Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Published 8/01/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Dette manuskriptet beskriver metoder for anvendelse av peptidmikroarray-teknologi til spesifisitetsprofilering av antistoffer som gjenkjenner histoner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner.

Cite this Article

Copy Citation

Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) på histonproteiner studeres mye for deres roller i regulering av kromatinstruktur og genuttrykk. Masseproduksjonen og fordelingen av antistoffer som er spesifikke for histon-PTM, har i stor grad tilrettelagt for forskning på disse merkene. Siden histon-PTM-antistoffer er nøkkelreagenser for mange kromatinbiokemiske applikasjoner, er streng analyse av antistoff-spesifisitet nødvendig for nøyaktig dataintolking og fortsatt fremgang i feltet. Denne protokollen beskriver en integrert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for profiling av spesifisitet av histon-antistoffer. Design og analyse aspekter av denne prosedyren er lettet av ArrayNinja, en åpen kildekode og interaktiv programvarepakke vi nylig utviklet for å effektivisere tilpasningen av microarray utskriftsformater. Denne rørledningen har blitt brukt til å skjerme et stort antall kommersielt tilgjengelig og mye brukt histone PTM antibodiesS, og data generert fra disse forsøkene er fritt tilgjengelige gjennom en online og ekspanderende Histone Antibody Specificity Database. Utover histoner kan den generelle metode som beskrives her, anvendes bredt til analysen av PTM-spesifikke antistoffer.

Introduction

Genomisk DNA pakkes elegant inn i eukaryotisk cellekjerne med histonproteiner for å danne kromatin. Den gjentatte underenheten av kromatin er nukleosomet, som består av 147 basepar DNA som er pakket rundt en oktamerisk kjerne av histonproteiner - H2A, H2B, H3 og H4 1 . Kromatin er bredt organisert i løst pakket eukromatin og tett pakket heterochromatin domener. Graden av kromatin-komprimering regulerer i hvilken grad proteinindustrien kan få tilgang til det underliggende DNA for å gjennomføre grunnleggende DNA-templerte prosesser som replikering, transkripsjon og reparasjon.

Nøkkelregulatorer for genometilgjengelighet i forbindelse med kromatin er PTM på de ustrukturerte hale- og kjerneområdene av histonproteiner 2 , 3 . Histone PTMs fungerer direkte ved å påvirke strukturen av kromatin 4 og indirekte gjennomgåendeH rekruttering av leserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser som har kromatin remodeling, enzymatisk og stillas aktiviteter 5 . Studier av histone PTM-funksjon de siste to tiårene tyder overveldende på at disse merkene spiller nøkkelrolle i regulering av cellefell, organisasjonsutvikling og sykdomsinitiering / progresjon. Fueled av fremskritt i massespektrometribasert proteomteknologi, er det funnet mer enn 20 unike histon-PTM på mer enn 80 forskjellige histonrester 6 . Spesielt forekommer disse endringene ofte i kombinasjoner, og i samsvar med "histonkoden" -hypotesen, viser mange studier at leserproteiner er målrettet mot diskrete kromatinegrupper gjennom anerkjennelse av spesifikke kombinasjoner av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utfordring fremover vil være å tilordne funksjoner til grPå grunn av listen over histon PTMer og å bestemme hvordan bestemte kombinasjoner av histon PTMer orkestrerer de dynamiske funksjonene assosiert med kromatin.

Antistoffer er lynchpinreagensene for påvisning av histon PTM. Som sådan har mer enn 1000 histon-PTM-spesifikke antistoffer blitt kommersielt utviklet for bruk i kromatisk biokjemiforskning. Med den raske utviklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, brukes disse reagensene i stor grad av individuelle etterforskere og omfattende epigenomiske "veikart" -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfelling kombinert med neste generasjons sekvensering ) Rørledninger for å generere geografiske kart med høy oppløsning av histon PTM-fordelingsgenom-bred 10 , 11 . Nylige studier har imidlertid vist at spesifisiteten av histon-PTM-antistoffer kan være svært variabel og at disse reagensene viser uferdige Dårlige egenskaper som ikke-mål epitopgjenkjenning, sterk positiv og negativ påvirkning av nabo-PTM, og vanskeligheter med å diskriminere modifikasjonsordren på en bestemt rest ( f.eks . Mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontroll av histon PTM-spesifikke antistoffreagenser nødvendig for å nøyaktig tolke data generert med disse verdifulle reagensene.

