Hyperlens 综合显微镜和超分辨率成像的演示

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Engineering

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Summary

hyperlens 的应用是一种新型的超分辨率成像技术, 由于其在 real-time 成像中的优越性和常规光学的简单实现。在这里, 我们提出了一个描述球面 hyperlens 的制作和成像应用的协议。

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Lee, D., Kim, M., So, S., Kim, I., Yoon, G., Kim, K., Rho, J. Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging. J. Vis. Exp. (127), e55968, doi:10.3791/55968 (2017).

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Abstract

利用超分辨率成像克服传统显微镜的衍射极限, 引起了生物学和纳米技术研究人员的兴趣。虽然近场扫描显微镜和 superlenses 改善了近场区域的分辨率, 但远场成像在 real-time 仍然是一个重大挑战。最近, 将倏逝波放大并转化为传播波的 hyperlens, 已经成为远场成像的一种新方法。在这里, 我们报告的制造一个球形 hyperlens 由交替银 (银) 和氧化钛 (2) 薄层组成。与传统的圆柱形 hyperlens 不同, 球面 hyperlens 允许 two-dimensional 放大。因此, 纳入常规显微镜是直接的。提出了一种新的与 hyperlens 集成的光学系统, 使得在远场区域能实时获得波长图像。在本研究中, 详细说明了制作和成像的设置方法。这项工作还描述了 hyperlens 的可及性, 以及 real-time 成像在活细胞中的实际应用, 这可能导致生物学和纳米技术的革命。

Introduction

在活细胞中观察生物分子的愿望导致了显微镜的发明, 显微镜的问世在过去的几个世纪里传播了生物学、病理学和材料科学等各个领域的革命。然而, 进一步的研究进展受到了衍射的限制, 这限制了常规显微镜的分辨率约为波长的一半1。因此, 克服衍射极限的超分辨率成像是近几十年来的一个有趣的研究领域。

由于衍射极限是由于倏逝波的损失, 其中包含波长信息的对象, 早期研究已经进行, 以保持倏逝波消失或恢复他们2,3。为了克服衍射极限的努力, 首次报道了近场扫描光学显微镜, 它收集的倏逝场在接近对象之前, 它被驱散2。然而, 由于扫描整个图像区域和重建需要很长的时间, 它不能用于 real-time 成像。虽然另一种基于 "透镜" 的方法, 它放大了倏逝波, 提供了 real-time 成像的可能性, 但波长成像只能在近场区域中进行, 无法远远超过对象4,5,6,7

最近, hyperlens 已成为一种新的方法来 real-time 远场光学成像8,9,10,11,12。hyperlens 是由高各向异性双曲型材料13组成的, 它具有平坦的双曲色散, 因此它支持具有相同相速度的高空间信息。此外, 由于动量守恒定律, 高横向波随着波通过圆柱形几何而逐渐压缩。这种放大的信息可以通过远场区域的传统显微镜来检测。这对于 real-time 远场成像是特别重要的, 因为它不需要任何定点扫描或图像重建。此外, hyperlens 可以用于除成像以外的其他应用, 包括纳米。由于反对称141516, 通过反向方向的 hyperlens 的光线将聚焦到 sub-diffraction 区域。

在这里, 我们报告的球状 hyperlens, 放大 two-dimensional 信息在可见光的频率。与传统的圆柱形几何不同, 球形 hyperlens 在两个侧面尺寸中放大物体, 从而促进实际的成像应用。详细介绍了 hyperlens 的制作方法和成像装置, 并对高质量的 hyperlens 进行了详细的再现。为了证明它的 super-resolving 力, 波长的物体被刻在 hyperlens 上。证实了被 hyperlens 的小特征被放大。因此, 在远场区域中实时地得到了清晰解析的图像。这种新型的球形 hyperlens, 其易于与传统的显微镜结合, 提供了实际的成像应用的可能性, 导致了一个新的时代, 生物学, 病理学和一般纳米。

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Protocol

1. 基板制备

  1. 获得高度精炼的石英晶片。对于在这里报告的制造, 使用500和 #181; m 厚度的硅片.
  2. 自旋涂层石英晶圆片与正光刻胶在 2000 rpm 和烘烤六十年代在90和 #176; C.
    注: 正光刻胶层涂层, 以防止在随后的切割步骤损害.
  3. 使用划片机将光刻胶切成小块 20 x 20 mm 2 大小.
  4. 用压缩的氮气枪吹掉切割步骤产生的微粒.
  5. 在去 (DI) 水中的超声波浴中放置5分钟, 在45和 #176; c. 用丙酮超声波浴去除光刻胶层5分钟, 在45和 #176; c. 用两个超声波浴, 丙酮和异丙醇清洁基板, 每在5分钟45和 #176; C.
  6. 用压缩的氮气枪将基体干燥.

