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大鼠实验性生殖研究中的超声检查

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Summary

该手稿描述了超声对雌性大鼠进行生殖和妇科研究的实验模型的效用。一步一步的解释如何进行超声评价显示。

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Wang, T., Oltra-Rodríguez, L., García-Carrillo, N., Nieto, A., Cao, Y., Sánchez-Ferrer, M. L. Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats. J. Vis. Exp. (130), e56038, doi:10.3791/56038 (2017).

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Abstract

随着辅助生殖技术的发展和人类研究的伦理局限性, 大鼠动物模型在生殖医学中得到了广泛的应用。过去, 对啮齿动物生殖系统发育的研究一直是基于对切除组织的一次性组织学检查。近年来, 随着高分辨率经腹超声的发展, 可以对大鼠的生殖器官进行高质量的超声检测, 从而为研究生殖系统提供了一种新的方法。利用高分辨率的超声系统获得图像。对28八周大的非孕鼠和5例妊娠大大鼠进行妇科超声检查。我们描述了在发情周期的不同阶段, 如何在典型的视图中识别生殖系统和相关结构的器官。彩色血流多普勒用于测量子宫动脉血流, 评价不同孕期子宫血流模式的变化。我们已经证明, 超声探测是一种有用的方法来评价变化的内部生殖器官。它的使用提高了进行额外实验的可能性, 包括医疗或外科手术, 并提供了监测超声改变内脏器官而不牺牲动物的能力。

Introduction

大鼠动物模型已广泛应用于生殖医学, 包括胚胎和卵巢移植的1,2。然而, 在过去, 对啮齿动物生殖系统发育的研究是基于对切除组织的一次性组织学检查, 而在大鼠3中, 对日间生殖器官变化的纵向研究是不可能的。超声在人类辅助生殖技术中的应用已有30年的历史, 但这一宝贵的技术在最近才被广泛应用于大鼠。

我们的目标是建立一个评价大大鼠生殖器官的超声方法, 设计生殖和妇科调查的实验模型, 并证明这一程序, 因为据我们所知,目前没有关于此过程的可视化出版物。我们描述了对雌性大鼠生殖系统进行超声检查的程序, 以及用高清晰度超声对解剖和子宫动脉血流的超声表现。我们监测不同发情周期的非妊娠期动物子宫内膜、卵巢和子宫动脉血流的特点, 以评价其在子宫膜厚度、卵巢形态和子宫血流中的显著差异。不同阶段的发情周期, 类似于妇女。我们使用了 70 MHz 频率和分辨率级别为30µm 的高品质超声设备.我们的另一个目的是评估怀孕大鼠子宫血流阻力的变化。这种技术允许研究生殖器官的日常变化而不牺牲动物。

超声对大鼠的应用有若干技术难点。这些困难包括: 大鼠子宫内膜比人类女性更薄4。大鼠卵巢成像困难的原因是大鼠的皮肤和腹壁肌组织较厚, 导致超声5近乎完全衰减, 而子宫动脉在非妊娠期更难发现。鼠.我们已经解决了程序中的许多技术问题, 对于那些仍然存在的问题, 我们将展示如何将它们最小化。

在不需要牺牲动物的情况下, 成功地监测大鼠生殖器官的超声变化, 将为将来建立生殖医学和其他外科手术的动物模型开辟可能性。

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Protocol

这项研究是严格按照《关于国家卫生研究院的实验室动物的护理和使用指南》中的建议进行的, 并按照到达 (动物研究: 报告活体实验) 准则进行的。该协议获得了动物实验许可证, 符合指令 2010/63/欧盟的授权编号 A13170404 (Anexo 1)。所有的实验都是在欧洲联盟认证的实验室中进行的, 遵循国家动物伦理准则 (RD 53/2013, 欧盟指令 63/2010)。该议定书得到了穆尔西亚大学动物实验伦理学委员会的批准。

1. 动物制剂

注: 所有实验均得到穆尔西亚大学动物实验科和穆尔西亚大学妇产科学系的支持。

  1. 使用8周老的大鼠 (28 只雌性大鼠) 在所有实验中重200-250 克。
    注意: 在这里, 我们还使用了5只怀孕的老鼠。
  2. 为获得孕鼠, 笼八周老雌性和可育雄性大鼠和交配 17:00-23:00 h. 第二天早上阴道堵塞的识别被解释为交配成功.考虑1天的妊娠, 第二天后, 他们交配。
  3. 在怀孕9、15和18天进行实验。
  4. 两组的大鼠, 可以免费获得食物和水, 并保持正常12小时的光照/暗循环。
  5. 在适应到设施条件至少两周后, 使用每天早晨的阴道细胞学来评估发情频率和规律性。
    注: 二十八只大鼠与正常4至5天发情阶段选择纳入该研究。