Microarray-teknologi gjør det mulig for simultant forhør av tusenvis av makromolekylære interaksjoner i et gjennomgående, reproduserbart og miniatyrisert format. Av denne grunn har en rekke mikroarrayplattformer blitt opprettet for å analysere protein-DNA 19 ,"> 20, protein-protein 21 og protein-peptid-interaksjoner 22. Faktisk har histonpeptidmikroarrays oppstått som en informativ funningsplattform for kromatinbiokjemiforskning, som muliggjør høy gjennomstrømmingsprofilering av forfattere, viskelærer og lesere av histon PTM 15 , 23, 24, og også for analyse av histon-antistoffspesifisitet 17, 25. Utover deres anvendelse i kromatin og epigenetikk forskning, histon peptid-matriser har potensiell anvendelse som et diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sykdommer hvor anti- Kromatin-autoantistoffer blir dannet 26 , 27 .

Her beskriver vi en integrert rørledning som vi har utviklet for å designe, fabrikere og kjøreRydder histonpeptidmikroarrays for å generere spesifisitetsprofiler for antistoffer som gjenkjenner histon og deres PTM. Rørledningen forenkles av ArrayNinja, et interaktivt program for åpen kildekode som vi nylig utviklet, som integrerer design- og analysestadene i mikroarray-eksperimenter 28 . ArrayNinja fungerer best i Google Chrome. Kort fortalt brukes en mikrokrysserskriver med robotkontakt til å deponere et bibliotek med biotinkonjugerte histonpeptider i definerte posisjoner på streptavidin-belagte glassmikroskopriller. Arrays kan da brukes i et konkurransedyktig og parallelt analyseringsformat for å forhøre antistoff-epitop-interaksjoner ( figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundrevis av unike syntetiske peptider som inneholder PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering og serin / treoninfosforylering) alene og i relevante kombinasjoner i stor grad avledet fra proteomiske datasett. Metoder for peptidsyntese og validering Er detaljert andre steder 23 . Data generert fra vår pågående histone PTM antistoff screening innsats utnytte denne array plattformen er arkivert på en offentlig web ressurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Spesielt er histonpeptidmikroarrays fremstilt med variasjoner av denne protokollen blitt brukt i stor utstrekning for å karakterisere aktiviteten til histone PTM-leserdomene 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mer nylig for å profilere histon PTM forfatter og viskelærer 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tegneserievisning av trinnvis prosedyre for antistoff-screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerte histonpeptider som inneholder definerte posttranslasjonelle modifikasjoner (røde og blå sirkler) er medtrykt med biotin-fluorescein på streptavidinbelagt glass. Positive interaksjoner visualiseres som rød fluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installere og kjøre ArrayNinja

  1. Last ned og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org.
  2. Last ned og komprimer ArrayNinja virtuell maskin (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Åpne Virtual Box og legg til ArrayNinja VM ved å klikke 'Maskin', 'Legg til', og velg arrayninja.vbox fra mappen der ArrayNinja VM ble lagret.
  4. Start ArrayNinja ved å velge den i Virtual Box og klikk på den grønne "start" -pilen.
  5. Virtual Box åpner et nytt vindu og viser en melding om at VM kan nås ved å navigere nettleseren til localhost: 2080.60; MERK: En containerisert versjon av ArrayNinja er også tilgjengelig via hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Designe Array Slide og Source Plate Layout

  1. Under overskriften Planlegg et lysbildeoppsett på ArrayNinja-grensesnittet, klikk på koblingen som tilsvarer microarray-skriveren som brukes.
    MERK: ArrayNinja har blitt programmert for å etterligne robotbevegelsen til to vanlige microarray-skrivere (se tabell1). Kompatibilitet med de andre gruppene kan konfigureres på forespørsel.
  2. Klikk inn i dialogboksen 'Legg tallerken', skriv inn «tom», og klikk på «enter». Se figur 2 for et skjermbilde av designmodulen ArrayNinja.
  3. Juster spotdiameteren til 275 μm og spotavstand til 375 μm. Juster de gjenværende innstillingene (Plate Blocks / Plate row, Totalt plate Rows, replikerer, funksjoner i y, Super Arrays, SuperA fudge, se Figur 2 ) for å tilpasse hvordan funksjonene vil vises på microarray-lysbildet.
    MERK: Spotdiameteren bestemmes av størrelsen på microarray-tappen. Når disse innstillingene justeres, oppdateres tegneseriebilde i sanntid. Bruk denne tegneserien til å forhåndsvise hvordan hver innstilling endrer det endelige lysbildet.
  4. Etter at oppsettet av funksjonene på lysbildet er ferdiggjort, mus over hver unike funksjon og skriv inn funksjonsidentifikatoren i popup-dialogboksen.
    MERK: Funksjonsidentifikatorer kan bestå av tall, bokstaver eller kombinasjoner. Dette er kun nødvendig for unike funksjoner, og en dialogboks vises ikke når kopier er valgt.
  5. Etter at alle unike funksjoner har blitt tildelt en identifikator, klikker du på "fyll inn". Skriv inn et navn for lysbildeoppsettet og klikk på "skriv ut tallerkenen din" for å lagre. En ny side åpnes som viser antall 384 brønnkildeplater som trengs for å fremstille det valgte lysbildesignalet og et bord som kartlegger den fysiske plasseringen av hver funksjon som skal lastes inn i kildeplaten / platene.
    MERK: Husk dette navnet, da det blir brukt til å huske dette designet når du analyserer mikroarray data (se avsnitt 6.2). Ved å klikke på "skriv ut tallerkenen din" lagres layoutet i ArrayNinja.