2。蚀刻掩码图案

  1. 将清洁的石英衬底装入真空电子束蒸发系统。确保基板旋转已启用.
  2. 沉积率为2和 #197 的铬层;/s.
    注: 在蚀刻掩模上应放置至少100纳米厚度的层, 以防止由沉积物制成的针孔.
  3. 按下排气口按钮以释放腔室, 并使用导电铜带将样品安装在聚焦离子束 (纤维蛋白原) 支架上.
  4. 将心室支架装入心室室.
  5. 关闭会议厅门并按下泵按钮以疏散会议厅.
  6. 选择和 #34; 横梁和 #34; 在光束控制卡舌下, 将离子束电流 (7.7 pA) 和加速度电压 (30 伏) 设置为心室模式.
  7. 打开离子束系统.
  8. 选择和 #34; 横梁和 #34; 在 "光束控制" 选项卡下打开电子束, 并使用 "低放大率" 软件聚焦图像.
  9. 在扫描电子显微镜 (SEM) 模式下的导航标签下设置工作距离 (WD) 4 毫米.
  10. 将支架的倾斜角度设置为52和 #176; 在孔阵列掩模制作前, 以不同放大的扫描电镜图像.
  11. 在 "图案" 选项卡下, 选择图案区域并在铬层上制作一个 50 nm 孔阵列.
    注意: 在 "模式" 选项卡下可以访问简单的模式工具。通过导入位图或生成脚本, 可以实现更复杂的几何和曝光控制.
  12. 完成后, 关闭电子束和离子束系统, 冷却系统.
  13. 按下排气口按钮, 用氮气将燃烧室排出。把持有者带出会议厅.
  14. 关闭会议厅门并按下泵按钮以疏散会议厅.

3。湿法蚀刻工艺和去除掩膜层

  1. 将图案基板放入1:10 缓冲氧化物蚀刻中 5 min.
    注: 石英是有选择和各向同性湿蚀刻的蚀刻和形成一个球形的形状。所用蚀刻掩模可获得透镜的形状, 其直径由蚀刻时间精确控制。一个更好的球形形状可以形成一个较小的图案直径。1.5 和 #181; m 直径半球可在5分钟内获得.
  2. 将图案衬底放入 DI 水中以清洗缓冲氧化物蚀刻 (5 分钟, 2 次).
    注: 缓冲氧化物蚀刻可能是危险的, 所以使用此蚀刻时要小心.
  3. 用压缩氮气干燥样品.
  4. 将图案衬底放入 CR-7 铬蚀刻中以除去铬面膜层.
    注: 除去铬层后, 可获得直径为1.5 和 #181 的球形衬底.
  5. 将图案基片放入 DI 水中以进行清洁 (5 分钟).

4。多层沉积和纳米物体的题字

注意: 在球面石英衬底上放置一对层。在这里, Ag 和 2 被用作沉积材料。Ag 和 2 在厚度为 15 nm 的情况下交替沉积.

  1. 按下电子束蒸发系统的排气按钮, 然后等待通风口结束.
  2. 将图案的基板装入真空电子束蒸发系统后的排气口.
  3. 关闭会议厅门并将真空度疏散到 10 -7 乇通过按下泵按钮.
    注: 真空状态应保持在 10 -7 乇, 以减少表面粗糙度的散射.
  4. 将1和 #197 的增长率存入银层, 并沉积15纳米厚的银层.
  5. 在 Ag 层的沉积之后, 冷却基体为 5 min.
  6. 改变电子束蒸发系统的口袋, 选择另一个坩埚, 并存放在 2 层的增长率为1和 #197;/s. 存入 15 nm 厚的包 2 层.
    注: 在沉积过程中, 薄膜的生长速率保持在较低的水平, 以维持表面粗糙度的均匀性.
  7. 在沉积后的 "2" 层, 冷却基板为5分钟.
  8. 重复步骤 4.4-4.7, 为数十个周期存入一个多层 Ag 和. 2 .
    注意: 在这一点上, hyperlens 的制作已经结束。下一步是为测试 hyperlens 成像能力而制作任意 sub-diffraction 限制的功能。纳米孔和狭缝是由纤维蛋白原铣削.
  9. 改变电子束蒸发系统的口袋, 并将铬层沉积在50纳米的厚度上.
  10. 铬层沉积后, 关闭电子束蒸发系统。按下排气按钮, 通过引入氮气来排出腔室.
  11. 在通风口后, 打开舱门, 将支架带出会议厅。脱下制作的 hyperlens 装置.
  12. 关闭会议厅门并按下泵按钮以疏散会议厅.
  13. 根据制造商和 #39 的说明, 将含铬的 hyperlens 装入到 "纤维蛋白原" 铣削系统和图案的纳米结构中.

