Biocontainment के भीतर वायरल नमूने के नकारात्मक धुंधले के लिए कैप्सूल का उपयोग

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

यह प्रोटोकॉल नकारात्मक धुंधला वायरस नमूने के लिए निर्देश प्रदान करता है जो आसानी से बीएसएल -2, -3 या 4 प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसमें एक अभिनव प्रसंस्करण कैप्सूल का उपयोग शामिल है, जो ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की रक्षा करता है और उपयोगकर्ता को बैकोकंटनमेंट के भीतर और अधिक अशांत वातावरण में आसान संचालन प्रदान करता है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग नैनोमीटर संकल्प के साथ वायरस और अन्य माइक्रोबियल रोगजनकों के अत्याधुनिक निरीक्षण के लिए किया जाता है। अधिकांश जैविक सामग्री में घने तत्व शामिल नहीं होते हैं जो एक छवि बनाने के लिए बिखरने वाले इलेक्ट्रॉनों में सक्षम होते हैं; इसलिए, एक नकारात्मक दाग, जो नमूना के आसपास घने भारी धातु के लवण की आवश्यकता है, आवश्यक है। मंदिर के तहत निलंबन में वायरस की कल्पना करने के लिए उन्हें छोटे से ग्रिड पर लागू किया जाना चाहिए जो पारदर्शी सतह से नैनोमीटर मोटी होती है। उनके छोटे आकार और नाजुकता के कारण, इन ग्रिड को संभाल करने में मुश्किल होती है और आसानी से हवा में धाराओं से चले जाते हैं। पतली सतह आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती है, छवि को नमूना मुश्किल या असंभव छोड़कर। संक्रमित वायरस को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में संभाला जाना चाहिए और कुछ को एक बायोकेंटिंमेंट लैबोरेटरी पर्यावरण की आवश्यकता होती है। जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) -3 और -4 में स्टीनिंग वायरस विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इन वातावरण में अधिक अशांति है और तकनीशियनों को आवश्यक हैव्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें, जो निपुणता कम हो जाती है।

इस अध्ययन में, हमने बायोकंटंमेंट में नकारात्मक धुंधला वायरस में सहायता के लिए एक नया उपकरण का मूल्यांकन किया। डिवाइस एक कैप्सूल है जो विशेष विंदुक टिप के रूप में काम करता है एक बार ग्रिड कैप्सूल में लोड हो जाते हैं, तो उपयोगकर्ता बस एस्पिरस को कैप्सूल में अभिकर्मित करता है जिससे कि वे एन्कपस्यूटेड ग्रिड को वायरस और दाग पहुंचाते हैं, जिससे उपयोगकर्ता ग्रिड को नियंत्रित कर सकते हैं। यद्यपि यह तकनीक विशेष रूप से बीएसएल -3 या -4 बायोकंटैनेमेंट में उपयोग के लिए तैयार की गई थी, लेकिन यह वायरस के आसान नकारात्मक धुंधला को सक्षम करके किसी भी प्रयोगशाला के वातावरण में नमूना तैयार करने को कम कर सकता है। नैनोकणों, अणुओं और इसी प्रकार के नमूनों के नकारात्मक दाग वाले मंदिर के नमूने तैयार करने के लिए इसी विधि को भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप 1 , 2 , 3 , 4 के साथ देखा जाना बहुत छोटा है कि जैविक नमूनों की आकृति विज्ञान और बुनियादी सुविधा को देखने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। टीईएम इलेक्ट्रॉनों को प्रकाश की तुलना में बहुत कम तरंगदैर्ध्य के रूप में एक उच्च संकल्प छवि उत्पादन एक बहुत पतली नमूने के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों को गोली मार। इलेक्ट्रॉनों के झुकाव या ब्लॉक करने वाले नमूने के क्षेत्र में अंधेरे दिखाई देते हैं, जबकि इलेक्ट्रान चमकदार क्षेत्रों में सफेद दिखाई देते हैं।

इलेक्ट्रॉन घने पदार्थ का अभाव वायरस को एक मंदिर के नीचे देखने में मुश्किल होता है क्योंकि वे इलेक्ट्रॉनों को तितर बितर नहीं कर सकते। नकारात्मक धुंधला हो जाना सबसे सामान्य तरीका है जो इसके विपरीत बनाने और एक मंदिर के साथ वायरस को देखने के लिए उपयोग किया जाता है। पहली नकारात्मक धुंधला प्रक्रिया 1 9 5 9 में ब्रेनर और हॉर्न द्वारा प्रस्तावित की गई थी, उस प्रयोग के आधार पर जहां हॉल (1 9 55) और हक्सले (1 9 57) पर्यवेक्षकएक इलेक्ट्रान-घने पदार्थ 5 में विसर्जित होने के बाद इसके विपरीत में जैविक संरचनाओं की उपस्थिति ved पिछली आधी शताब्दी में नकारात्मक धुंधला होने की प्रक्रिया लगभग अपरिवर्तित रही है। नकारात्मक धुंधला हो जाना, वायरस 6 घुसपैठ के बिना घने सामग्री के साथ वायरस को घेरने के प्रयास में एक मंदिर के ग्रिड पर नमूने के लिए एक भारी धातु के नमक समाधान को संक्षेप में शामिल करता है यह एक अंधेरे सीमा बनाता है और कण के आकार का पता चलता है 5 । यह अध्ययन नकारात्मक अभिप्राय, यूरैनल एसीटेट (यूए) और पोटेशियम फॉस्फोटोंग्स्टिक एसिड (पीटीए) के लिए दो अभिकर्मकों का उपयोग करता है। इन दोनों दाग सामान्यतः छोटे जैविक नमूने, जैसे कि वायरस, प्रोटीन परिसरों, और नैनोकणिक 7 , 8 , 9 को दागने के लिए इस्तेमाल किया जाता है।

पारंपरिक नकारात्मक धुंधला तकनीक मैनुअल छोटी बूंद नकारात्मक धुंधला तकनीक है7 नि 7 इस पद्धति के लिए संदंश के साथ छोटे, नाजुक मंदिर ग्रिड की सटीक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जिसमें वायरस के नमूने, दाग, और राइन्स की छोटी मात्रा को लागू किया जाता है। ठेठ तैयारी प्रोटोकॉल में फिल्म-लेपित होम ग्रिड ( चित्रा 1 ए ) की सतह पर नमूना निलंबन के एक छोटी बूंद को लागू करना शामिल है। फिल्म की सतह पर नमूना लगाए जाने के बाद, नमूना के प्रकार के आधार पर गैर-पक्षपाती वायरस को हटाने के लिए ग्रिड को धोया जाता है और कुछ मिनट से यूए या पीटीए के साथ दाग किया जाता है। ग्रिड के किनारे तक फिल्टर पेपर के एक टुकड़े को छूकर ग्रिड से अतिरिक्त तरल दूर होती है।

मैनुअल छोटी बूंद विधि की आवश्यकता है कि प्रत्येक ग्रिड को व्यक्तिगत रूप से बनाया जाए यदि सावधानीपूर्वक संभाला नहीं, लेपित तापमान ग्रिड आसानी से पक्का हो जाते हैं, मुड़े या दूषित होते हैं कई नमूने संसाधित करने से ग्रिड्स पर नज़र रखने में कठिनाइयों का सामना हो सकता है और प्रत्येक नमूने के लिए लगातार धुंधला हो जाना सुनिश्चित हो सकता है। यह मैनुअल स्टैनिंग प्रक्रिया बहुत अधिक हैइन वातावरणों के लिए जरूरी निजी सुरक्षा उपकरणों (पीपीई) की वजह से बायोसाफेटी स्तर (बीएसएल) -3 और -4 बायोसंटेंटनिंग प्रयोगशालाओं में आयोजित होने पर, पीपीई बोझिल है और एक नियमित प्रयोगशाला की तुलना में बायोकेंटनमेंट वातावरण बहुत अधिक अशांत है। बीएसएल -3 बायोसंटेंटन लैबोरेटरीज में काम करने वाले कार्मिकों को 2 जोड़ी के दस्ताने पहनने और जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में काम करना पड़ता है। दस्ताने की यह डबल परत स्पर्श संवेदनशीलता को कम करती है और ठीक मोटर आंदोलन को नियंत्रित करती है बीएससी के वायु प्रवाह जो उपयोगकर्ता की सुरक्षा करता है और नमूना प्रदूषण को रोकने में मदद करता है, नमूने और दाग को बहुत जल्दी से सूखने के कारण दाग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। बीएससी में मजबूत अशांत एयरफ्लो भी जल्दी से ग्रिड को दूर कर सकता है जो कि अच्छी तरह सुरक्षित नहीं है। बीएसएल -4 बायोकेंटेंटन प्रयोगशालाओं में, अतिरिक्त सुरक्षा आवश्यकताएं हैं कार्मिकों के लिए एक सकारात्मक दबाव सूट पहनना आवश्यक है, जो आगे शारीरिक आंदोलन और स्पष्ट रूप से देखने और माने माने की क्षमता को प्रतिबंधित करता हैUlate ग्रिड बीएसएल -4 में काम करने वाली तकनीशियन भी कम से कम 2 जोड़ी के दस्ताने पहनती हैं, साथ ही बाहरी जोड़ी एक मोटी दस्ताने है जो कि निपुणता और टेंटाइल सनसनी को कम करती है। अंत में, तेम ग्रिड को संभालने के लिए प्रयुक्त संदंश तेज होते हैं, जिससे पेंचकर दस्ताने की उनकी क्षमता के कारण तकनीशियन के लिए जोखिम पैदा होता है। ग्रिड वाले कैप्सूल के साथ, संदंश आवश्यक नहीं होते हैं, इस प्रकार बायोकंटंमेंट में ग्रिड को हेरफेर करने के लिए एक सुरक्षित, संदंश-मुक्त विकल्प प्रदान करते हैं। अंत में, कैप्सूल प्रोसेसिंग, ओस्मिमियम वाष्प परिशोधन और भंडारण के दौरान ग्रिड को स्टोर करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है; जिससे ग्रिड को व्यवस्थित और क्षति से सुरक्षित रखा जाता है।

इस रिपोर्ट में, हम जीपीआरपी / जी कैप्सूल, ग्रिड हैंडलिंग और 10 , 11 , 12 धुंधला के लिए एक कैप्सूल-आधारित डिवाइस का इस्तेमाल करने वाले बायोसेंटेंटिंग प्रयोगशालाओं में नकारात्मक धुंधला मंदिर ग्रिड के लिए एक नई विधि पेश करते हैं। कैप्सूल साथदो मंदिर ग्रिड को संशोधित करता है, सीधी हैंडलिंग को कम करता है, और ग्रिड क्षति की संभावना कम करता है। कैप्सूल सीधे एक एकल या मल्टीचैनल पिपेट को एक विंदुक टिप के रूप में जोड़ता है, जिसमें विभिन्न तरल पदार्थों के आवेदन को ग्रिड में शामिल किया जा सकता है। इससे डुप्लिकेट ग्रिड ( चित्रा 1 बी ) के साथ कई नमूने की एक साथ तैयारी सक्षम हो जाती है। कैप्सूल के साथ नकारात्मक दाग करने के लिए वायरस का नमूना कैप्सूल में महत्वाकांक्षी है और 10 मिनट के लिए रखा जाता है ताकि वायरस को ग्रिड सतहों पर सोखना पड़े। Adsorbed वायरस के साथ ग्रिड बाद में विआयनीकृत (डीआई) पानी से धोया जाता है और कुछ सेकेंड से 1 मिनट तक यूए या पीटीए के साथ दाग जाता है। यह प्रक्रिया मैनुअल छोटी बूंद विधि के रूप में एक ही प्रोटोकॉल चरणों और अभिकर्मकों का उपयोग करती है; यह अंतर यह है कि सभी काम कैप्सूल के अंदर होता है, जिसमें ग्रिड के कोई भौतिक प्रबंधन नहीं होता है। ( आंकड़े 1 सी , 1 डी )

इस अध्ययन का उद्देश्य कैप्सूल का मूल्यांकन करना थाBiocontainment वातावरण में वायरस के नमूनों के नकारात्मक धुंधला के लिए एक नई विधि। इस अध्ययन में भी दो अलग-अलग वायरस निष्क्रियता प्रक्रियाओं से बने मंदिर छवियों की गुणवत्ता की जांच की गई: 1) 1% ऑस्मुम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ तेजी से निष्क्रियता, और 2) 2% ग्लूटार्लाहाइड के साथ 24 घंटे की निष्क्रियता। इन दोनों को कैप्सूल का उपयोग करते हुए आयोजित किया गया था। अंत में, हमने कैप्सूल में उपयोग के लिए दो सामान्यतः नकारात्मक दाग, UA और पीटीए का मूल्यांकन किया। 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. वायरस के नमूने के साथ काम करने से पहले बीएसएल -2 पर्यावरण में प्रयोग की तैयारी

  1. Formvar और कार्बन लेपित मंदिर तांबा ग्रिड तैयार या खरीदते हैं, आमतौर पर 200-400 जाल
  2. कोपित मंदिर ग्रिड को कैप्सूल में डालें
    1. इस प्रक्रिया को करना आसान बनाने के लिए एक विस्तृत लेंस का उपयोग करें। प्रत्येक कैप्सूल में एक या दो ग्रिड डाले जा सकते हैं। पूर्व लोड कैप्सूल को इस चरण को समाप्त करने के लिए खरीदा जा सकता है अगर वांछित।
  3. अन्य आपूर्ति और अभिकर्मकों के साथ एक साथ बायोकंटंमेंट के साथ कैप्सूल डाले गए टेम्पलेट्स के साथ सम्मिलित किए गए तापमान को स्थानांतरित करें, जहां वायरस नकारात्मक रूप से दाग होगा।

2. जैकोन्टेंटेन में नकारात्मक धुंधला के लिए कैप्सूल विधि एक्शीस ग्लुटार्डाडिहाइड और 1% ऑस्मुम टेट्रोक्साइड वाष्प निष्क्रियता का उपयोग करना

  1. बायोसंट्यूमेंटेशन बीएससी के अंदर, एक विंदुक से जुड़ी कैप्सूल में 40 μL वायरस निलंबन की शुभकामनाएं।
    नोट: विंदुक वें से जुड़ा रहता हैई कैप्सूल प्रक्रिया पूरी होने तक। वायरस की तैयारी हमारे पिछले प्रकाशन 14 के मुताबिक है
  2. ग्रिड के क्षैतिज रूप से उन्मुख 10 मिनट के लिए अपनी तरफ विंदुक रखें यह लेपित ग्रिड पर वायरस कणों का एक भी वितरण को बढ़ावा देना है।
  3. बायोकंटनेंस बीएससी के अंदर कैप्सूल के अंदर वायरस को निष्क्रिय करें।
    1. पिपेट को उठाएं और सवार को एक अपशिष्ट कंटेनर में वायरस समाधान देने के लिए सवार हो जाना।
    2. कैप्सूल में 2% ग्लूटार्डाडिहाइड लगानेवाला के 40 μL की आकांक्षा।
      सावधानी: ग्लुटार्डाडिहाइड एक खतरनाक रसायन है और उचित सुरक्षा की आवश्यकता है। ग्लुटार्डाडिहाइड को सामान्य बीएससी में संक्षिप्त अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन विस्तारित खुला अभिकर्मक को डक्टेड बीएससी या रासायनिक फ्यूम हुड में काम करना पड़ता है।
    3. 20 मिनट के लिए अपनी तरफ विंदुक रखें यह सुनिश्चित करना है कि नमूनों को ठीक से तय किया गया हो।
    4. कैप्सूल में लगाने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस डीआई पानी लगाने और निकालने के लिएलगानेवाला दूर राख कुल 3 कुल्ला चक्रों के लिए इस धोने के चरण को दोहराएं।
  4. कैप्सूल में या तो 1% uranyl एसीटेट (यूए) या 1% पोटेशियम फॉस्फोटंगास्टिक एसिड (पीटीए) के 40 μL को महाप्राणित करें और 30 एस के लिए बैठने की अनुमति दें।
    नोट: स्टीनिंग समय वायरस नमूने के आधार पर 10 से 1 मिनट तक भिन्न हो सकता है।
    सावधानी: UA एक अल्फा एमिटर है, और एक संचयी विष है। उचित संरक्षण के साथ इसे संभाल लें
  5. पिपेट से कैप्सूल को निकालें और ग्रिड के किनारे तक फिल्टर पेपर के एक टुकड़े को छूकर ग्रिड को छूएं, जबकि ग्रिड कैप्सूल के अंदर रहते हैं।
  6. ओस्मुयम टेट्रोक्साइड वाफे निष्क्रियता प्रक्रिया।
    1. कैप्सूल को ढक्कन के साथ रखें, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1% ऑस्मुम टेट्रोक्साइड समाधान में भिगोने वाले फिल्टर पेपर रखें।
      सावधानी: ओस्मुम टेट्रोक्साइड कम वाष्प दबाव के साथ बेहद विषाक्त है। इसका उपयोग डक्टेड बीएससी या रासायनिक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। उचित संरक्षण के साथ इसे संभाल लें पोस्ट चेतावनीकार्य क्षेत्र में जानकारी
    2. ओसियम टेट्रोक्साइड वाष्प के पूर्ण रूपांतर की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 50-एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को सील करें। इसके बाद, बीएसएल -2 ईएम सुविधा के लिए बायोकेंटेंट्यूशन से बाहर निकलना और ट्यूब को स्थानांतरित करना।
  7. कैप्सूल से ईएम ग्रिड निकालें
    1. बीएसएल -2 ईएम सुविधा में, कैप्सूल को अपकेंद्रित्र ट्यूब से हटा दें और उसे विंदुक पर रखें।
    2. कैप्सूल में डीआई पानी का 40 μL महाप्राणण करना और पानी को बर्बाद कंटेनर में तीन बार बांटना।
    3. पिपेट से कैप्सूल निकालें और ग्रिड के किनारे को छूने के लिए फ़िल्टर पेपर का इस्तेमाल करके ग्रिड को सूखा दें।
    4. वायु सुखाने के बाद, बाद में मंदिर इमेजिंग के लिए ग्रिड को स्टोर करें।

3. Biocontainment में 2% ग्लुटार्डाडिहाइड के साथ निष्क्रियता के लिए कैप्सूल विधि, बीएसएल -2 प्रयोगशाला में नकारात्मक धुंधला द्वारा अनुवर्ती

  1. वायरस निष्क्रियता प्रक्रिया
      सावधानी: ग्लुटार्डाडिहाइड एक खतरनाक रसायन है और उचित सुरक्षा की आवश्यकता है। ग्लुटार्डाडिहाइड को सामान्य बीएससी में संक्षिप्त अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन विस्तारित खुला अभिकर्मक को डक्टेड बीएससी या रासायनिक फ्यूम हुड में काम करना पड़ता है।
    1. पैकेजिंग, डीसीटैमिनेशन से पहले न्यूनतम 24 घंटे के लिए लगाने वाले बीएसएल -2 ईएम सुविधा के लिए वायरस को निष्क्रिय करें।
  2. बीएसएल -2 ईएम सुविधा में, कैप्सूल में वायरस और लगानेवाला मिश्रण को महाप्राणित करना, जिसमें दो मंदिर ग्रिड होते हैं, जो एक विंदुक से जुड़ा होता है।
  3. पिपेट क्षैतिज रूप से 10 मिनट के लिए क्षैतिज उन्मुख ग्रिड के साथ रखें।
    नोट: यह मंदिर ग्रिड पर वायरस कणों के एक भी वितरण को बढ़ावा देना है
  4. पिपेट को उठाएं और सवार को एक अपशिष्ट कंटेनर में वायरस को निकालने के लिए सवार को दबाएं। डीआई के 40 μL की आकांक्षाकैप्सूल में पानी और इसे बर्बाद कंटेनर में 3 कुल्ला चक्रों के लिए बाहर निकालना।
  5. 30 ओं के लिए कैप्सूल में या तो 1% UA या 1% पीटीए के 40 μL की आकांक्षा करना
    नोट: स्टीनिंग समय वायरस नमूने के आधार पर 10 से 1 मिनट तक भिन्न होता है।
    सावधानी: UA एक अल्फा एमिटर है, और एक संचयी विष है। उचित संरक्षण के साथ इसे संभाल लें
  6. पिपेट से कैप्सूल निकालें और ग्रिड के किनारे को छानने के लिए फ़िल्टर पेपर के टुकड़े को छूकर ग्रिड को सूखा दें। एयर ने ग्रिड को सूखा और उन्हें बाद में मंदिर इमेजिंग के लिए स्टोर किया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

कैप्सूल पद्धति, मंदिर इमेजिंग के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नकारात्मक धुंधला हो जाती है:

सबसे पहले, हमने मैनुअल छोटी बूंद विधि और नकारात्मक धुंधला ज़ैरे ईबोलाइरस के लिए कैप्सूल विधि दोनों का उपयोग करके उत्पन्न छवियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया। ईबोलाइरस, मैरबर्ग विषाणु के साथ, फिलीविरिडे परिवार के सदस्य हैं। Ebolavirus आमतौर पर व्यास में 80 से 100 एनएम है और लंबाई में 1,000 एनएम से अधिक हो सकता है। ईबोलावायरस को बीएसएल -4 बायोकेंटिलेशन वातावरण में संभालना होगा। चित्रा 2 मैनुअल छोटी बूंद विधि और नकारात्मक धुंधला हो जाने के लिए कैप्सूल विधि का उपयोग करते हुए छवियों को दिखाता है। चित्रा 2 ए (मैनुअल छोटी बूंद विधि) और चित्रा 2 बी (कैप्सूल विधि) ईबोलावायरस नमूनों को दिखाते हैं जो विरीयन के केंद्र में न्यूक्लोकैक्साइड संरचनाओं के साथ स्पष्ट रूप से परिभाषित होते हैं, और दृश्यमान ईबोलावायरस ग्लाइकोप्रोटीनसतह पर है इस प्रकार, दोनों कैप्सूल और छोटी बूंद तरीकों में समान गुणवत्ता वाले मंदिर छवियों का निर्माण करने की क्षमता होती है।

कैप्सूल विधि का उपयोग करते हुए 2% जलीय ग्लूटार्लेडिहाइड के साथ 24 घंटे की निष्क्रियता बनाम जलीय ग्लुटरडाइहाइड और 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ तेजी से निष्क्रिय होने के बाद की ईएम छवि की गुणवत्ता की तुलना करें और मूल्यांकन करें:

हमने चिकनगुनिया विषाणु का उपयोग करते हुए नमूना निष्क्रियता के दो विभिन्न तरीकों से उत्पन्न मंदिर छवियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया चिकनगुनिया वायरस परिवार Togaviridae में alphavirus जीनस का एक सदस्य है। यह 60-70 एनएम के व्यास के साथ गोलाकार है। विरीयन में ग्लाइकोप्रोटीन युक्त एक लिफ़ाफ़ा होता है जो वायरल सतह पर ट्रिमरिक स्पाइक्स बनाता है। चिकनगुनिया के वायरस को बीएसएल -3 में संभालना चाहिए रैपिड निष्क्रियता 20% के लिए 2% ग्लूटार्डाडिहाइड का उपयोग करके हासिल की जाती है, इसके बाद 1% से 1% ऑस्मोमियम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ जोखिम होता है, पूरे नीच के साथजैवसंरचना प्रयोगशाला ( चित्रा 1 सी ) में बीएससी के भीतर एक कैप्सूल में होने वाली निष्क्रिय स्टेनाइजिंग प्रक्रिया। हालांकि, वायरस को निष्क्रिय करने के लिए 24 घंटे के लिए 2% ग्लूटार्डाडिहाइड का प्रयोग करते समय निष्क्रियता एक बायोकंटिमेंट वातावरण के अंदर होती है, लेकिन 1% UA नकारात्मक दाग प्रक्रिया बीएसएल -2 प्रयोगशाला ( चित्रा 1 डी ) में कैप्सूल विधि का उपयोग कर की जाती है। ये निष्क्रियता प्रक्रियाएं समान गुणवत्ता वाली छवियां नहीं बनाती हैं ( चित्रा 3 )। यह चित्रा 3 से स्पष्ट है कि ग्लूटरारडिहाइड में ऑस्मीनियम टेट्रोक्साइड ( चित्रा 3 ए , 3 बी ) की उपस्थिति के बिना ग्लूटार्डाडिहाइड और ऑसमियम टेट्रोक्साइड ( चित्रा -3 सी , 3 डी ) के साथ तैयार नमूनों की तुलना में ग्लूटार्डाडिहाइड में फिक्सेशन अधिक स्पष्ट है।

कैप्सूल विधि Uranyl एसीटेट (यूए) और फॉस्फ़ का उपयोग करके अच्छी तरह से काम करती हैऑटिंजिस्टिक एसिड (पीटीए) एल्डिहाइड फिक्स्ड नमूने के लिए नकारात्मक दाग के रूप में।

कैप्सूल विधि का उपयोग करते हुए UA और पीटीए नकारात्मक धुंध के उदाहरण, एल्डिहाइड फिक्स्ड वायरस-जैसे-कण (वीएलपी) पर चित्रा 4 में दिखाए जाते हैं। वीएलपी प्रोटीन होते हैं जो संरचनाओं जैसे वायरस में इकट्ठे होते हैं, लेकिन इसमें कोई वायरल आनुवंशिक सामग्री नहीं होती है वे आमतौर पर टीका विकास में और मूल वायरल अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है। वीएलपी असेंबली और आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए नकारात्मक धुंधला एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हम कैप्सूल विधि के साथ वीएलपी के नकारात्मक धुंधला के लिए यूए और पीटीए दोनों का इस्तेमाल करते थे। दोनों दाग ईल्बो नैनो-वीएलपी 15 ( चित्रा 4 ए , 4 बी ) और मरीन ल्यूकेमिया वीएलपी 16 ( चित्रा 4 सी , 4 डी ) के ग्लाइकोप्रोटीन दिखाई और स्पष्ट रूप से परिभाषित सीमाओं के साथ उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्रदर्शित करते हैं।


चित्रा 1: नकारात्मक धुंधले तरीकों अवलोकन। ( ) मैनुअल छोटी बूंद विधि क्रमशः छोटी बूंदों से मंदिर ग्रिड को नमूने, रग्ने और दागों की छोटी बूंद तक ले जाती है। ( बी ) ग्रिड और नमूना निलंबन के आवेदन के साथ कैप्सूल विधि सेट करना ( सी ) 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ शॉर्ट-टर्म निष्क्रियता के साथ बायोकंटैमेंट में कैप्सूल विधि का उपयोग करके विशिष्ट प्रक्रिया। ( डी ) 2% ग्लुटार्लाहाइड के साथ दीर्घकालिक निष्क्रियता के साथ बायोकंटैमेंट में कैप्सूल विधि का उपयोग करने की सिफारिश की गई प्रक्रिया चित्रा को पहले संदर्भ और 13 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 2: 1% पीटीए नकारात्मक सना हुआ ईबोलावायरस कण की तुलना। ( ) मैनुअल छोटी बूंद विधि के साथ दाग नकारात्मक। ( बी ) कैप्सूल विधि का उपयोग करके नकारात्मक दाग़। चित्रा को पहले संदर्भ और 13 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: 1% UA नकारात्मक स्टेनाइजिंग, चिकनगुनिया वायरस की कैप्सूल विधि के साथ विभिन्न निष्क्रियता प्रक्रियाओं का उपयोग कर रहा है। ( , बी ) कम से कम 24 घंटे के साथ 2% ग्लूटार्डाडिहाइड के साथ निष्क्रियता ( सी ,डी) रैपिड निष्क्रियता 2% ग्लुटार्लाडिहाइड और 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड वाष्प के साथ। चित्रा को पहले संदर्भ और 13 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: कैप्सूल विधि का उपयोग करते हुए फॉस्फोटुन्गस्टिक एसिड (पीटीए) और यूरेनल एसीटेट (यूए) के उदाहरणों में नकारात्मक रूप से सना हुआ वायरस-समान-कण (वीएलपी)। ( ) 1% पीटीए दाग वाले ईबोला नैनो-वीएलपी के कम बढ़ाई अवलोकन ( बी ) पीटीए स्टेन्ड ईबोला नैनो-वीएलपी के संरचनात्मक विवरण दिखाए जाने वाले उच्च विस्तार वाले मंदिर चित्र ( सी ) 1% यूए की मढ़ाई के अवलोकन में मरीन ल्यूकेमिया वीएलपी। ( डी ) उच्च आवर्धन मंदिर छवि संरचनात्मक det दिखाUA की बीमारियों की सतह पर ईबोलावियरस ग्लाइकोप्रोटीन के साथ मरीन लेकिमिया वीएलपी का सना हुआ। चित्रा को पहले संदर्भ और 13 से अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

नकारात्मक धुंधला वायरस, प्रोटीन परिसरों और नैनोकणों के मूल्यांकन और आकार देने के लिए एक बहुमूल्य मंदिर तकनीक है। अभिकर्मक से नकारात्मक दाग तक ग्रिड की मैन्युअल रूप से चलने वाले इन नमूनों की बूंदों की तैयारी आधे से ज्यादा सदी के लिए क्लासिक प्रोटोकॉल रही है। यह एक सरल प्रक्रिया है, लेकिन सफल समापन के लिए प्रशिक्षण के माध्यम से प्राप्त कौशल की आवश्यकता है। उत्कृष्ट नकारात्मक धुंधला अब भी एक अत्याधुनिक कौशल सेट माना जाता है और बहुत से मंदिर प्रयोगशालाओं में वांछित है। कैप्सूल पद्धति में मैनुअल छोटी बूंद विधि के कई विशेष फायदे हैं, विशेषकर जैवसंशोधन प्रयोगशालाओं में। सबसे पहले, मैनुअल छोटी बूंद विधि को पर्याप्त प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता होती है इससे पहले कि यह सफलतापूर्वक किया जा सके, जबकि कैप्सूल विधि का उपयोग करना आसान है, सरल पिपेटिंग द्वारा एंट्री लेवल तकनीशियनों द्वारा पूरा किया जा सकता है। मैनुअल छोटी बूंद विधि के साथ सबसे बड़ी चुनौती बीएसएल -3 और बीएसएल -4 पीपीई में संदंश के साथ मंदिर ग्रिड को सफल संभालना हैओ बहुत कम स्पर्श अनुभूति और निपुणता नाजुक लेपित मंदिर ग्रिड आसानी से क्षतिग्रस्त या संदंश द्वारा छिद्रित कर रहे हैं। लेपित मंदिर ग्रिड को नुकसान अक्सर जब तक इसे एक मंदिर के साथ देखा जाता है प्रकट नहीं किया जाता है। कैप्सूल का एक दूसरा फायदा यह है कि मंदिर ग्रिड केवल जब सीधे कैप्सूल में डाले जाते हैं और जब उन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में सम्मिलित करने के लिए निकाला जाता है तब ही इसे नियंत्रित किया जाता है। चाहे जैवसंरचना प्रयोगशाला में या बीएसएल -2 ईएम सुविधा में काम करें, कोई प्रत्यक्ष ग्रिड हैंडलिंग नहीं है कैप्सूल विधि का तीसरा लाभ यह है कि ग्रिड के दोनों ओर वायरस और दाग के साथ कवर किया गया है। नमूना एकाग्रता कम होने पर यह उपयोगी हो सकता है; हालांकि यह बहुत अधिक नमूना का कारण हो सकता है यदि एकाग्रता उच्च है, या इसका इस्तेमाल करने से पहले नमूना कम करने में परिणाम।

मैनुअल छोटी बूंद तकनीक का इस्तेमाल करते हुए नकारात्मक धुंधला कई ग्रिड समय लगता है क्योंकि प्रत्येक नमूना को व्यक्तिगत रूप से तैयार और दागना चाहिए। इससे मुश्किलें मिलती हैंएनिंग सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धुंधला इसके अलावा, कई व्यक्तिगत ग्रिड्स का ट्रैक हमेशा एक चुनौती है। प्रत्येक कैप्सूल में दो ग्रिड होते हैं और कई कैप्सूल एक मल्टीचैनल पिपेट से जुड़ा जा सकता है, प्रक्रिया को व्यवस्थित किया जा सकता है। इसलिए, कैप्सूल यह सुनिश्चित करते हैं कि ग्रिड एक बहुत ही समान प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, लगातार नमूना स्थितियों के तहत, और एक ही समय में दाग रहे हैं। कैप्सूल को संगठन में सहायता के लिए लेबल किया जा सकता है, इस प्रकार ग्रिड के मिश्रण या गलत पहचान की संभावना कम हो सकती है। मैनुअल छोटी बूंद विधि का उपयोग करते समय एक अन्य आम समस्या का सामना करना पड़ रहा है ग्रिड प्रदूषण ऐसा तब हो सकता है जब ग्रिड खुले हवा में बहुत अधिक समय तक छोड़ दिया जाता है या गिरा दिया जाता है। कैप्सूल तेम ग्रिड को खुली हवा से बचाता है और उन्हें सुरक्षित रखता है ताकि वे कभी गिराए न जाएं। कैप्सूल तैयार और नकारात्मक धुंधला होने पर कैप्सूल अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण और दोहराव प्रदान करते हैं क्योंकि कैप्सूल एक अधिक नियंत्रित वातावरण है।

कैप्सूल पूर्व-लोड किए जा सकते हैं यदि डीजन्म दिया। ग्रिड क्षतिग्रस्त नहीं होते हैं यह सुनिश्चित करने के लिए कैप्सूल में ग्रिड को मैन्युअल रूप से लोड करना कुछ अभ्यास लेता है। कैप्सूल विधि को भी थोड़ा अधिक नमूना और मैनुअल छोटी बूंद विधि की तुलना में दाग की आवश्यकता होती है। मैनुअल छोटी बूंद विधि की तुलना में कैप्सूल विधि में कम से कम 40 μL नमूना की आवश्यकता होती है, जिसे 8 μL जितना कम किया जा सकता है।

वायरस निष्क्रियता बीएसएल -3 और बीएसएल -4 में नकारात्मक धुंधला का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, क्योंकि इससे ईएम सुविधा में इमेजिंग के लिए बायोकेंटेंटियम प्रयोगशालाओं से निष्क्रिय वायरस निकालने की अनुमति मिलती है। फिक्सिविटी का इस्तेमाल करने में निष्क्रियता के कारण वायरस को फिक्स करने, गिरावट को रोकने के लिए अतिरिक्त लाभ होता है। वायरस के नमूने को निष्क्रिय करने के दो अलग-अलग तरीके हैं, जिनमें से दोनों इस अध्ययन में जांच की गई थी। सबसे पहले वायरस को लेपित मंदिर ग्रिड का पालन करता है, वायरस को 2% ग्लुटार्डाडिहाइड समाधान में 20 मिनट के लिए ठीक करता है, इसके बाद ओएसएमियम टेट्रोक्साइड वाफे ( चित्रा -1 सी ) के लिए ग्रिड के 1 घंटे का एक्सपोजर होता है। यह निष्क्रियता हैआयन विधि फायदेमंद है क्योंकि यह नमूना 1 घंटे और 20 मिनट के बाद जैवसंयंत्रण प्रयोगशाला से बाहर ले जाने के लिए समय को बचाता है। यह लेपित टेम्पलेट ग्रिड से पहले वायरस के कमजोर पड़ने को रोकता है, इसलिए इसे टेम्पलेट्स के पता लगाने की सीमा के निकट होने के संदेह के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि, 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड वाष्प मंदिर की छवियों की गुणवत्ता कम कर देता है क्योंकि ओसियम आगे नमूना ( चित्रा 3 ) दाग सकता है। पिछली रिपोर्ट में ओस्मीन टेट्रोक्साइड वाफे के लिए 5 मिनट का एक्सपोजर दिखाया गया है, जब नकारात्मक धुंधला हो; हालांकि, निरपेक्ष वायरल निष्क्रिय करने के लिए आवश्यक लंबे एक्सपोजर ने सकारात्मक और नकारात्मक धुंधला 17 का मिश्रण उत्पन्न किया दूसरी निष्क्रियता विधि में 2% ग्लूटार्डाडिहाइड समाधान में कम से कम 24 घंटे शामिल हैं, और ओसमियम टेट्रोक्साइड वाष्प उपचार ( चित्रा 1 डी ) की आवश्यकता नहीं है। इस दूसरी विधि को पूरा करने में अधिक समय लगता है क्योंकि नमूना को बायोकेंटनिंग लैबो से नहीं हटाया जाता है24 घंटे के लिए रोटरी, लेकिन लाभप्रद हो सकता है क्योंकि यह बीएसएल-2 के वातावरण में नकारात्मक धुंधला हो सकता है, और खतरनाक ऑस्मियम टेट्रोक्साइड की आवश्यकता को समाप्त कर देता है। हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि 24 घंटे का ग्लूटार्डाडिहाइड निष्क्रियता उच्च गुणवत्ता वाली मंदिर छवियों का उत्पादन करती है, जब नमूने ओस्मियम टेट्रोक्साइड वाफे ( चित्रा 3 ) के साथ इलाज किए जाते हैं।

इस प्रयोग में दो नकारात्मक दाग का उपयोग किया गया था: UA और पीटीए। दोनों दाग 1% समाधान के रूप में उपयोग किया जाता है UA, यूरेनियम के एसीटेट नमक, एक नकारात्मक दाग के रूप में अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि घने यूरेनियम परमाणु तितर बितर इलेक्ट्रॉन 5 पीटीए, एक heteropoly एसिड, इसी तरह घने टंगस्टन परमाणुओं 5 की वजह से एक नकारात्मक दाग के रूप में अच्छी तरह से काम करता है। पीटीए को कभी-कभी UA पर पसंद किया जाता है क्योंकि यह बहुत कम विषाक्त है, और केवल हल्के उत्तेजित होने पर अगर इनहेल या संपर्क किया जाता है। जब नकारात्मक धुंधला अपकेंद्रित नमूनों, UA के निचले पीएच को माना जाना चाहिए क्योंकि यह क्षतिग्रस्त हो सकता हैओ नमूना इस प्रयोग में प्रयुक्त वायरस को निष्क्रिय करने के लिए फिक्सेशन की आवश्यकता होती है, इसलिए दोनों UA और पीटीए ने इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए, और दाग के लिए कोई विशिष्ट लाभ नहीं पाया जा सकता है। दोनों दाग के साथ काम करना आसान है, और वे दोनों समान गुणवत्ता मंदिर चित्र ( चित्रा 4 ) का उत्पादन करते हैं।

कुल मिलाकर, कैप्सूल पद्धति एक बायोकेंटनमेंट वातावरण में उपयोग करना आसान है और मैन्युअल छोटी बूंद विधि के विकल्प के रूप में इसका इस्तेमाल किया जा सकता है। कैप्सूल का उपयोग करना नमूना हेरफेर दोष को आसान बनाता है और अच्छी गुणवत्ता वाले मंदिर छवियां पैदा करती है। कैप्सूल विधि का उपयोग करके निर्मित छवियों मैनुअल छोटी बूंद विधि का उपयोग कर छवियों के बराबर हैं। ओसमियम टेट्रोक्साइड के साथ लघु वायरस निष्क्रियता गति में सुधार करती है, लेकिन इसका उपयोग केवल तब किया जाना चाहिए जब कम छवि गुणवत्ता स्वीकार्य हो, या वायरस को कम करने के संदेह से यह प्रक्रिया के लिए मंदिर पहचान सीमा के नीचे रखेगा। दोनों UA और पीटीए इस अध्ययन में प्रयुक्त फिक्स वायरस नमूनों के साथ समान परिणाम प्रदान करते हैं; होवाइवर, रिफाक्स वायरस को धुंधला करते समय परिणाम अलग हो सकते हैं

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

आलेख के भीतर कहा गया राय, व्याख्याएं, निष्कर्ष और सिफारिशें लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग द्वारा इसका समर्थन किया जाता है

Acknowledgements

हम चिकनगुनिया विषाणु प्रदान करने के लिए शुद्ध ईबोला नैनो-वीएलपी, डॉ रजनी मुधासानी और डॉ चार्ल्स (जेसन) शोएमेकर के लिए डॉ। जॉन कैरा और रोवेना शोकमैन को धन्यवाद देना चाहते हैं और डॉ। चार्ल्स (जेसन) शॉइमेकर को मुरिन ल्यूकेमिया वीएलपीज़ को ईबोलावियरस ग्लाइकोप्रोटीन व्यक्त करते हैं। हम प्रयोगशाला सुरक्षा प्रशिक्षण के लिए ग्रीष्मकालीन इंटर्नशिप कार्यक्रम (एसआईपी) और साइंस एंड इंजीनियरिंग एपेंटिसशिप प्रोग्राम (एसईएपी) और डॉ कैथरीन विल्हेल्सेन की सुविधा के लिए मैज कार्ल सोफल का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics