자신의 응용 프로그램을 넘어, 히스톤 펩타이드 배열은 전신성 홍 반성 루푸스 등의자가 면역 질환에 대한 진단 / 예후 테스트 잠재적 인 유틸리티가 어디 방지 염색질자가 항체가 생성됩니다 26 , 27 .

여기서는 설계, 제작 및 큐를 위해 개발 한 통합 파이프 라인을 설명합니다.히스톤 및 그 PTM을 인식하는 항체에 대한 특이성 프로파일을 생성하기 위해 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이를 제조한다. 파이프 라인은 ArrayNinja, 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 단계를 통합하는 오픈 소스, 우리는 최근에 개발 된 대화 형 소프트웨어 응용 프로그램에 의해 촉진된다. ArrayNinja는 Google 크롬에서 가장 잘 작동합니다. 간단히 말하면, 로봇 접촉 마이크로 어레이 프린터를 사용하여 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리 현미경 슬라이드상의 한정된 위치에 비오틴 - 컨쥬 게이트 된 히스톤 펩타이드의 라이브러리를 침착시킨다. 그런 다음 항체 - 항원 결정기 상호 작용을 조사하기 위해 경쟁적이고 평행 한 분석 형식으로 배열을 사용할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 펩타이드 라이브러리는 PTM (라이신 아세틸 화, 라이신 / 아르기닌 메틸화, 및 세린 / 트레오닌 인산화)이있는 수백 가지의 독특한 합성 펩타이드와 프로테오믹스 데이터 세트에서 주로 유래 된 적절한 조합으로 구성됩니다. 펩타이드 합성 및 검증 방법 다른 곳에서 (23)에 자세히 설명되어 있습니다. 이 어레이 플랫폼을 사용하는 진행중인 히스톤 PTM 항체 스크리닝 작업에서 생성 된 데이터는 공개 웹 리소스 인 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에 보관됩니다. 특히,이 프로토콜의 변형으로 제작 된 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이는 히스톤 PTM 판독기 도메인 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 의 활성을 특성화하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. PTM 작성자 및 지우개 활동 24 .

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그림 1 : 히스톤 펩타이드 마이크로 어레이에서 항체 스크리닝을위한 Stepwise 절차의 카툰 묘사. 정의 된 번역 후 변형 (적색 및 청색 원)을 갖는 비 오티 닐화 히스톤 펩타이드는 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 유리상에 바이오틴 - 플루오 레세 인과 함께 인쇄된다. 양성 상호 작용은 적색 형광으로 시각화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Protocol

1. ArrayNinja 설치 및 실행

  1. www.virtualbox.org에서 Oracle Virtual Box를 다운로드하여 설치하십시오.
  2. http://research.vai.org/Tools/arrayninja에서 ArrayNinja 가상 시스템 (VM)을 다운로드하고 압축을 푸십시오.
  3. VirtualBox를 열고 'Machine', 'Add'를 클릭하여 ArrayNinja VM을 추가하고 ArrayNinja VM이 저장된 폴더에서 arrayninja.vbox를 선택하십시오.
  4. 가상 박스에서 ArrayNinja를 선택하고 초록색 '시작'화살표를 클릭하여 ArrayNinja를 시작하십시오.
  5. Virtual Box는 새 창을 열고 웹 브라우저에서 localhost : 2080으로 이동하여 VM에 액세스 할 수 있다는 메시지를 표시합니다.60; 참고 : ArrayNinja의 컨테이너 버전 hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/를 통해도 가능합니다