5。设置成像系统和成像过程

  1. 将常规传输型光学显微镜放在光学表上.
    注: 在这里, 用倒置光学显微镜作为主体.
  2. 使用适配器将白光光源连接到显微镜照明路径.
  3. 放置一个以 410 nm 为中心的光学带通滤波器.
    注: 带通滤波器有选择地穿透特定波长的光;在这里, 410 nm 光照亮了样品。由 Ag 和 2 组成的 hyperlens 具有 410 nm 波长的高性能。仿真结果 ( 图 2c ) 显示了 hyperlens 的性能, 它满足了 410 nm 光下的双曲色散关系.
  4. 选择一个高倍油浸物镜。使用高质量的 CCD 摄像机获取图像.
    注意: 这个光学设置只是把禁令dpass 过滤到光照明路径, 以排序出 410 nm 波长光。在不使用白光的情况下, 可以在样品上照射特定波长的光, 但在普通的实验室中, 光学显微镜可以通过亮场或荧光成像来观察样品的白光源.
  5. 在物镜上放置一滴浸入式油。在采样阶段放置一个 hyperlens 并捕获图像.
    注: 在 hyperlens 的内表面上刻有纳米级的物体可以用410纳米光照亮。随着 hyperlens, 纳米级的物体将被放大并被物镜捕捉, 并被 CCD 摄像机所成像.

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Representative Results

hyperlens 装置解决 sub-diffraction 特性的能力依赖于其均匀性和高质量的制造。在这里, 一个 hyperlens 是由一个多层的 Ag 和总2交替存入。图 2a显示了制作精良的 hyperlens17的 SEM 图像。横断面图像显示, 在半球石英衬底上沉积有均匀厚度的 Ag 和 Ti3O5薄膜的多层膜。最终 hyperlens 结构的表面粗糙度小于 1.5 nm 的根均方根 (rm s)。

我们使用了2 , 而不是 Ti3O5作为一个介质, 因为这两种材料, 有高折射率超过 2, 产生有效的双曲色散当堆叠与银。如协议中所述, 由 ag 和 hyperlens 组成的2在 410 nm 上具有很好的性能, 因为堆积的多层 ag 和多层2的色散关系具有双曲色散曲线, 如下所示图2b.原则上, 具有高空间波分量的波可以沿着 hyperlens 的径向方向在这样的双曲介质中传播。换言之, 具有高频分量的小特征, 传统光学无法捕捉, 可以通过 hyperlens 传播到远场。图 2c使用有限元 (FEM) 模拟工具显示了 hyperlens 中的模拟场分布。仿真模型的设计、材料性能和所述的纳米结构与所制备的 hyperlens 具有相同的特性。直径 50 nm 的两个孔被刻在铬层上, 距离为 150 nm。hyperlens 的顶部由 410 nm 光照亮, hyperlens 中的光包含对象的放大图像, 其中放大倍数由内半径和 hyperlens 的外半径之间的比值来确定。sub-diffraction 有限的物体的放大图像可以被传统的物镜捕捉和成像。

通过一个简单的光学系统对 hyperlens 的衍射-无限图像进行测量。图 3a显示了 hyperlens 成像系统的示意图。传统的显微镜可以作为大型机使用, 稍有不同。照明路径是传输类型, 白光光源放置有适当的带通滤波器。照明灯由冷凝器或聚焦透镜收集并传送到目标平面。样品放在 hyperlens 成像系统的 hyperlens 的内表面, 而样品则放在传统光学显微镜的滑动玻璃上。hyperlens 中的对象被照亮, 然后图像通过 hyperlens 传播。最后, 用物镜和 CCD 相机捕捉图像。hyperlens 实现的光学系统显示在图 3b中。通过简单的附加组件, 如源和滤波器, hyperlens 可以很容易地在传统的显微镜系统中实现。

通过 hyperlens 捕获的真实图像显示在图 4中。图 4a 4d描述了波长结构的两组 SEM 图像, 由 hyperlens 的铬层中的一个孔和线组成。空白大小是从 160-180 毫微米在每个案件。在传统的显微镜下, 这些 sub-diffraction 结构不能解决, 因为到衍射极限。另一方面, 小的特点是明确解决与 hyperlens。图 4b和 4e使用 hyperlens-based 系统显示获得的光学图像, 而截面强度配置文件 (红色虚线) 分别显示在图 4c 和 4f中。横截面强度图分别显示363和 346 nm (图 4c) 和 333 nm (图 4f) 的分色, 对应于放大倍数 2.1, 由 hyperlens 的内半径和外径之间的比值决定。

Figure 1
图 1: Hyperlens 制作过程示意图(a) 制造始于精制石英晶片的制备。(b) 在石英晶片上, 一个 100 nm 厚的铬层由电子束蒸发系统沉积。(c) 为湿法蚀刻过程制作掩模图案, 在铬层上使用一个 50 nm 直径的孔, 用一个撒膜铣削系统进行图案化。(d) 采用铬层进行各向同性湿法蚀刻。在石英晶片上形成半球形。(e) 铬层的去除是用铬蚀刻的。(f) 在半球面上是一个多层的 Ag 和的, 并在2交替沉积, 厚度为 15 nm。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: Hyperlens 的制作和模拟结果(a) 制作的 hyperlens 的扫描电镜图像。每层银和 well-deposited2的厚度为 15 nm, 具有均匀性, 最终 hyperlens 的粗糙度小于1.5 值此图已从引用17中进行了修改。(b) Isofrequency hyperlens (绿线) 和各向同性介质 (紫色线) 的轮廓。hyperlens 具有色散关系的双曲型, 可以将高频分量 (小特征, 大于截止值) 传播到远场。然而, 各向同性介质的常规光学具有圆形色散关系, 不能在截止频率上传播。(c) hyperlens 的模拟结果。结果表明, hyperlens 内表面小特征的磁场分布。sub-diffractional 对象被放大, 并通过 hyperlens 传播到远场。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: Hyperlens 实现的成像系统示意图(a) 宽带白光源用于照亮样品。光通过带通滤波器, 并选择特定波长的光。在这里, 410 纳米光被用作照明灯。hyperlens 在目标平面上很容易实现, 通过物镜和 CCD 摄像机, 使 hyperlens 上的小对象被捕获。(b) Hyperlens 实现的成像系统。一个传统的倒置显微镜体被用作大型机, 并添加 hyperlens 的超分辨率成像。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: Hyperlens 的制造结果和模拟结果17 . (a) 用线结构隔开的两个点的物体的 SEM 图像。每个网点有 180 nm 和 160 nm 的距离。(b) 通过 hyperlens 捕获的光学图像。hyperlens 中的小对象被放大和捕获。sub-diffraction 有限的功能已解决。(c) 沿红色虚线, 测量截面强度剖面。横断面强度剖面显示363和 346 nm 的分离。(d) SEM 图像的另一个对象, 与三点 160, 170, 和 180 nm 彼此。(e) 通过 hyperlens 捕获的光学图像。(f) 红色虚线线的截面强度剖面 (e)。横断面强度剖面显示 333 nm 的分离。截面强度剖面对应于 hyperlens 的2.1X 放大系数。此图已从 refefence17中修改。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

hyperlens 的制作包括三主要步骤: 通过湿蚀刻过程将半球形几何定义为石英基底, 用电子束蒸发系统堆叠金属和介电多层, 并刻在 Cr 层上的对象。最重要的步骤是第二, 因为它可以显著地影响质量的 hyperlens。在薄膜沉积过程中, 有两个条件需要特别注意清晰的构图像。堆叠多层形是其中的一个关键问题, 由于 non-conformal 沉积的多层导致一个偏离完美的球形形状。如果薄膜沉积速度不够慢, 在中心和半球几何边缘的薄膜厚度往往由于电子束蒸发的倾斜性质而不同。空间上不同的膜厚产生空间依赖性放大, 导致图像失真。因此, 薄膜沉积速率应尽可能慢 (小于 0.1 nm/秒), 以实现共形多层。

另一个可能的因素, 可以提出一个不完美的图像是表面粗糙度, 因为粗糙的表面增加了光散射的概率。据报道, 包含一层薄薄的 high-surface 能材料具有润湿作用, 大大减少了银的渗流18。在这里,2层作为润湿材料工作。在2层上沉积的银往往比往常更平坦。此外, 真空条件应小于 10-7乇整个沉积过程中的平坦和平滑的多层。在电子束蒸发过程中, 银的团聚也会使表面粗糙。由于在低温下抑制团聚, 薄膜沉积可以在液氮控制的低温条件下进行。在薄膜沉积后, 通过 AFM 的表面粗糙度检验, 确定表面粗糙度小于 1.5 nm。

即使所有三条件都被仔细地控制, 完美的图像是无法得到的, 即使在理想的制作。首先, 与任何其他常规光学系统一样, hyperlens-based 光学系统, 包括 hyperlens 和传统的高 NA 光学, 受到常规像差, 如球面象差。此外, 虽然 hyperlens 的球面结构能够在偏振光下实现 two-dimensional 超分辨率成像, 但球面几何会产生像差。例如, 当对象由两个孔和一个刻在 Cr 层上的狭缝组成时, 它们不在同一对象平面上。因此, 其中一个对象可以是焦点, 而另一些则不是。这种局部聚焦也来源于样品的不和随后的高 NA 成像的光轴。除了这种空间依赖性的分辨率, 额外的模糊是观察由于条纹的影响, 这源于在照明灯的残余相干。

此外, 有效介质逼近的击穿限制了分辨率。对于横向波矢量分量与真空波长相比过大的波, hyperlens 中的有效波长变小, 有时变得与薄膜厚度相媲美。因此, 有效介质逼近不再有效。由于有效波长接近 2d, 其中 d 是层的厚度, 色散曲线明显偏离双曲形, 波浪无法传播。这限制了在 60 nm 内的具体 hyperlens-based 系统的分辨率在这里显示。我们还应该提到, 虽然 hyperlens 在远场提供图像, 但对象应该放在一个近场中。否则, 带有 sub-diffraction 特征的倏逝波不能到达双曲介质。

尽管对 hyperlens 的分辨率有根本的限制, 我们还是通过模仿 hyperlens 的平滑和完美的球形结构, 成功地提高了成像质量。平滑的界面保证了较低的散射和较少的图像失真, 而共形结构则减少了空间依赖性畸变。此外, 由于超分辨率成像使用 hyperlenses 产生于非凡的色散关系, 它没有使用荧光或其他复杂的机制, 如随机方法。因此, hyperlens 不需要进行后期处理, 并使 real-time 成像成为可能。它也不涉及复杂的实验组件, 作为一个光学模块, 可以很容易地与传统的光学装置集成, 如上所示。此外, 薄膜工艺可用于堆叠各种材料, 厚度可控于纳米级。因此, 在不同波长的 hyperlens 工作可以使用不同的材料制造。

在这里, 我们介绍了一个 hyperlens 的制作过程及其光学设置的成像。我们还实验报告无标签的 sub-diffraction 图像在 real-time 使用 hyperlens-based 光学系统。由于 hyperlens 有一个简单的球面几何, 有其他自由度, 以减少在成像环境的约束。例如, 我们可以通过采用可伸缩的制造方法来提高实用性, 或者通过增加制作的额外步骤来扩展其通用性, 从而使体外成像应用成为可能。hyperlenses 的使用将使科学家能够观察到 real-time 纳米尺度上发生的生物物理动力学。它可以被认为是下一代的超分辨率成像平台, 用于各种应用, 如生物, 医学和材料工程。

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Disclosures

作者声明他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

这项工作是由年轻的研究员项目 (NRF-2015R1C1A1A02036464), 工程研究中心计划 (NRF-2015R1A5A1037668) 和全球前沿计划 (CAMM-2014M3A6B3063708), m.k, 轮, I.K. 承认全球博士学位资助。奖学金 (NRF-2017H1A2A1043204、NRF-2017H1A2A1043322、NRF-2016H1A2A1906519) 通过韩国国家研究基金会 (NRF) 资助, 由韩国政府科学、信息和通信技术和未来规划部 (MSIP) 提供。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Focused Ion Beam milling machine FEI Helios Nanolab G3 CX
E-beam evaporation system Korea Vacuum Tech KVE-E4000
Scanning electron microscopy Hitachi SU6600
Inverted microscopy Zeiss Axiovert 200
Light source EXCELITAS Technologies X-Cite 110 LED
Band pass filter Chroma ET405/30M
Objective lens Zeiss Plan-Apochromat NA=1.3, 100X
CCD camera Andor Zyla 4.2
Quartz wafer CORNING Fused Silica Corning 7980
Buffered oxide etchant J.T Baker TM J.T.Baker 5175
Photoresist AZ electronic materials GXR-601 PR
Chromium etchant SIGMA-ALDRICH 651826
Aceton J.T Baker TM UN1090
Isopropyl alcohol J.T Baker TM UN1219
FEM simulation tool COMSOL 5.1 Multiphysics

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References

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