2. 大鼠成像的制备

注意: 图像是通过高分辨率经腹超声检查得到的。经阴道涂片细胞学检查, 可确定动情周期阶段。

  1. 在成像研究之前, 麻醉了2-3% 异氟醚气体在感应室的大坝。
  2. 在超声检查中, 取出动物并立即将鼻口置于与麻醉系统连接的鼻子锥内, 并在 1.5-2% 异氟醚上维持动物。
  3. 将皮草从肋缘移到尾腹, 用快船队和脱毛膏。
  4. 将麻醉大鼠放置在一张加热桌上的仰卧位上, 以确保大鼠的安全, 并在影像疗程期间保证生理参数的最佳舒适和保持。所有的生理参数应与图像和实时采集的数据相结合, 通过超声应用。
  5. 轻轻插入直肠探头 (在润滑后) 以监视体温 (37.5 ° c ±0.5 ° c)。
  6. 将传感器 (30 Hz) 放在固定架上, 并使用手动操纵杆或手将其沿垂直轴和水平轴 (向前-向后和侧面) 移动。
  7. 用石油为基础的眼霜, 以避免干燥过程中的老鼠的眼睛。

3. 考试程序

注意: rats´生殖器官的解剖: 阴道位于膀胱的背部, 分为两个子宫角, 延伸至肾脏。卵巢通过输卵管连接到子宫角 (图 1)。子宫位于肾脏后部的区域。

  1. 子宫的鉴别
    1. 通过用膀胱作为地标来找到宫颈, 跟随宫颈找到左、右子宫角的分支。
    2. 通过选择 "B 模式" 切换到二维查看/视频。用矢状中线图像测量中峡区各子宫角的前后径。使用超声系统软件检测测量。
    3. 在 "B 型" 的矢状中线图像上, 测量子宫内膜腔的子宫内膜厚度, 从回声边界到回声边界。
    4. 通过选择 "彩色多普勒", 改变彩色多普勒模式。使用彩色多普勒识别子宫内膜的血供, 测量子宫内膜的血流量。在彩色多普勒模式下选择以下参数: 高通滤波器设置在4赫兹, 脉冲重复频率设置在4和48赫之间, 脉冲多普勒门设置在0.2 到 0.5 mm 之间。
  2. 子宫动脉血流的鉴别
    1. 获得多普勒波形的子宫动脉附近的侧下缘的宫内-颈部交界靠近髂动脉两侧。
    2. 在多普勒模式下使用以下参数: 高通滤波器设置在6赫兹, 脉冲重复频率设置在4和48赫之间, 脉冲多普勒门设置在0.2 到 0.5 mm 之间。
    3. 注意对齐血流和多普勒光束以最小化多普勒角。记录多普勒光束和血管之间的夹角。超出60°角度的值是不准确的, 应避免6
    4. 从三连续周期测量峰值收缩速度和舒张末期速度 (舒张)。然后计算每个子宫角的收缩到舒张期 (舒张) 和阻力指数 (RI) (舒张)/埃因霍温) 值。
    5. 测量5例妊娠大鼠子宫动脉血流量 9th、15th、18th日。
  3. 卵巢动脉血流的鉴定
    注: 雌性大鼠卵巢位于动物两侧的肾脏侧面, 并居住在子宫角末端的脂肪垫 (图 1)。
    1. 要想象卵巢, 从探针开始在一个横向的平面, 并把它放在动物的侧面, 略低于肋骨。肾脏和脂肪垫有一个回声的外观相比, 卵巢。
    2. 测量卵巢和卵泡的外边界。每个图像的刻度上的数字以毫米为单位, 增量为 0.1 mm。
      注: 彩色多普勒模式和功率多普勒模式成像有助于识别卵巢强度和定向流。

4. 研究的设计

  1. 用阴道涂片细胞学检查发情周期。
  2. 把所有老鼠分成两组。对于组1或前受精 (或 periovulatory), 包括在 proestrus 和发情周期阶段的大鼠。对于2组或后育, 包括早期发情和晚期发情周期阶段的大鼠。
  3. 监测和比较1和2组中峡区各子宫角的前后径。
  4. 监测和比较1和2组子宫内膜的厚度和特征。
  5. 监测和比较的大小 (最大直径) 和特点的卵巢, 并本地化任何 periovulatory 卵泡的两个卵巢组1和2。
  6. 监测和比较1和2组的子宫动脉血流。
  7. 监测和比较怀孕大鼠的子宫动脉血流在不同孕期 (9、15和18的妊娠期)。
  8. 使用 SPSS 执行统计分析. 目前的数据为平均±标准差 (SD) 或中值与分范围。使用不同组之间的学生 t 检验分析结果。小于0.05 的 P 值被认为是统计学上的显著差异。

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Representative Results

前后子宫角直径或子宫角的两侧子宫内膜厚度 (表 1) 无显著差异。与2组比较, 1 组的平均子宫内膜厚度较厚, 但在两组 (图 3) 之间未发现显著差异 (P > 0.05)。然而, 我们发现子宫内的液体 (在8出28大鼠) 附近的发情周期的变化相关的内膜形态学 (图 2)。

多普勒研究还显示, 非妊娠大鼠子宫角两侧或不同发情周期的血流速度波形模式没有显著变化 (表 12,图 4A)。然而, 在怀孕大鼠, 随着妊娠晚期, 峰值收缩和舒张末期速度明显增加, 并计算阻力指数显著下降 (表 3,图 4B)。

卵巢的平均直径没有明显的不同 (表 1)。当卵巢的形态学比较两组, periovulatories 卵泡和液体周围的卵巢被视为排卵后 (表 2,图 2)。

Figure 1
图 1: 解剖学请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 测量子宫内膜厚度 (B 型).子宫内膜厚度 (蓝线) (A)。前-后子宫角直径 (大蓝线) 和子宫内膜厚度 (短蓝线) 在发情周期 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: (A) 测量左卵巢的直径;(B) 卵巢和卵泡在发情阶段。

Figure 4
图 4: 测量子宫动脉血流.(A) 非怀孕大鼠的子宫动脉血流。(B) 子宫动脉血流量在 15 th日的孕鼠。

(P > 0.05, 各组间无显著差异)。SD: 标准 DesviationPSV: 峰值收缩 velocityEDV: 舒张末期 velocityS/D: 收缩到舒张 ratioRI: 阻力指数。((RI) = [PSV–EDV]/埃因霍温)

变量
(mm±SD)
左侧 右侧 P. 值
喇叭直径 (mm) 1.78±0.24 1.73±0.28 0.626
子宫内膜厚度 (mm) 0.75±0.06 0.76±0.05 0.752
子房直径 (mm) 3.69±0.52 3.62±0.32 0.107
卵泡大小 (mm) 1.68±0.31 1.74±0.29 0.859
埃因霍温 (毫米/秒) 91.52±17.91 93.07±22.87 0.055
舒张 (毫米/秒) 34.18±9.36 36.67±11.14 0.178
S/D 2.78±0.59 2.62±0.50 0.294
0.62±0.08 0.60±0.08 0.876
(P > 0.05, 各组间无显著差异)。
SD: 标准 Desviation
峰值收缩速度
舒张: 舒张末期速度
收缩到舒张期的比值
RI: 阻力指数。((RI) = [PSV–EDV]/埃因霍温)

表 1: 左、右子宫角和卵巢的差异。

变量
(mm±SD)
发情阶段
(1 组)
非发情阶段
(2 组)
P. 值
喇叭直径 (mm) 1.71±0.18 1.83±0.23 0.433
子宫内膜厚度 (mm) 0.78±0.04 0.72±0.05 0.168
子房直径 (mm) 3.71±0.56 3.66±0.47 0.515
埃因霍温 (毫米/秒) 92.05±17.93 94.15±20.62 0.886
舒张 (毫米/秒) 37.81±9.64 34.72±5.38 0.096
S/D 2.61±0.58 2.77±0.44 0.249
0.60±0.08 0.63±0.06 0.232
(P > 0.05, 各组间无显著差异)。
SD: 标准 Desviation
峰值收缩速度
舒张: 舒张末期速度
收缩到舒张期的比值
RI: 阻力指数。((RI) = [PSV–EDV]/埃因霍温)

表 2: 非孕鼠不同动情周期阶段的差异。

变量 D9 D15 D18 P 值
埃因霍温 (毫米/秒) 111.08±5.93a, b 122.64±7.49c 131.91±3.50 < 0.05
舒张 (毫米/秒) 38.80±3.37d, e 56.43±3.10f 79.29±5.47 < 0.05
S/D 2.87±0.12g, h 2.17±0.16i 1.67±0.14 < 0.05
0.65±0.02 j, k 0.54±0.04L 0.39±0.05 < 0.05
峰值收缩速度
舒张 = 舒张末期速度。
收缩率为舒张期 (埃舒张)。
ri = 阻力指数 (ri) = ([PSV–EDV]/埃因霍温)。
D9= 9 天的妊娠
D15= 15 天的妊娠
D18=Day 18 的妊娠
SD: 误差表示标准偏差 (±)。
(P < 0.05, 各组间无显著差异)
P 值: D9 vs D15 a = 0.03;d = 0.001;g = 0.01;j = 0.01。
D9 vs D18 b = 0.003;e = 0.001;h = 0.01;k = 0.001。
D15 vs D18 c = 0.03;f = 0.001;i = 0.03;L = 0.04。

表 3: 孕鼠子宫动脉血流的差异。

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Discussion

由于这项研究所需的程序性修改和故障排除, 尽管我们的目的是确定的所有阶段的发情周期的大鼠使用超声波, 我们无法找到任何显著的差异。我们推测, 这些困难可能是因为发情周期只持续几天的老鼠, 不同于妇女的周期。我们确信所有的测量都是在正确的时间进行, 以确定任何差异。因此, 我们将发情周期阶段重新组合为两个阶段, 以评估任何差异, 但没有观察到。正如所料, 我们发现每个子宫角的测量没有明显的区别, 这将使我们可以选择任何一个喇叭来进行测量在未来。研究异氟醚对啮齿动物的影响是矛盾的。它可能是致畸, 但只有在麻醉药浓度为数小时或数天。在我们的实验中, 在怀孕大鼠的检查时间少于30分钟, 所以我们没有发现任何不良影响, 任何怀孕的老鼠或他们的后代。

我们希望有更多的相似性, 超声评价的生殖道在妇女, 其中有明显的回声区别卵泡期, periovulatory 和分泌阶段, 但这种变化没有看到在大鼠模型.这一事实可以解释, 因为鼠发情周期的阶段只持续了四到五天。短的发情周期阶段和妊娠期使大鼠成为繁殖研究的理想动物5。然而, 这一事实可能是为什么在发情期和非发情阶段子宫角、子宫内膜厚度和卵巢直径没有显著差异的原因。很难在正确的时间进行测量, 以确定差异, 尽管每天都在测量, 但我们没有发现重大变化。

尽管存在上述限制, 我们还是建议使用超声检查来监测生殖系统的变化, 包括生殖器官的厚度和形态。我们可以肯定这种使用超声检查, 因为子宫内膜的厚度8周老大大鼠作为测量病理 (一层359.13 ±49.70 毫米) 由京et al.7与此处的结果类似。尽管有各种方法测量子宫内膜厚度病理和超声, 我们得到了类似的结果。虽然在怀孕的大鼠身上使用了数年的能量多普勒和彩色多普勒8,9, 但在非孕鼠子宫动脉血流测量方面的研究很少。现在, 随着超声的发展, 我们可以利用这种技术来监测在每个不同阶段的生殖道变化, 即使在怀孕的一开始。

未来的应用超声可能包括探讨胚胎植入的机制和治疗大鼠薄层膜的动物模型。此外, 通过监测卵泡发育的特点, 可以在卵巢移植模型中获得更全面的有关其功能的知识。目前, 有少量的调查使用3D 成像和分子超声成像的大鼠生殖系统的10, 我们将该技术应用于薄层膜模型的未来。

我们可以得出结论, 大鼠是一个合适的模型, 研究生殖器官动力学使用经皮超声生物显微镜, 这并不需要牺牲的动物。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

这项研究得到了穆尔西亚大学动物实验科和穆尔西亚大学妇产科科的支持。我们感谢所有的技术人员在 CEIB (中心实验 en 门多萨市 Biomédicas), 在穆尔西亚大学的动物实验部分, 谁在这个项目上合作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD Envigo, inc. Rat strain
Lubricating Gel General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System Cibertec S.A  Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)  General Supply
Isoflurane Esteve Veterinaria Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.

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References

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