2. 배열 슬라이드 및 소스 플레이트 레이아웃 디자인

  1. ArrayNinja 인터페이스의 '슬라이드 레이아웃 계획'아래에서 사용중인 마이크로 어레이 프린터에 해당하는 링크를 클릭하십시오.
    참고 : ArrayNinja는 일반적으로 사용되는 두 개의 마이크로 어레이 프린터의 로봇 움직임을 모방하도록 프로그래밍되었습니다 ( 참조).1). 요청에 따라 다른 배열 자와의 호환성을 구성 할 수 있습니다.
  2. 'Load plate'대화 상자 내부를 클릭하고 'empty'를 입력 한 다음 'enter'를 클릭하십시오. ArrayNinja 디자인 모듈의 스크린 샷은 그림 2 를 참조하십시오.
  3. 스폿 직경을 275 μm로 조정하고 스폿 간격을 375 μm로 조정하십시오. 나머지 설정 (플레이트 블록 / 플레이트 행, 전체 플레이트 행, 복제, y의 기능, 수퍼 어레이, SuperA 퍼지, 그림 2 참조)을 조정하여 기능이 마이크로 어레이 슬라이드에 표시되는 방법을 사용자 정의하십시오.
    참고 : 스팟 지름은 마이크로 어레이 핀의 크기에 의해 결정됩니다. 이러한 설정이 조정되면 실시간으로 만화 슬라이드가 업데이트됩니다. 이 만화를 사용하여 각 설정이 최종 슬라이드 레이아웃을 수정하는 방법을 미리 봅니다.
  4. 슬라이드의 피쳐 레이아웃이 완료되면 각 고유 피쳐 위로 마우스를 이동하고 팝업 대화 상자에 피쳐 식별자를 입력하십시오.
    참고 : 기능 식별자는 숫자, 문자 또는 조합으로 구성 될 수 있습니다. 이 기능은 고유 기능에만 필요하며 복제를 선택하면 대화 상자가 나타나지 않습니다.
  5. 모든 고유 기능에 식별자가 지정되면 '채우기'를 클릭하십시오. 슬라이드 레이아웃의 이름을 입력하고 '인쇄판 인쇄'를 클릭하여 저장하십시오. 선택한 슬라이드 디자인을 제작하는 데 필요한 384 개의 소스 플레이트 개수와 소스 플레이트에로드 할 각 피쳐의 물리적 위치를 매핑하는 테이블이 표시된 새 페이지가 열립니다.
    참고 :이 이름은 마이크로 어레이 데이터를 분석 할 때이 디자인을 불러오는 데 사용되므로이 이름을 기억하십시오 (6.2 절 참조). '인쇄판 인쇄'를 클릭하면 ArrayNinja 내에 레이아웃이 저장됩니다.

그림 2
그림 2 : ArrayNinja 디자인 모듈. 스크린 샷 ArrayNinja 디자인 모듈은 점선으로 표시됩니다. 제어판 (상단)은 마이크로 어레이 프린터에서 변경할 수있는 모든 매개 변수를 보여줍니다. 이 매개 변수가 조정되면 슬라이드 레이아웃의 만화 이미지 (왼쪽 하단)가 실시간으로 업데이트됩니다. 레이아웃이 설정되면 사용자는 개별 스폿을 마우스로 클릭하여 고유 한 피쳐 식별자를 입력 할 수 있습니다. ArrayNinja는 지정된 마이크로 어레이 슬라이드 레이아웃을 제작하는 데 필요한 소스 플레이트 (오른쪽 아래)의 각 기능 위치 맵을이 사용자 입력으로부터 구성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 제작 Microarrays

  1. 소스 플레이트 준비
    1. 섹션 2.5의 ArrayNinja로 생성 된 맵을 사용하여 384-well source plate를 생성하십시오.
      참고 :이 플랫폼에서 질문하는 펩타이드에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.s = "xref"> 17.
    2. 1 ~ 2 μL의 각 특징 ( 예 : biotinylated histone peptide)을 384-well source plate (s)의 올바른 well에 넣는다.
      참고 : Biotinylated 히스톤 펩타이드는 일반적으로 하나의 배열 자리에 streptavidin 결합 사이트에 펩타이드의 10 ~ 25 배 몰 과량에 해당하는 200 - 400 μm의 주식 솔루션에서 입금됩니다. 이것은 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
      방정식
      여기서 V 는 핀에 의해 전달되는 부피, [ P ]는 인쇄되는 형상의 농도, N A 는 아보가드로의 수, S 는 스폿의 표면적입니다. C 는 단위 면적당 스트렙 타비 딘 분자의 수에 3을 곱한 (사용 가능한 스트렙 타비 딘 결합 사이트의 평균 수)로 나타낸 슬라이드의 적용 범위입니다. VC 는 각각의 제조업 자에 의해 얻어진다. 다른 기능은군집이 우려되는 생체 분자의 크기에 따라 다른 농도가 필요합니다. 새로운 유형의 피쳐 각각에 대한 인쇄 농도의 범위는 최적의 인쇄 농도를 결정하기 위해 경험적으로 테스트해야합니다.
    3. 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 1x 인쇄 버퍼로 각 기능을 10 배 희석하십시오. 상온에서 2 분 동안 500xg에서 소스 플레이트를 돌립니다.
      참고 : 인쇄 버퍼에 fluorescein-labeled biotin (5 μg / μL)을 포함시키는 것이 spotting control 및 분석 중에 알맞은 배열 정렬을 돕기위한 시각 보조 장치로 권장됩니다 ( 그림 4 참조).
  2. 인쇄 프로토콜 ( 그림 3A -B ).
    1. 폐기물 수집 용기를 비우고 세척 용액 용기와 가습기 용기에 멸균 증류수를 채워서 어레이를 준비하십시오.
    2. u 매개 변수를 입력하십시오.ArrayNinja (섹션 2 및 그림 2 )의 슬라이드를 마이크로 어레이 프린터 제어 프로그램에 맞게 설계하십시오.
    3. microarray 프린터 제어 프로그램을 사용하여 한 번의 침지로 1 초 세척을위한 세척 절차를 설정하십시오. 각 세척 후 5 번 핀을 다시 흘리기위한 세척 후 설정을 설정하십시오. 습도를 60 %로 설정하십시오.
      참고 : 최적의 세척 구성은 사용되는 마이크로 어레이 프린터에 따라 다를 수 있습니다. 최적의 세척 후 핀 딥 구성은 사용되는 마이크로 어레이 프린터에 따라 다를 수 있습니다.
    4. 기능성 슬라이드 ( 예 : 스트렙 타비 딘 코팅 유리)를 기판 플래 튼에 삽입하고 모든 플래 튼을 플래 턴 엘리베이터에 놓습니다. 소스 플레이트를 플레이트 홀더에 넣고 소스 플레이트 엘리베이터에 넣습니다.
    5. '인쇄'를 클릭하십시오. 모든 세탁 및 딥 설정이 올바른지 확인하기 위해 몇 차례의 기능 증착을 위해 인쇄 프로세스를 모니터링하십시오. 인쇄 작업이 완료되면기판은 어레이 장치로부터 플래 튼 (platens)된다.
      참고 : 큰 인쇄 작업으로 1 일 이내에 차단 단계가 완료되지 않으면 인쇄 된 슬라이드를 가습 챔버에서 4 ° C 밤새 인큐 베이트 할 수 있습니다. 플라스틱 랩으로 밀봉 된 골판지 상자 안의 작은 비이커 옆에 슬라이드를 품습니다.
    6. 섞어 실온에서 30 분 동안 차단 완충액으로 슬라이드를 차단하십시오.
    7. 슬라이드를 실온에서 인산 완충 식염수 (PBS) (pH 7.6)와 2 분간 혼합하여 씻으십시오. 실온에서 30 초 동안 microarray 슬라이드 원심 분리기에서 회전하여 슬라이드를 건조.
      참고 : 한 번에 많은 수의 슬라이드를 처리하기 위해 높은 처리량의 현미경 슬라이드 세척 챔버를 사용하여 50 개의 슬라이드를 동시에 씻을 수 있습니다.
    8. 왁스로 분할되도록 설계된 슬라이드의 경우 4.1 절을 계속 진행하십시오. 다른 모든 디자인의 경우 빛과 습기로부터 보호 된 4 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오.
      참고 : 인쇄 된 biotinylated 히스톤 펩타이드이런 방식으로 저장하면 적어도 6 개월 동안 안정적입니다.

4. 분할 Microarray 활주

  1. 소수성 왁스 펜 ( 그림 3C )
    1. 왁스 펜을 사용하여 피처가 포함 된 영역 주위에 왁스를 바릅니다. 섹션 5로 진행하기 전에 왁스를 5 분간 공기 건조시킵니다.
      참고 : 차단 후 어레이 스폿은 눈으로 시각화하기가 매우 어려울 수 있습니다. ArrayNinja의 슬라이드 디자인은 축척으로 인쇄 할 수 있으며 왁스를 적용 할 때 가이드로 사용할 수 있습니다.
  2. 실리콘 가스켓 ( 그림 3D )
    1. 어레이 가스켓 뒷면의 투명 필름을 떼어 내고 접착면을 마이크로 어레이 슬라이드 위에 놓습니다.
    2. 5 절을 계속하기 전에 5 초 동안 가스켓을 제 위치에 두십시오.
  3. 왁스 인쇄물 ( 그림 3E )
    1. 왁스로 분할하도록 설계된 슬라이드의 경우 10 % BSA를 사용하여 일반 유리에 시험 슬라이드를 인쇄하십시오. 이 테스트 슬라이드를 사용하여 모든 기능이 왁스 몰드 챔버 내에 있는지 확인하기 위해 왁스 임 프린터 가이드 또는 배열 설정을 최적화하십시오.
    2. 모든 왁스가 완전히 녹을 때까지 약 30 분 동안 마이크로 어레이 왁스 임 프린터를 85 ° C로 가열하십시오.
    3. 인쇄 된면을 아래로 향하게하여 슬라이드를 삽입하고 슬라이드를 마이크로 어레이 임 프린터의 오른쪽 가이드까지 끝까지 밀어 넣으십시오. 몰드가 슬라이드의 표면에 닿도록 레버를 당깁니다. 2 초간 기다리십시오.
      참고 : 최적의 왁스 경계 두께를 달성하기 위해 유지 시간을 변경할 수 있습니다.
    4. 슬라이드를 신속하게 제거하고 왁스 경계를 ​​육안으로 검사하여 모든 우물이 밀폐되어 있고 테두리가 너무 두껍지 않아서 그 지점을 침범 할 수 없도록하십시오. 수분과 빛으로부터 보호되는 4 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오.
      참고 : 두껍거나 얇은 테두리를 얻으려면 보류 시간을 늘리거나 줄일 수 있습니다.

"그림 그림 3 : Microarray Fabrication. 접촉 microarray 프린터를 사용하여 streptavidin - 코팅 현미경 슬라이드 (A) 히스톤 펩티드 microarray 제작. (B) 48 × 48 격자의 펩타이드 특징의 3 개의 서브 어레이로 제조 된 마이크로 어레이. 소수성 왁스 펜으로 (C) 3 개의 서브 어레이, (D) 실리콘 접착제로 2 개의 서브 어레이, (E) 왁스 임프린트로 48 개의 서브 어레이를 분리. 표시된 모든 마이크로 어레이는 25 x 75 mm 현미경 슬라이드를 사용하여 제작됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 히스톤 PTM 항체와 펩타이드 마이크로 어레이의 혼성화

  1. 하이브 리다이 제이션 버퍼 (PBS, 산도 7.6, 5 % BSA, 0.1 % 트윈 -20)를 준비합니다.
  2. 하이브리드 화 버퍼에서 슬라이드 평형하이브리드 화 용기를 사용하여. 하이브 리다이 제이션 완충액에서 전체 슬라이드를 완전히 덮고 저속에서 궤도 진탕 기에서 4 ° C 30 분 동안 품을 수 있습니다.
  3. 하이브 리다이 제이션 버퍼에 희석 히스톤 PTM 항체가 들어있는 용액을 준비합니다.
    참고 : 예제 데이터에서 histone Antibody # 1과 Antibody # 2는 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 1 : 1,000으로 희석했습니다. 면역 블로 팅에 사용 된 것과 유사한 희석 범위가 출발점으로 권장됩니다.
  4. 4 ° C에서 1 시간 항체 용액으로 어레이를 품어 라. 항체 용액을 제거하고 4 ° C에서 5 분간 3 번 어레이를 3 번 ​​씻으십시오 (차가운 PBS, pH 7.6).
  5. 하이브 리다이 제이션 버퍼에 형광 염료가 접합 된 2 차 항체의 1 : 5,000 - 1 : 10,000 희석액을 준비하십시오.
  6. 4 ° C에서 30 분 동안 이차 항체 솔루션과 배열을 품어 ° C 빛으로부터 보호. 2 차 항체 솔루션을 제거하고 PBS, 산도 7.6 4 ° C에서 5 분 3 번 microarray 슬라이드를 씻으십시오. 담그다실온에서 과량의 염을 제거하기 위해 0.1x PBS, pH 7.6을 함유하는 50-mL 원뿔 튜브 내의 마이크로 어레이. 실온에서 microarray 슬라이드 원심 분리기에서 슬라이드를 건조.
  7. Microarray 스캐너 제조업체의 권장 스캔 프로토콜에 따라 25 μm 이상의 해상도로 마이크로 어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔하십시오.
    참고 : fluorescein-labeled biotin tracer가있는 경우, 녹색 채널 (예 : 488 nm, 509 nm)과 형광 염료가 결합 된 2 차 항체 (일반적으로 적색 (예 : 635 nm, em) : 677 nm). 스캔의 목적은 단일 .png 파일로 병합 할 수있는 단일 채널 .tif 파일을 얻는 것입니다 (6.1 절에서 설명).

6. ArrayNinja를 이용한 마이크로 어레이 데이터 분석

  1. 병합 된 마이크로 어레이 이미지 준비하기
    참고 :이 섹션의 목표는 두 개의 단일 채널 .tif 파일 (섹션 5에서 얻음)을 병합하는 .png 이미지 파일을 만드는 것입니다. 이ArrayNinja 분석 모듈과 호환되는 유일한 이미지 형식입니다. 다음 지침은 병합 된 이미지 파일을 얻는 한 가지 방법을 나타냅니다. 그러나 다른 솔루션도 사용할 수 있습니다 ( 예 : 프리웨어 ImageJ).
    1. 프리웨어 ImageMagick이 설치된 컴퓨터의 bash 터미널에있는 명령 줄에서 단일 채널 .tif 파일이 들어있는 폴더로 이동하여 각 단계 (6.1.4 - 6.1) 사이에 'enter'키를 눌러 다음 단계를 복사하여 붙여 넣으십시오. .7).
      참고 : 대문자로 된 파일 이름 ( 예 : RED_CHANNEL)은 마이크로 어레이 슬라이드 이미지의 파일 이름으로 대체해야합니다.
    2. 필요한 경우 'convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'명령을 사용하여 이미지를 반전하십시오. 스캐너가 신호가 흰색이고 배경이 검은 색 인 .tif 파일을 저장하는 경우 필요합니다.
      1. 변환 -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0- 채널 GB - 집합 0 평가 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. 전환ert - 깊이 16 CONTROL_CHANNEL.TIF - 클론 0 채널 RB - 세트 0 측정 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. 변환 - 깊이 16 CONTROL_CHANNEL.TIF - 복제 0 - 채널 RG - 집합 0 평가 -delete 0 outB.png 2> 오류. 파일.
      4. convert out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png.
        참고 : 'merged.png'라는 파일은 원본 .tif 파일과 동일한 폴더에 저장됩니다.
  2. ArrayNinja를 사용하여 데이터 정량화
    1. ArrayNinja를 열고 "알려진 원본 플레이트가있는 이미지를 정량화하려면"에서 적절한 마이크로 어레이 프린터 링크를 클릭하십시오. 로드 플레이트 대화 상자에 저장된 슬라이드 디자인의 이름을 입력하고 (2.5 단계) '입력'을 클릭하십시오. ArrayNinja 분석 모듈의 스크린 샷은 그림 4 를 참조하십시오.
    2. '파일 선택'을 클릭하고 6.1 절에서 생성 한 'merged.png'파일을 찾아 선택하십시오. 병합 된 이미지e뿐만 아니라 슬라이드 레이아웃에 대한 그리드를로드합니다.
    3. ArrayNinja 제어판 아래에있는 슬라이더를 사용하여 대비, 밝기 및 중간 점을 조정하십시오.
      참고 :이 조정은 시각화 목적으로 만 사용되며 수량화에는 영향을 미치지 않습니다.
    4. "해상도"를 선택하고 스캔 한 이미지의 해상도와 일치하는 값을 입력하십시오. "margin side"와 "margin top"을 사용하여 그리드를 배열의 스팟들과 정렬시킵니다. 가능한 한 각 지점에서 그리드가 밀접하게 정렬되도록 필요한만큼 조정합니다.
    5. 'Spot Seek'을 클릭하고 버튼이 원래 회색 색상으로 돌아갈 때까지 기다립니다.
      참고 :이 작업을 여러 번 반복하여 그리드 원을 개별 스팟의 중심에 배치 할 수 있습니다. Seek 기능은 각 지점을 향해 그리드를 완화하여 정렬을 미세 조정합니다.
    6. "Super Arrays"값을 "1"로 변경하여 각 하위 배열 패널을 개별적으로 작업하십시오 (원하는 경우). 4x 12 왁스 임프린트 슬라이드 레이아웃 ( 그림 3E ), "iPin" "jPin"및 "subA"컨트롤을 사용하여 4 x 12 웰의 원하는 조합을 분석하는 기능을 끄십시오. 예를 들어 왼쪽 위 우물과 우물을 각각 복제물로 분석하려면 iPin에 "1 4", jPin에 "1 1"을 입력하고 subA에 "1 4"를 입력하십시오. 'enter'키를 누릅니다.
    7. 마우스를 개별 스폿 위로 이동하면 해당 기능의 ID를 볼 수 있습니다.
    8. 기능을보다 신중하게 검토하려면 '토글 줌'을 클릭하십시오. 마우스가 자리 위에있을 때 'R'키를 눌러 배경 참조 점을 선택하십시오. 참조 점이 주황색으로 강조 표시됩니다.
      참고 : "토글 줌"모드에서는 마우스 오른쪽 위에 마우스가있는 기능의 확대 이미지가 표시됩니다. ArrayNinja의 추가 배경 보정 기능에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 28 설명되어 있습니다.
    9. 영향을받는 지점 위로 마우스를 가져 가면서 'A'키를 눌러 스폿을 전환 (정확한 정량화에 영향을주는 광범위하게 변하는 스폿 형태 또는 파편이 있음) 할 수 있습니다. 비활성화 된 스폿은 흰색으로 변합니다.
    10. 'populate'다음에 'Submit'을 클릭하여 스팟을 정량화하십시오.
      참고 : 새 탭이 열리고 가장 밝은 스팟 평균으로 정규화 된 데이터의 막대 그래프가 표시됩니다. 막대 그래프 아래의 표는 정규화 된 값과 원시 데이터 값을 모두 포함합니다. 이 테이블은 보관 및 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 복사 할 수 있습니다.

그림 4
그림 4 : ArrayNinja 분석 모듈. ArrayNinja 분석 모듈의 스크린 샷이 표시됩니다. 제어판 (왼쪽 위)에는 배열을 시각화하고, 반점을 찾고, 그 위에 격자를 정렬하기 위해 조정할 수있는 모든 매개 변수가 표시됩니다배열 이미지. 기능 위로 마우스를 가져 가면 확대 된보기 (오른쪽 위)가 표시되고 해당 기능과 관련된 식별 정보 (아래)가 포함 된 팝업이 표시됩니다. 배경 보정을 위해 선택된 기준점은 주황색입니다. 다운 스트림 분석에서 제외 할 기능은 흰색입니다. ArrayNinja에는 H4K16의 예제와 같이 일치하는 기능을 노란색으로 강조 표시하는 텍스트 기반 검색 기능이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Representative Results

이 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성의 분석을위한 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 설계하고 제조하는데 사용되었습니다. 이 어레이는 핵심 및 변형 히스톤 단백질에서 발견되는 PTM의 많은 조합을 나타내는 300 개 이상의 고유 한 펩타이드 기능 (20-40 잔기 길이) 라이브러리를 조회합니다 38 . 이 파이프 라인은 널리 사용되고 상업적으로 이용 가능한 많은 히스톤 PTM 항체의 스크리닝을위한 작업 원이었으며, 전체 데이터 세트는 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에서 이용할 수 있습니다. 17 세

우리의 파이프 라인의 백본 ArrayNinja, 마이크로 어레이 작업 (28)의 기획 및 분석 단계를 통합 우리가 최근에 개발 된 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램입니다. ArrayNinja 분석 모듈을 통해 사용자는 정보에서 상호 작용할 수 있습니다.raw 배열 이미지 파일을 사용하여 작업을 수행 할 수 있습니다. 인쇄 된 지형지 물 ID는 이미지와 자동으로 통합되며이 정체성은 마우스 커서를 한 지점 위로 가져 가면 나타납니다. 이 통합은 또한 이름순으로 관심 대상 기능을 신속하게 검색하고 다운 스트림 분석에서 기능을 제외 할 수 있습니다. ArrayNinja는 또한 로컬 및 비 로컬 배경 노이즈 보정 옵션뿐만 아니라 스폿 형태에 맞게 조정되는 구성표를 제공합니다. ArrayNinja와 그 기능에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다 28 .

ArrayNinja는 각 펩티드 피처의 신호 강도를 계산하고 해당 쉐도우를 피처 아이덴티티를 기반으로 오류가있는 평균으로 집계합니다. 원시 및 정규화 된 신호 평균이 반환되며 정규화 상수는 가장 밝은 피쳐 평균으로 결정됩니다. 각 펩티드에 대한 신호 강도는 상대 친화도를 비교하는데 사용될 수있다 microarray에 특징 사이 항체의. 여기, 우리는이 시약으로 얻은 결과를 해석 할 때 고려해야하는 에피토프 인식 특성을 강조하면서이 파이프 라인으로 프로파일 링 된 두 개의 항체에 대한 대표적인 데이터 세트를 보여줍니다 ( 그림 5 ).

표적 밖의 인식은 모든 항체에 대한 관심사이며, 수정 가능한 히스톤 잔기를 둘러싼 에피토프의 공통점은 히스톤 PTM 항체에 대한 이러한 특별한 도전이된다. 실제로, 히스톤 H3 (H3K9me3)에있는 tri-methylated lysine 9를 인식하기 위해 제기 된 항체는 H3K18, H3K27 및 리신 20에서 히스톤 H4 (H4K20me3) 또는 H3K9me3 ( 그림 5A )보다 우수한 펩티드에 결합합니다. H3K9 (ARKS)를 둘러싼 서열은 H3K27과 보존되어 있으며, 히스톤 PTM 항체와 이들 부위를 결합하고 변형시키는 염색질 조절 인자의 교차 반응성은 다른 곳에서 주목을 받았다ss = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . 메틸 리신 항체에 공통적으로 관찰되는 또 다른 off-target 인식 특성은 메틸 순서를 구별 할 수 없다는 것이다. 이것은 H3K4me2 및 H3K4me1 펩타이드와 교차 반응하는 H3K4me3 항체로 얻은 결과로 예시됩니다 ( 그림 5B ). 연구 결과 H3K4me3, H3K4me2 및 H3K4me1이 게놈을 통해 다르게 분포되어 있고 다른 방식으로 기능 할 가능성이 있다는 것을 보여 주므로 메틸의 순서를 구별하는 것이 중요합니다 42 , 43 . 예를 들어, H3K4me3은 가장 활발히 전사 된 유전자의 전사 시작 부위에 위치하지만 활성 증강 인자는 일반적으로 H3K4me1 44 로 표시됩니다.

목표 이탈 인식 외에도 긍정적 및 부정적 영향e는 인접한 PTM에 의해 히스톤 항체의 일반적으로 관찰되는 특성이다. 도 5A에 나타낸 H3K9me3 항체는 인접한 라이신 잔기상의 아세틸기에 의해 양의 영향을 받는다. 실제로, 최근 질량 분석 분석은 아세틸 그룹, 특히 H3K14ac가 자주 H3K9me3 (38)와 함께 공동 발생하는 것을 알 수있다. 도 5B에 도시 된 H3K4me3 항체는 트레오닌 6 (H3T6p)에서 인접 인산화에 의해 부정적으로 영향을 받는다. H3T6p 리더 단백질에 의해 인식 H3K4me3 긍정적 및 부정적 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이는 특정 염색질 모집 45, 15 계수 조절에 대한 동적 메커니즘으로서 작용할 수있다.

그림 5
도표 5 : 펩티드 Microarrays에 항체의 분석. 펩티드 마이크로 어레이에 대한 (A) H3K9me3 (항체 # 1) 및 (B) H3K4me3 (항체 # 2) 항체의 분석. 녹색 라인 / 막대는 의도 된 표적 PTM만을 포함하는 펩티드를 나타낸다. 회색 선 / 막대는 모든 펩타이드의 평균 상대 강도를 표적 펩타이드와 비교하는 일원 분산 분석을 사용하여 계산 된 녹색 선 / 막대와 신호 강도가 현저히 다르지 않은 펩타이드를 나타낸다 (p> 0.05). 빨간색 및 파란색 선 / 막대는 녹색 선 / 막대에서 크게 감소하거나 증가하는 신호를 나타냅니다 (p <0.05). 주황색 선 / 막대는 표적 외의 펩타이드를 나타냅니다. 데이터는 H3 및 H4 꼬리의 N- 말단 영역에 걸쳐있는 펩타이드에 대한 PTM 복잡성의 시각적 인 일러스트레이션 (왼쪽)으로 표시되며, 각 라인의 너비는 해당 펩타이드 피처에 대해 측정 된 상대 강도와 일치하고, (오른쪽) 막대 그래프 6 개별 스폿 측정에서 상대적인 신호 강도 평균 ± SEM을 표시microarrays에 ments. 이 분석에 포함 된 모든 펩타이드는 히스톤 H3 아미노산 1 - 20 또는 15 - 34에 해당하는 20 아미노산 길이 입니다.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생물 의학 연구 분야의 항체 신뢰도가 가장 중요합니다 46 , 47 . 이것은 히스톤 PTM의 풍부성과 분포를 특성화하기 위해 개발 된 대부분의 기술에 대한 핵심 도구로서 항체의 위치를 ​​고려할 때 염색질 생화학에서 특히 그렇습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성을 분석하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 최적화 된 파이프 라인을 상세히 설명합니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 히스톤 PTM 항체의 큰 숫자를 선별하는 데 사용되었으며,이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 히스톤 항체 특이성 데이터베이스 (www.histoneantibodies.com) (17)를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다.

우리와 다른 사람들의 연구에서 명백한 것은 histat PTM 항체 행동의 빈번한 사례로서 해석을 복잡하게 할 수 있습니다이들 시약들 ( 12 , 15 , 17)로 생성 된 데이터의 양 따라서 항체 회사의보다 엄격하고 포괄적 인 품질 관리 조치가 필요합니다. Experimentalists 및 epigenome 컨소시엄 리더 ( 예 : ENCODE, BLUEPRINT)는 연구를 위해 시약을 선택할 때 히스톤 PTM 항체에 대한 자체 평가를 엄격하게 제시해야합니다. 또한 배치 간 변동성을 최소화하고 epigenome 매핑 플랫폼에서 검증 된 친 화성 시약의 사용을 표준화하고 대체 친 화성 도구를 개발하는 노력은이 연구 문제를 해결할 수있는 실용적인 항목입니다.

마이크로 어레이는 히스톤 PTM 항체 특이성을 특성화하는데 특히 유용하게 만드는 마이크로 플레이트 기반 분석법 ( 예 : ELISA)에 비해 많은 이점을 가지고 있습니다. Microarrays는 수천 개의 개별 peptide-최소 물질 소비로 항체 상호 작용. 여기에 설명 된 프로토콜에서 각 펩타이드 기능 700 피코 몰로 100 microarray 슬라이드를 생산하는 데 충분합니다. 또한 항체 분석은 1 μg 미만의 항체를 사용하여 완료 할 수 있으며 사용자 정의 배열 형식을 사용하면 여러 항체 및 다양한 항체 희석을 동시에 선별 할 수 있습니다.

마이크로 어레이에서 맞춤형 피쳐 레이아웃을 설계하는 것은 힘든 작업이 될 수 있습니다. 또한, 각각의 새로운 마이크로 어레이 디자인은 새로운 분석 템플릿을 빌드 아웃해야합니다. 우리는 이것이 마이크로 어레이 기술의 완전한 유용성을 실현하는 데 엄청난 어려움이 있음을 발견했습니다. 이 ArrayNinja, 완벽하게 마이크로 어레이 실험 (28)의 설계 및 분석 측면을 통합하는 대화 형, 오픈 소스 소프트웨어 응용 프로그램의 우리의 개발 동기를 부여. ArrayNinja의 디자인 모듈을 사용하면 사용자가 실험에 필요한 레이아웃에 맞게 슬라이드를 대화식으로 디자인 할 수 있습니다. ArrayNinja virt프린터의 로보 모션을 매핑하여이를 주어진 슬라이드 디자인의 소스 플레이트 레이아웃으로 변환합니다 ( 그림 2 ). 사용자 정의 배열 형식을 만드는 것이 이제는 빠르고 일상적인 방법입니다. ArrayNinja의 또 다른 핵심 기능은 마이크로 어레이 작업의 설계 및 분석 단계 간의 연결입니다. 디자인 모듈의 사용자 정의 설정을 통해 ArrayNinja는 스캔 한 마이크로 어레이 이미지에 대화식 그리드를 오버레이하여 사용자가 임의의 기능 위에 마우스를 올려 자신의 신원을 밝히거나 원하는 기능을 검색 할 수있게합니다 ( 그림 4 ).

이 파이프 라인의 몇 가지 중요한 단계는 주목할 가치가 있습니다. 첫째, 인쇄 레이아웃을 설계하는 동안 데이터 수집에서 의미를 얻기 위해 충분한 복제 지점을 포함하는 것을 고려해야합니다. 또한 핀 대 핀 변동성을 고려하여 각 기능은 적어도 두 개의 서로 다른 핀으로 배치되어야합니다. 마지막으로, 아마도 가장 중요한 단계는 물리적 생성이온 소스 플레이트. 이 프로토콜에 설명 된 고밀도 마이크로 어레이의 성공적인 사용은 각 기능의 신원을 최종 슬라이드의 실제 위치에 매핑하는 기능에 달려 있습니다. 이 매핑 작업은 간단하지 않지만 ArrayNinja는 플레이트 맵을 제공하여이 단계를 크게 용이하게합니다. 소스 플레이트를 작성하는 동안이 맵에 편차가 있으면 분석 중에 잘못된 결론이 도출됩니다.

항체 특이성의 분석을 위해 마이크로 어레이를 사용하는 한계를 고려하는 것이 중요합니다. 어레이 캡처 오프 타겟 히스톤 PTM 항체의 성질과 유사한 혼성화 조건과 실험적인 방법으로 해석하는 것으로 입증되었지만 (예, 면역) 17, 18 정도는 항체 특이성 어레이 기반 프로파일 칩 프로토콜 변환되는 암시 14 , 17 하지만더 비판적 평가가 필요하다.

이 파이프 라인의 변형은 이전에 히스톤 독자, 작성자 및 지우개의 분석을 위해 설명되었습니다 23 , 24 . 후성 유전학 연구를 뛰어 넘는이 플랫폼을 수정하면 관심있는 인쇄 가능한 모든 라이브러리에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 펩타이드보다 더 복잡한 물질이 염색질 생화학 연구를위한 마이크로 어레이를 구성하는 데 사용될 수도 있습니다. 예를 들어, 다양한 PTMS를 표시하는 재조합 뉴 클레오는 이제 일상적 48 설정 및 미래 연구의 흥미로운 지역이 될 것입니다이 생리 학적으로 관련 염색질 서브 유닛의 맥락에서 히스톤 PTM 항체의 특이성을 프로파일 링 실험실에서 생성되고있다.

여기에 설명 된 프로토콜에 대한 널리 사용되는 대체 방법은 SPOT 어레이 기술을 사용하여 수백 개의 펩타이드가 직접 cellu에서 합성됩니다멤브레인 지지력을 잃습니다 49 . 그런 다음 멤브레인 자체를 마이크로 어레이 어플리케이션에 사용할 수 있습니다 50 . SPOT 기술은 라이브러리 복잡성 및 합성 비용의 관점에서 유리합니다. 그러나 SPOT 방법을 사용하여 합성 된 펩타이드의 순도는 달라지며 고상 펩타이드 합성 ( 예 : HPLC 및 질량 분광법)에 공통된 품질 관리 및 정제 방법은 일상적으로 수행되지 않습니다 50 , 51 . 또한, 니트로 셀룰로즈상의 펩타이드 제시는 균일하지 않고 항원 결정기를 차폐 할 수있다. 특히 히스톤 펩티드 어레이 플랫폼의 두 가지 유형은 펩타이드를 합성하고 어레이를 제조하는 데 필요한 특수 장비에 대한 액세스 권한이없는 사용자를 위해 상업적으로 이용 가능하다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

이 연구는 반 안델 연구소 (Van Andel Research Institute)와 국립 보건원 (CA181343)에서 SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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