Figur 2
Figur 2: ArrayNinja Design Module. Et skjermbilde av ArrayNinja designmodul er vist i stiplede linjer. Kontrollpanelet (øverst) viser alle parametrene som kan endres på microarray-skriveren. Da disse parametrene justeres, oppdateres tegneseriebildet av lysbildeoppsettet (nederst til venstre) i sanntid. Etter at oppsettet er angitt, kan brukeren musen over individuelle steder for å angi unike funksjonsidentifikatorer. ArrayNinja konstruksjoner fra denne brukeren legger inn et kart over plasseringen av hver funksjon i kildeplaten (e) (nederst til høyre) som trengs for å fremstille en spesifisert microarray lysbildeoppsett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Fremstilling av mikroarrays

  1. Forbereder kildeplaten
    1. Bruk kartet som er generert med ArrayNinja i avsnitt 2.5 for å opprette 384-brønnskildeplaten (e).
      MERK: Detaljert beskrivelse av peptider forespurt på denne plattformen finnes andre stederS = "xref"> 17.
    2. Sett inn 1 - 2 μl av hver funksjon ( f.eks . Biotinylert histonpeptid) i riktig brønn på 384-brønnkildeplaten / platene.
      MERK: Biotinylerte histonpeptider blir vanligvis avsatt fra 200 - 400 uM stamløsninger, som tilsvarer 10 til 25 ganger molært overskudd av peptid til streptavidinbindingssteder i et enkelt utvalgspot. Dette beregnes ved å bruke ligningen:
      ligningen
      Hvor V er volumet levert av en pinne, [ P ] er konsentrasjonen av funksjonen trykt, N A er Avogadros tall, og S er overflaten av et punkt. C er dekning av lysbildet, uttrykt som antall streptavidinmolekyler pr. Arealareal multiplisert med tre (gjennomsnittlig antall tilgjengelige streptavidinbindingssteder). V og C er oppnådd av respektive produsent. Andre funksjoner kanKrever forskjellige konsentrasjoner avhengig av størrelsen på biomolekylen der trengsel kan være en bekymring. Et utvalg av utskriftskonsentrasjoner for hver ny type funksjon bør testes empirisk for å bestemme optimal utskriftskonsentrasjon.
    3. Fortynn hver funksjon 10 ganger med 1x trykkbuffer supplert med 1% bovint serumalbumin (BSA). Spinn kildeplaten (e) ved 500 xg i 2 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Inkluderingen av fluorescein-merket biotin (5 μg / μL) i trykkbufferen anbefales som en spotprotokoll og som et visuelt hjelpemiddel for å muliggjøre riktig justering av matrisen under analysen (se figur 4 ).
  2. Utskriftsprotokoll ( Figur 3A - B ).
    1. Forbered arraderen ved å tømme oppsamlingsbeholderen og fylle oppvaskbeholderbeholderen og luftfukterbeholderen med sterilt destillert vann.
    2. Skriv inn parametrene uSed for å designe lysbildet i ArrayNinja (seksjon 2 og figur 2 ) i microarray skriverens kontrollprogram.
    3. Ved hjelp av microarray-skriverens kontrollprogram, still inn vaskeprosedyren for en 1 s vask med en nedsenkning. Still inn ettervask-innstillingene for å dyppe pinnene 5 ganger etter hver vask. Still inn fuktigheten til 60%.
      MERK: Den optimale vaskekonfigurasjonen kan variere avhengig av mikroarray-skriveren som brukes. Den optimale oppvaskkonfigurasjonen etter vask kan variere avhengig av mikroarray-skriveren som brukes.
    4. Sett inn funksjonaliserte lysbilder ( f.eks . Streptavidinbelagt glass) i substratplaten og legg alle platene inn i platenheisen. Sett kildeplaten (e) inn i plateholderen og sett inn i kildeplaten heisen.
    5. Klikk på 'skriv ut'. Overvåk utskriftsprosessen for noen runder av funksjonen avsetning for å sikre at alle vaske- og dyppinnstillinger er korrekte. Når utskriften er fullført, fjerner duSubstratplaten fra arrayet.
      MERK: Når store utskrifter kjører forbud mot fullføring av blokkeringstrinn innen en dag, kan utskrevne lysbilder inkuberes i et fuktig kammer ved 4 ° C over natten. Inkubér lysbildene ved siden av et lite beger med vann i en pappeske forseglet med plastfolie.
    6. Blokker lysbildene med blokkeringsbufferen i 30 minutter ved romtemperatur ved blanding.
    7. Vask lysbildene 2 x 10 minutter ved romtemperatur i fosfatbuffert saltvann (PBS), pH 7,6 ved blanding. Tørr lysbildene ved å spinne i en mikroarray glidesentrifuge i 30 s ved romtemperatur.
      MERK: For å behandle et stort antall lysbilder på en gang, kan et høyt gjennomstrømmende mikroskop diasekammer brukes, slik at 50 lysbilder kan vaskes parallelt.
    8. For lysbilder som er utformet for å være partisjonert med voks, fortsett til avsnitt 4.1. For alle andre design, lagrer lysbilder ved 4 ° C beskyttet mot lys og fuktighet.
      MERK: Trykte biotinylerte histonpeptiderEr stabile i minst 6 måneder når den lagres på denne måten.

4. Partisjonering Microarray Slides

  1. Hydrofob vokspenn ( figur 3C )
    1. Påfør voks rundt områdene som inneholder funksjoner ved hjelp av en vokspenn. Tillat voks å lufttørke i 5 minutter før du går videre til avsnitt 5.
      MERK: Etter blokkering kan array-punktene være svært vanskelig å visualisere ved øyet. Lysbildesignalet fra ArrayNinja kan skrives ut i skala og brukes som veiledning for påføring av voks.
  2. Silikonpakning ( Figur 3D )
    1. Skal den klare filmen av baksiden av arraypakningen og legg klæbemiddelsiden ned på microarray-lysbildet.
    2. Hold pakningen på plass i 5 s før du går videre til avsnitt 5.
  3. Wax Imprint ( Figur 3E )
    1. For lysbilder som er utformet for å være partisjonert av voks, skriv ut en testglass på vanlig glass ved hjelp av 10% BSA. Bruk denne testruten for å optimalisere voksimprinterførerne eller arrayinnstillingene for å sikre at alle funksjonene kommer til å være innenfor voksformkamrene.
    2. Varm mikroarray voksimprinteren til 85 ° C til hele voksen er fullstendig smeltet, ca. 30 min.
    3. Sett inn lysbildet med den utskrevne siden vendt ned og skyv glideren helt til høyre på mikroarray-imprinteren. Trekk opp spaken for å bringe støpeformen i kontakt med overflaten av lysbildet. Hold i 2 s.
      MERK: Holdetiden kan endres for å oppnå optimal voksgrense tykkelse.
    4. Fjern raskt lysbildet og visuelt inspiser voksgrensene for å sikre at alle brønner er vedlagt og at grensene ikke er så tykke at de går inn i flekkene. Oppbevar glidebryter ved 4 ° C beskyttet mot fukt og lys.
      MERK: Holdetiden kan økes eller reduseres for å få tykkere eller tynnere grenser.

"Figur Figur 3: Microarray Fabrication. (A) Histonpeptid-mikroarray-fremstilling på streptavidin-belagte mikroskop-lysbilder ved hjelp av en mikroarray-skriver. (B) Microarrays produsert med 3 subarrays av et 48 x 48 gitter med peptidfunksjoner. Separasjon av (C) 3 subarrays med en hydrofob vokspenn, (D) 2 subarrays med et silikon lim og (E) 48 subarrays med et vokstrykk. Alle viste mikroarrayer er fremstilt ved hjelp av 25 x 75 mm mikroskopdyser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Hybridisering av en histon PTM-antistoff med en peptidmikroarray

  1. Forbered hybridiseringsbuffer (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
  2. Equilibrere lysbildet i hybridiseringsbufferenVed hjelp av et hybridiseringsbeholder. Helt dekke hele lysbildet i hybridiseringsbufferen og inkuber i 30 minutter ved 4 ° C på en omløpshaksler med lav hastighet.
  3. Klargjør en oppløsning inneholdende fortynnet histon PTM antistoff i hybridiseringsbuffer.
    MERK: I eksempeldataene ble både histone Antibody # 1 og Antibody # 2 fortynnet 1: 1000 i hybridiseringsbuffer. Et fortynningsområde som ligner det som brukes for immunoblotting, anbefales som utgangspunkt.
  4. Inkubér matrisen med antistoffoppløsningen i 1 time ved 4 ° C. Fjern antistoffoppløsningen og vask oppsettet 3 ganger i 5 minutter ved 4 ° C med kaldt PBS, pH 7,6.
  5. Forbered en 1: 5000 - 1: 10.000 fortynning av fluorescerende fargekonjugert sekundært antistoff i hybridiseringsbuffer.
  6. Inkubér matrisen med sekundær antistoffoppløsning i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mot lys. Fjern den sekundære antistoffoppløsningen og vask mikroarray glideren 3 ganger i 5 minutter ved 4 ° C med PBS, pH 7,6. DyppeMikroarrayet i et 50 ml konisk rør inneholdende 0,1 x PBS, pH 7,6 for å fjerne overflødig salt ved romtemperatur. Tør lysbildet i en mikroarray glidesentrifuge ved romtemperatur.
  7. Skann lysbildet med en microarray-skanner med 25 μm oppløsning eller høyere, etter Microarray-skannerprodusentens anbefalte skanningsprotokoll.
    MERK: Hvis fluorescein-merket biotin-spor er tilstede, skann både den grønne kanalen (f.eks .: 488 nm, em: 509 nm) og kanalen som tilsvarer det fluorescerende fargekonjugerte sekundære antistoffet, typisk rødt (eks: 635 nm, em : 677 nm). Målet med skanning er å skaffe enkeltsidige .tif-filer som kan slås sammen til en enkelt .png-fil (som beskrevet i avsnitt 6.1).

6. Analyse av Microarray Data ved hjelp av ArrayNinja

  1. Forbereder et flettet microarray-bilde
    MERK: Målet med denne delen er å opprette en .png-bildefil som fusjonerer de to enkeltkanal-tif-filene (oppnådd i seksjon 5). DetteEr det eneste bildformatet kompatibelt med ArrayNinja-analysemodulen. Følgende instruksjoner representerer en mulig måte å oppnå en sammenslåd bildefil på. Imidlertid finnes andre løsninger ( f.eks . Freeware ImageJ).
    1. Fra kommandolinjen i en bash-terminal på en datamaskin med freeware ImageMagick installert, naviger til mappen som inneholder enkeltkanal .tif-filene og kopier / lim inn følgende trinn, og trykk 'enter' mellom hvert trinn (6.1.4 - 6.1 0,7).
      MERK: Filnavn med store bokstaver ( f.eks . RED_CHANNEL) skal erstattes med filnavnet på microarray-bildene.
    2. Om nødvendig må du først reversere bildene ved hjelp av kommandoen 'konverter INPUT.tif-negate OUTPUT.tif'. Dette kreves hvis skanneren sparer .tif-filer med signalet i hvitt og bakgrunn i svart.
      1. Konvertere -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal GB -evaluere sett 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. convEr - dybde 16 CONTROL_CHANNEL.TIF - klone 0 - kanal RB - evaluere sett 0 - delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. Konvertere -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal RG -evaluere sett 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. Konvertere out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png.
        MERK: En fil med navnet 'merged.png' vil bli lagret i samme mappe som de originale .tif-filene.
  2. Kvantifisere data ved hjelp av ArrayNinja
    1. Åpne ArrayNinja og klikk på den riktige microarray-skriverkoblingen under "Slik kvantifiserer du bilder som har en kjent kildeplate." Skriv navnet på det lagrede lysbildesignalet (trinn 2.5) i dialogboksen "lasteplate" og klikk "enter". Se Figur 4 for et skjermbilde av ArrayNinja-analysemodulen.
    2. Klikk 'Velg fil' og naviger til og velg filen 'merged.png' opprettet i seksjon 6.1. Den fusjonerte forestillingenE vil laste så vel som et rutenett for lysbildeoppsettet.
    3. Bruk glidebrytene nederst på ArrayNinja-kontrollpanelet for å justere kontrasten, lysstyrken og midtpunktet.
      MERK: Disse justeringene er kun for visualiseringsformål og har ingen innvirkning på kvantifisering.
    4. Velg "oppløsning" og skriv inn verdien som samsvarer med oppløsningen til det skannede bildet. Bruk "marginsiden" og "margen topp" for å flytte rutenettet til justering med flekkene på matrisen. Juster etter behov for å få rutenettet så tett justert over hvert sted som mulig.
    5. Klikk på "Spot Seek" og vent til knappen vender tilbake til den opprinnelige grå fargen.
      MERK: Dette kan gjentas flere ganger for å sentrere rutenettene på enkelte punkter. Søke-funksjonen slapper av rutenettet mot hvert sted for å finjustere justeringen.
    6. Endre "Super Arrays" -verdien til "1" for å opparbeide hvert underarraypanel individuelt (hvis ønskelig). Hvis du bruker en 4X 12 wax imprint slide layout ( Figur 3E ), bruk "iPin" "jPin" og "subA" kontrollene for å slå av funksjoner for å analysere ønsket kombinasjon av 4 x 12 brønner. For eksempel, for å analysere de øverste venstre og øverste høyre brønner som replikater av hverandre, skriv inn «1 4» i iPin, «1 1» til jPin og «1 4» i subA. Trykk enter'.
    7. Hold musen over individuelle punkter for å vise identiteten til den aktuelle funksjonen.
    8. Klikk på "Veksle zoom" for å vurdere funksjonene mer nøye. Velg bakgrunnsreferansepunkter ved å trykke på 'R' -tasten mens musen er over et punkt. Referansepunkter vil bli uthevet i oransje.
      MERK: I forstørrelseszoommodus vises et forstørret bilde av funksjonen som musen er over, i øvre høyre hjørne. En detaljert diskusjon av ytterligere bakgrunnskorrigeringsfunksjoner i ArrayNinja diskuteres andre steder 28 .
    9. Slå av flekker (med variert spotmorfologi eller rusk som vil påvirke nøyaktig kvantifisering) ved å trykke på 'A' -tasten mens du svinger musen over de berørte punktene. Inaktiverte flekker blir hvite.
    10. Klikk på "Fyll" etterfulgt av "Send" for å kvantifisere flekkene.
      MERK: En ny fane åpnes og viser en linjediagram over data normalisert til det lyseste punktgjenomsnittet. Et bord under strekediagrammet inneholder både de normaliserte og rå dataverdiene. Denne tabellen kan kopieres til et regneark for arkivering og videre analyse.

Figur 4
Figur 4: Analysemodul ArrayNinja. Et skjermbilde av analysemodulen ArrayNinja vises. Kontrollpanelet (øverst til venstre) viser alle parametrene som kan justeres for å visualisere arrayet, finne flekker og justere et rutenett overArray image. Hovering musen over en funksjon viser en innzoom-visning (øverst til høyre) og viser en popup som inneholder identifikasjonsinformasjonen knyttet til den aktuelle funksjonen (nederst). Referanseplasser valgt for bakgrunnskorrigering er oransje. Funksjoner som skal utelukkes fra nedstrømsanalyse er hvite. ArrayNinja inneholder en tekstbasert søkefunksjon som fremhever matchende funksjoner i gul, som vist i eksempelet for H4K16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen har blitt brukt til å designe og fremstille en peptidmikroarrayplattform for analyse av histon PTM antistoff-spesifisitet. Oppstillingen spør etter et bibliotek med mer enn 300 unike peptidfunksjoner (20 - 40 rester i lengden) som representerer mange av de kjente kombinasjonene av PTM som finnes på kjerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledningen har vært en arbeidshest for screening av mange brukte og kommersielt tilgjengelige histon PTM antistoffer, og fulle datasett er tilgjengelig på Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). 17

Ryggraden i rørledningen vår er ArrayNinja, et åpen programvareprogram som vi nylig utviklet, som integrerer planleggings- og analysestadene i microarray-arbeidet 28 . ArrayNinja analysemodul lar brukerne samhandle i informaTive måter med deres raw array bildefil. De trykte funksjonidentitetene blir automatisk integrert med bildet, og disse identitetene kan bli avslørt ved å holde musemarkøren over et punkt. Denne integrasjonen muliggjør også rask søking etter funksjoner av interesse ved navn og utelukkelse av funksjoner fra nedstrømsanalyse. ArrayNinja gir også muligheter for lokal og ikke-lokal bakgrunnsstøykorreksjon, samt en korreksjonsplan som tilpasser seg morfologi. Fullstendig informasjon om ArrayNinja og dens evner finnes andre steder 28 .

ArrayNinja beregner signalintensiteter for hver peptidfunksjon og aggregerer disse intensitetene i gjennomsnitt med feil basert på funksjonsidentitet. Rå og normaliserte signal gjennomsnitt returneres, hvor normaliseringskonstanten bestemmes av det lyseste funksjonen gjennomsnittet. Signalintensiteten for hvert peptid kan brukes for å sammenligne den relative affiniteten Av antistoffet mellom egenskaper på microarray. Her viser vi representative datasett for to antistoffer profilert med denne rørledningen, og markerer epitopgenkjenningsegenskaper som bør vurderes ved tolkning av resultater oppnådd med disse reagensene ( figur 5 ).

Off-target-anerkjennelse er en bekymring for alle antistoffer, og fellesheter i epitoper rundt modifiserbare histonrester gjør dette til en spesiell utfordring for histon PTM-antistoffer. Faktisk binder et antistoff oppløst for å identifisere trimetylert lysin 9 på histon H3 (H3K9me3) peptider trimetylert ved H3K18, H3K27 og lysin 20 på histone H4 (H4K20me3) så vel eller bedre enn H3K9me3 ( Figur 5A ). Sekvensen som omgir H3K9 (ARKS) konserveres med H3K27, og kryssreaktivitet av histon PTM-antistoffer og kromatinregulatorer som binder og modifiserer disse stedene, er blitt notert andre stederSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . En annen observert off-target-anerkjennelse egenskap som er vanlig for metyl-lysin antistoffer er en manglende evne til å diskriminere metyl rekkefølge. Dette eksemplifiseres av resultater oppnådd med et H3K4me3 antistoff, som kryssreagerer med H3K4me2 og H3K4me1 peptider ( Figur 5B ). Det er viktig å skille mellom metylordren, da studier har vist at H3K4me3, H3K4me2 og H3K4me1 er fordelt forskjellig over genomet og sannsynligvis fungere på forskjellige måter 42 , 43 . For eksempel er H3K4me3 lokalisert på transkripsjonsstartstedene for de mest aktivt transkriberte gener, mens aktive forsterkere er vanligvis merket av H3K4me1 44 .

I tillegg til off-target-anerkjennelse, positiv og negativ påvirkningE av nabo-PTM er en vanlig observert egenskap av histon-antistoffer. H3K9me3-antistoffet vist i figur 5A påvirkes positivt av acetylgrupper på nabo-lysinrester. Faktisk viser nylig massespektrometrianalyse at acetylgrupper, spesielt H3K14ac, ofte forekommer med H3K9me3 38 . H3K4me3-antistoffet vist i figur 5B påvirkes negativt av nærliggende fosforylering ved treonin 6 (H3T6p). H3T6p er kjent for å ha både positiv og negativ innvirkning på anerkjennelsen av H3K4me3 av leserproteiner, og dette kan fungere som en dynamisk mekanisme for å regulere rekruttering av spesifikke kromatinfaktorer 15 , 45 .

Figur 5
Figur 5: Analyse av antistoffer på peptidmikroarrays. Analyse av (A) H3K9me3 (Antistof nr. 1) og (B) H3K4me3 (Antistof nr. 2) antistoffer på peptidmikroarrays. Grønne linjer / barer indikerer at peptidet bare inneholder det tilsiktede mål-PTM. Grå linjer / barer indikerer peptider hvis signalintensitet ikke er signifikant forskjellig (p> 0,05) fra den grønne linjen / linjen, beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA som sammenligner middel relativ intensitet for alle peptider til målpeptidet. Røde og blå linjer / barer indikerer signal som er signifikant redusert eller økt (p <0,05) fra henholdsvis den grønne linjen / linjen. Oransje linjer / barer indikerer off-target peptider. Data vises som (venstre) en visuell illustrasjon av PTM-kompleksitet på peptider som spenner over N-terminale regioner i H3- og H4-haler, hvor bredden på hver linje tilsvarer den relative intensiteten målt for den peptidfunksjonen og (høyre) bargrafer Viser relativ signal intensitet gjennomsnitt ± SEM fra 6 individuelle spotmålOm mikroarrays. Alle peptider som inngår i denne analysen er 20 aminosyrer i lengden som tilsvarer enten histon H3-aminosyrer 1 - 20 eller 15 - 34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antistoffets pålitelighet i biomedisinske søknader er viktigst 46 , 47 . Dette gjelder spesielt i kromatinbiokjemi gitt antistoffposisjon som nøkkelverktøy for flertallet av teknikker utviklet for å karakterisere overflaten og fordelingen av histon PTM. Protokollen presenterte her detaljer en optimalisert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for å analysere histon PTM antistoff spesifisitet. Denne rørledningen har blitt brukt til å skjerme et stort antall kommersielt tilgjengelige og utbredte histon PTM antistoffer, og data generert fra disse forsøkene er fritt tilgjengelige gjennom en online og ekspanderende Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) 17 .

Tilsynelatende fra vårt og andres arbeid er hyppige forekomster av ugunstig histon PTM antistoff atferd som kan komplisere tolkningenIon av data generert med disse reagensene 12 , 15 , 17 . Strenge og omfattende kvalitetssikringsforanstaltninger fra antistofffirmaer er derfor berettiget. Eksperimentelle og epigenomiske konsortieledere ( f.eks . ENCODE, BLUEPRINT) må også vise strenghet i sin egen vurdering av histon PTM-antistoffer når de velger et reagens for studien. I tillegg arbeider arbeidet med å minimere batch-to-batch variabilitet, standardisere bruken av sterkt validerte affinitetsreagenser over epigenom kartleggingsplattformer, og utvikle alternative affinitetsverktøy er alle handlingsmuligheter for å løse dette forskningsproblemet.

Mikroarrays har en rekke fordeler over mikroplatebaserte analyser ( f.eks . ELISA) som gjør dem spesielt nyttige for å karakterisere histon PTM antistoff-spesifisitet. Mikroarrays muliggjør parallell og konkurransedyktig analyse av tusenvis av individuelle peptid-Antistoffinteraksjoner med minimal materialforbruk. I protokollen beskrevet her er 700 pikomoler av hver peptidfunksjon tilstrekkelig til å produsere 100 mikroarray-lysbilder. I tillegg kan antistoffanalyse bli fullført ved bruk av mindre enn 1 ug antistoff, og tilpassede arrayformater tillater at flere antistoffer og forskjellige antistoff-fortynninger blir screenet parallelt.

Å designe tilpassede funksjonalarmer på mikroarrays kan være en mektig oppgave. I tillegg krever hver ny microarray-design utbygging av en ny analysemal. Vi fant dette for å være uoverkommelig for å realisere det fulde nyttet av microarray teknologi. Dette motiverte vår utvikling av ArrayNinja, et interaktivt, åpen kildekode program som sømløst integrerer design og analyse aspekter av microarray eksperimenter 28 . Designmodulen til ArrayNinja lar brukeren interaktivt designe et lysbilde for å passe oppsettet som kreves for et eksperiment. ArrayNinja respekterteUally kart robotens bevegelse av skriveren og oversetter dette til kildeplateoppsettet for en gitt lysdesign ( figur 2 ). Å lage tilpassede arrayformater er nå en rask og rutinemessig praksis. Et annet viktig trekk ved ArrayNinja er sammenhengen mellom design og analyse trinnene i microarray arbeid. Med brukerdefinerte innstillinger fra designmodulen overlegger ArrayNinja et interaktivt rutenett på et skannet microarray-bilde, slik at brukeren kan musen over en hvilken som helst funksjon for å avsløre sin identitet eller søke etter funksjoner av interesse ( figur 4 ).

Flere kritiske trinn i denne rørledningen er verdt å merke seg. Først, når du utformer utskriftsoppsettet, bør det tas hensyn til å inkludere nok gjengitte flekker for å oppnå betydning ved datainnsamling. I tillegg skal hver funksjon avsettes av minst to forskjellige pinner for å kunne regne for variasjoner fra pin til pin. Til slutt er kanskje det mest kritiske trinnet den fysiske generatenIon av kildeplaten. Vellykket bruk av mikrograder med høy tetthet beskrevet i denne protokollen er basert på evnen til å kartlegge identiteten til hver funksjon til deres fysiske plassering på det endelige lysbildet. Denne kartleggingsoppgaven er ikke triviell, men ArrayNinja gjør dette trinnet lettere ved å gi et platekort. Eventuelle avvik i dette kartet mens du oppretter kildeplatene, vil føre til feil konklusjoner under analysen.

Det er viktig å vurdere begrensningene ved bruk av mikroarrays for analyse av antistoff-spesifisitet. Selv om off-target-histon-PTM-antistoffegenskaper som er fanget på matrisen, har blitt påvist å oversette til eksperimentelle tilnærminger med lignende hybridiseringsbetingelser ( f.eks . Immunoblot) 17 , 18 , i hvilken grad arraybasert profilering av antistoff-spesifisitet oversetter til ChIP-protokoller, er suggestiv 14 , 17 men waRangerer mer kritisk vurdering.

Variasjoner i denne rørledningen er tidligere beskrevet for analyse av histon-lesere, forfattere og viskelærer 23 , 24 . Endring av denne plattformen for verktøy utover epigenetikkforskning kan lett tilpasses for ethvert trykt bibliotek av interesse. Det er også mulig at materiale som er mer komplekst enn peptider kan brukes til å konstruere mikroarrays for kromatisk biokjemiforskning. For eksempel genereres rekombinante nukleosomer som viser forskjellige PTM, rutinemessig i laboratorieinnstillingen 48, og profilering av spesifisiteten av histon-PTM-antistoffer i sammenheng med denne fysiologisk relevante kromatin-underenheten vil være et spennende område for fremtidig studie.

En mye brukt alternativ tilnærming til protokollen beskrevet her benytter SPOT-array-teknologi, hvor hundrevis av peptider syntetiseres direkte på en celluMiste membranstøtte 49 . Selve membranen kan da brukes til mikroarray applikasjoner 50 . SPOT-teknologi er fordelaktig ut fra bibliotekets kompleksitet og syntesekostnad. Renheten av peptider syntetisert ved hjelp av SPOT-metoden har imidlertid blitt rapportert å variere, og kvalitetskontroll og rensingstiltak som er felles for fastfase-peptidsyntese ( f.eks . HPLC og massespektrometri) utføres ikke rutinemessig 50 , 51 . I tillegg er peptidpresentasjon på nitrocellulose ikke ensartet og kan beskytte epitoper. Spesielt er begge typer histonpeptid-arrayplattformer tilgjengelig kommersielt for brukere som ikke har tilgang til spesialutstyret som trengs for å syntetisere peptider og fabricate-arrayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble delvis støttet av Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30, (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839, (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311, (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19, (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159, (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19, (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40, (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167, (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6, (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21, (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59, (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4, (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33, (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11, (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18, (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4, (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49, (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27, (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6, (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6, (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7, (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16, (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87, (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24, (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276, (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21, (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17, (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30, (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21, (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6, (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521, (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518, (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11, (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48, (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats